李 貞，李少英，*，宋曉敏，馬春艷，李淑芬，賀文英，曹英華

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

乳酸菌對喹諾酮類耐藥性主動外排機制的研究

李 貞1，李少英1，*，宋曉敏1，馬春艷1，李淑芬2，賀文英3，曹英華1

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

目的：為使分離自具有民族特色和特殊功效的內(nèi)蒙古牧區(qū)馬奶及其制品中的乳酸菌更好地應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)，對乳酸菌進行耐藥性實驗并研究其中是否存在由主動外排蛋白介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥機制。方法：采用二倍稀釋法測定乳酸菌對臨床常用喹諾酮類藥物的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC），利用質(zhì)子泵抑制劑（利血平）結(jié)合熒光分光光度法檢測耐藥菌株和對照菌株對環(huán)丙沙星的攝取情況。結(jié)果：菌株HZ18、HZ28、NN3、NN4具有耐藥性并在加入利血平后菌體內(nèi)環(huán)丙沙星累積量明顯增加。結(jié)論：乳酸菌中存在主動外排蛋白介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥機制。

乳酸菌；喹諾酮類藥物；最小抑菌濃度；熒光分光光度法；主動外排

乳酸菌在人體內(nèi)具有防治腸道功能紊亂、維持腸道菌群平衡，延緩衰老，抑菌、抗感染等益生功能［1-3］。通常人們認為乳酸菌是安全的、可以放心食用的，但是作為一種進入人體的外源性活菌，在應(yīng)用過程中益生乳酸菌的安全性隱患被逐漸重視。2001年聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization，F(xiàn)AO）與世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）聯(lián)合專家委員會在《食品益生菌評價指南》中把益生乳酸菌的耐藥性問題提到十分重要的位置［4］。乳酸菌出現(xiàn)耐藥性并不可怕，可使其更好地適應(yīng)環(huán)境發(fā)揮功效；但如果耐藥基因可以在乳酸菌和致病菌之間進行傳遞，使致病菌獲得耐藥性，后果將不堪設(shè)想［5］。

近年來，喹諾酮類藥物因其良好的藥動力學(xué)和廣譜殺菌活性被廣泛用于尿路感染、呼吸道感染、腹腔感染等的治療［6-7］。但隨著臨床應(yīng)用的增多，細菌對喹諾酮類藥物的耐藥性問題逐漸凸顯。研究發(fā)現(xiàn)，主動外排蛋白介導(dǎo)的細菌胞內(nèi)藥物積聚減少在細菌對喹諾酮類藥物耐藥中發(fā)揮重要作用［8-9］。在多數(shù)細菌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)各種各樣的具有主動外排功能的蛋白質(zhì)，如大腸埃希氏菌中的AcrAB-TolC，銅綠假單胞菌中的 MexAB-OprM 和金黃色葡萄球菌中的NorA蛋白［10-12］，而對乳酸菌中主動外排蛋白的研究報道較少。

本實驗利用能量抑制劑——利血平，結(jié)合熒光分光光度法研究乳酸菌中是否存在主動外排蛋白介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥性。其理論依據(jù)為利血平可以阻斷菌株主動外排藥物過程中的能量供應(yīng)，從而減少菌株對藥物的泵出量。同時，喹諾酮類藥物在一定的激發(fā)波長下可以發(fā)射熒光，其熒光強度與藥物濃度呈函數(shù)關(guān)系。通過對比加入利血平前后菌體對藥物攝取量的變化，從而確證乳酸菌主動外排系統(tǒng)的有無。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

實驗菌株：分離自內(nèi)蒙古牧區(qū)馬奶及其制品中的10 株乳酸菌，分別為HZ9、HZ18、HZ22、HZ23、HZ28、NN、NN1、NN3、NN4、M22，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實驗室提供。其中菌株HZ9、HZ28、M22屬于堅強腸球菌（Enterococcus durans）；菌株NN、NN1屬于Enterococcus villorum；菌株NN3、NN4屬于異腸球菌（Enterococcus dispar）；菌株HZ18、HZ22、HZ23分別歸屬于棉籽糖腸球菌（Enterococcus raffinosus）、雞腸球菌（Enterococcus gilvus）、假鳥腸球菌（Enterococcus pseudoavium）。

標準菌株：植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum CICC6238）購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

質(zhì)控菌株：糞腸球菌（Enterococcus faecalis CICC23658）購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；大腸埃希氏菌（Escherichia coli ATCC 25922）購于美國模式菌種保藏中心。

1.1.2 試劑與藥品

MRS（man rogosa sharpe）肉湯培養(yǎng)基、雙料MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基按照參考文獻［13］中的方法配制；CAMHB（cation adjusted mueller-hinton broth）肉湯培養(yǎng)基 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；脫脂乳培養(yǎng)基（100 mL蒸餾水，10 g脫脂乳粉，110 ℃，高壓滅菌10 min）、TPY（trypticase peptone yeast broth）液體培養(yǎng)基、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS；50 mmol/L） 賽默飛世爾科技公司；鹽酸甘氨酸緩沖液（0.1mol/L pH 3.0） 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實驗室自制。

抗生素標準品：環(huán)丙沙星（（ciprofloxacin），生產(chǎn)批號130451-201203）、諾氟沙星（（norfloxacin），生產(chǎn)批號130450-201206） 中國食品藥品檢定研究院；利血平（（reserpine），生產(chǎn)批號V900834） 美國Sigma公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

RF-5301PC熒光分光光度計 日本島津公司；分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；SX-500全自動高壓蒸汽滅菌鍋 日本Tomy公司；OLYMPUS BX50型光學(xué)顯微鏡 日本Olympus公司；TGL-16G高速冷凍離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；FLC-3型超凈工作臺哈爾濱市東聯(lián)公司；SPX-1500型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海博訊實業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 藥敏實驗最適培養(yǎng)基的選擇

選取3 株實驗菌株HZ9、NN1、M22和1 株質(zhì)控菌株Enterococcus faecalis，將其凍干菌粉接種于脫脂乳培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h后，于4℃進行穿刺保存，同時將每株菌分別接種于MRS液體培養(yǎng)基和CAMHB肉湯培養(yǎng)基。37 ℃條件下活化24 h至第2、3代時，觀察菌株生長情況并在600 nm波長處測定光密度（optical density，OD）值，依照GB 4789.35—2010《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 乳酸菌檢驗》進行活菌計數(shù)，并記錄實驗結(jié)果。

1.2.2 供試菌液的制備

在無菌條件下將實驗菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)3 代，并用空培養(yǎng)基稀釋菌液至活菌數(shù)為107CFU/mL。按體積分數(shù)為6%的接種量接種于雙料MRS液體培養(yǎng)基中混勻，待用［14］。

1.2.3 實驗菌株對喹諾酮類藥物耐藥性的測定

采用試管二倍稀釋法將環(huán)丙沙星和諾氟沙星溶液的質(zhì)量濃度稀釋為1、2、4、8、16、32、64、128、256、512、1 024 μg/mL。將供試菌液和藥物等體積混合，同時設(shè)置藥物空白、菌株空白和培養(yǎng)基空白對照，并置于37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h后，釆用目視比濁法觀察，并以美國臨床實驗室標準化協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）（M100-S26）解釋標準（表1）為依據(jù)記錄結(jié)果。每實驗重復(fù)3 次。參照CLSI（M100-S26）藥敏解釋標準中腸球菌屬最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）解釋標準對結(jié)果進行判讀。

1.2.4 實驗菌株主動外排系統(tǒng)的測定

以環(huán)丙沙星為代表，利用質(zhì)子泵抑制劑——利血平，結(jié)合熒光分光光度法檢測耐藥菌株和對照菌株對環(huán)丙沙星的攝取情況。通過對比利血平存在與否的情況下，菌體對藥物攝取量的變化，從而確證實驗菌株主動外排系統(tǒng)是否存在。

標準曲線的繪制：利用熒光分光光度計在251 nm/583 nm波長處測定不同質(zhì)量濃度環(huán)丙沙星的熒光強度并繪制標準曲線。

供試菌液的制備：將實驗菌株分別接種于TPY液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)至活菌數(shù)達107CFU/mL，5 000 r/min、4 ℃ 離心 20 min后，收集菌體，PBS緩沖液洗滌3 次。最后將菌體分為2 份重懸于PBS中，使菌體質(zhì)量濃度達到40 mg/mL，37 ℃振蕩溫浴10 min［15］。

加抑制劑前環(huán)丙沙星熒光強度的測定：向其中一份供試菌液加環(huán)丙沙星，使其最終質(zhì)量濃度達1 000 μg/mL。分別在加環(huán)丙沙星后的0.5、1、3、5、7、9、12、15、25 min取樣，每管取0.5 mL到預(yù)冷的3 mL PBS緩沖液中，4 ℃、4 000r/min離心8 min，棄去上清液。同樣條件下洗滌3 次并沉淀菌體。沉淀物加鹽酸-甘氨酸緩沖液4 mL，26 ℃水浴2 h，離心沉淀，取上清液于251 nm/583 nm波長處測定熒光強度。

加抑制劑后環(huán)丙沙星熒光強度的測定：另一份供試菌液在加環(huán)丙沙星前加利血平，使其最終質(zhì)量濃度為50 μg/mL。同樣條件下測定熒光強度。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基的選擇

3 株實驗菌株在MRS培養(yǎng)基中均長勢旺盛，培養(yǎng)3 代后在試管底部有大量白色菌泥沉淀，振蕩后試管明顯混濁；而在CAMHB肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)的實驗菌株均長勢微弱，試管底部無菌泥出現(xiàn)，混勻后與空白培養(yǎng)基對比無明顯差別。實驗菌株在MRS培養(yǎng)基和CAMHB培養(yǎng)基中的OD600nm值及對應(yīng)活菌數(shù)見表2。

由表2可知，菌株Enterococcus faecalis在2 種培養(yǎng)基中生長情況差別不大，活菌數(shù)均大于108CFU/mL。實驗菌株在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的活菌數(shù)均大于107CFU/mL，符合CLSI在藥敏實驗中對活菌數(shù)的要求（106～108CFU/mL）［16］，而在CAMHB培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌株其活菌數(shù)均小于106CFU/mL，無法滿足CLSI對藥敏實驗的要求。

2.2 實驗菌株的最小抑菌質(zhì)量濃度

由表3可知，實驗菌株HZ18、HZ23、HZ28、NN、NN3、NN4對諾氟沙星和環(huán)丙沙星的MIC值均大于512 μg/mL，此值遠大于諾氟沙星和環(huán)丙沙星耐藥標準的界限質(zhì)量濃度。菌株HZ9、NN1、M22、Lactobacillus plantarum對諾氟沙星和環(huán)丙沙星的MIC值也均高于CLSI耐藥標準，且對諾氟沙星的MIC值均大于對環(huán)丙沙星的MIC值，其原因可能是環(huán)丙沙星是合成的第3 代喹諾酮類藥物，其臨床應(yīng)用時間較諾氟沙星短。實驗菌株如此高的MIC值可能是由于近年來喹諾酮類藥物應(yīng)用的增多，導(dǎo)致許多乳酸菌對喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥性。

2.3 實驗菌株對2 種喹諾酮類藥物的敏感性判定

由表3可知，質(zhì)控菌株Escherichia coli對諾氟沙星和環(huán)丙沙星均表現(xiàn)為敏感，而菌株Enterococcus faecalis對諾氟沙星表現(xiàn)為敏感，對環(huán)丙沙星表現(xiàn)為中介。10 株實驗菌株經(jīng)MIC法檢測對諾氟沙星和環(huán)丙沙星表現(xiàn)為不同程度的耐藥，耐藥率高達100%。其中6 株乳酸菌的MIC值均高于512 μg/mL，屬于高度耐藥。可見乳酸菌對喹諾酮類藥物的耐藥性較為普遍，這與細菌對喹諾酮類藥物耐藥性呈上升趨勢結(jié)論一致［17-18］。

2.4 主動外排系統(tǒng)證實實驗結(jié)果

環(huán)丙沙星質(zhì)量濃度（x，μg/mL）與熒光強度（y）的回歸方程為：y=-0.001 7x3-0.069 1x2+5.400 7x+ 0.672 9（R2=0.998 7），根據(jù)回歸方程計算各菌株對環(huán)丙沙星的攝入量。

由表4可知，對照菌株Enterococcus faecalis及實驗菌株HZ9、HZ22、HZ23、NN、NN1在加入利血平前后菌體內(nèi)環(huán)丙沙星累積量無明顯變化。而耐藥菌株HZ18、HZ28、NN3、NN4、標準菌株Lactobacillus plantarum及質(zhì)控菌株Escherichia coli在加入利血平后菌體內(nèi)藥物累積量明顯高于不加抑制劑組。以25 min為例，菌株HZ18、HZ28、NN3、NN4加入抑制劑后菌體內(nèi)藥物累積量分別增加768、338、494、592 ng/mg，增加百分比分別為26.4%、7.6%、9.8%、12.7%。另外，由表4可知，各菌株菌體內(nèi)藥物累積量存在一個隨時間延長，先緩慢增長，在9～12 min時快速增長，然后隨時間又略降低的過程。值得注意的是，經(jīng)最小抑菌濃度實驗判定為高度耐藥的菌株HZ18、HZ28、NN3、NN4，在加入利血平后其菌體內(nèi)環(huán)丙沙星的累積量明顯高于其他菌株。

3 結(jié) 論

CLSI的抗微生物藥物敏感性實驗操作方法和判斷標準是國內(nèi)臨床細菌檢驗遵循的標準。CLSI是針對臨床致病菌設(shè)立的，它要求腸球菌和腸桿菌在進行藥物敏感性實驗時選用CAMHB培養(yǎng)基。但對于乳酸菌來說，CAMHB培養(yǎng)基營養(yǎng)成分過于簡單，乳酸菌在其中不能很好的生長，活菌數(shù)達不到進行藥敏實驗的要求（106～108CFU/mL）。另外，研究者Danielsen等［19］發(fā)現(xiàn)MRS培養(yǎng)基的成分對抗生素活性并無明顯影響，所以本實驗選擇MRS培養(yǎng)基進行喹諾酮類藥物敏感性實驗。這與2007年Hummel等［20］在研究作為發(fā)酵劑的乳酸菌的耐藥性時所選用的培養(yǎng)基一致。

利血平是一種吲哚生物堿，常用作細菌主動外排作用的能量抑制劑。已有文獻報道，利血平可增加某些耐藥菌株對喹諾酮類藥物的敏感性。Markham等［21-23］于1996年和1999年先后證實了利血平可抑制金黃色葡萄球菌對諾氟沙星的誘導(dǎo)耐藥以及肺炎鏈球菌對環(huán)丙沙星的耐藥性。Jonas等［24］于2001年證實了利血平可以抑制腸球菌對喹諾酮類藥物的外排作用。

本實驗中對照菌株Enterococcus faecalis及實驗菌株HZ9、HZ22、HZ23、NN、NN1在加入利血平前后菌體內(nèi)環(huán)丙沙星累積量無明顯變化。而耐藥菌株HZ18、HZ28、NN3、NN4、標準菌株Lactobacillus plantarum及質(zhì)控菌株Escherichia coli在加入利血平后菌體內(nèi)藥物累積量明顯增加。這可能是由于主動外排作用在這些菌株的耐藥機制中發(fā)揮主要作用，導(dǎo)致對喹諾酮類藥物的外排增加。但并非所有的耐藥菌株藥物累積量都有所增加，有的還略有降低，推測在這些菌株中可能同時存在其他耐藥機制，如拓撲異構(gòu)酶基因gyrA和parC發(fā)生突變。探討這些乳酸菌的耐藥機制及其轉(zhuǎn)移性將為這些特性優(yōu)良的菌株在發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用提供安全方面的數(shù)據(jù)。

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Corroboration of Quinolone Resistance Mediated by Active Efflux System in Lactic Acid Bacteria

LI Zhen1， LI Shaoying1，*， SONG Xiaomin1， MA Chunyan1， LI Shufen2， HE Wenying3， CAO Yinghua1
（1. College of Food Science and Engineering， Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot 010018， China；2. College of Life Sciences， Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot 010018， China；3. College of Science， Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot 010018， China）

Purpose： In this study， lactic acid bacteria （LAB） were separated from horse milk and horse milk products with national characteristics and special functions in pastoral areas of Inner Mongolia. In order to ensure better application of the isolated strains in the fermentation industry， it is necessary to test their drug resistance and explore if LAB possess an active efflux system mediating quinolone resistance. Methods： Double dilution method was used to determine the minimum inhibitory concentration （MIC） of quinolone. The proton pump inhibitor reserpine was combined with fluorescence spectrophotometry to detect the ciprofloxacin intakes of drug-resistant strains and control strains. Results： The accumulation of ciprofloxacin increased significantly in drug-resistant strains HZ18， HZ28， NN3 and NN4 after adding reserpine. Conclusion： Lactic acid bacteria may possess an active efflux system mediating quinolone resistance.

lactic acid bacteria； quinolone； minimum inhibitory concentration （MIC）； fluorescence spectrophotometry；active efflux system

10.7506/spkx1002-6630-201609028

R965

A

1002-6630（2016）09-0150-05

李貞， 李少英， 宋曉敏， 等. 乳酸菌對喹諾酮類耐藥性主動外排機制的研究［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（9）： 150-154. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609028. http：//www.spkx.net.cn

LI Zhen， LI Shaoying， SONG Xiaomin， et al. Corroboration of quinolone resistance mediated by active efflux system in lactic acid bacteria［J］. Food Science， 2016， 37（9）： 150-154. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609028. http：//www.spkx.net.cn

2015-04-29

國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項目（31060014）；內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)?？茖W(xué)研究項目（NJ09059）

李貞（1990—），女，碩士研究生，研究方向為食品微生物。E-mail：15248045663@163.com

*通信作者：李少英（1961—），女，教授，博士，研究方向為食品質(zhì)量與安全。E-mail：nmglshy@126.com