倪志華，張玉明*，鄧傳懷周艷芬

（1.河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002；2.河北省生物工程技術(shù)研究中心，河北 保定 071002）

熒光光譜法研究桿菌肽與溶菌酶的相互作用

倪志華1，2，張玉明1，*，鄧傳懷1，周艷芬1，2

（1.河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002；2.河北省生物工程技術(shù)研究中心，河北 保定 071002）

利用熒光光譜法研究了桿菌肽與溶菌酶的相互作用。結(jié)果表明：桿菌肽能使溶菌酶的內(nèi)源熒光發(fā)生猝滅。在不同溫度下研究桿菌肽對(duì)溶菌酶的熒光猝滅作用，證明熒光猝滅機(jī)理屬于二者形成復(fù)合物所引起的靜態(tài)猝滅。利用Stern-Volmer方程處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)桿菌肽與溶菌酶具有1 個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，并計(jì)算得到了不同溫度下桿菌肽與溶菌酶的結(jié)合常數(shù)（KA）：3.60×105（298 K）、1.90×105（308 K）、4.51×104L/mol（318 K）。通過計(jì)算熱力學(xué)參數(shù)，可知桿菌肽與溶菌酶的相互作用是一個(gè)吉布斯自由能降低的自發(fā)過程，且二者之間的主要作用力類型是靜電作用。三維熒光光譜實(shí)驗(yàn)顯示，桿菌肽的加入引起溶菌酶構(gòu)象的變化，表現(xiàn)為蛋白質(zhì)內(nèi)部色氨酸殘基所處微環(huán)境的疏水性降低。

桿菌肽；溶菌酶；相互作用；熒光光譜

桿菌肽是一種應(yīng)用廣泛的畜禽專用抗生素飼料添加劑，對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性病原菌、放線菌以及部分革蘭氏陰性菌均有較強(qiáng)抑制作用［1］。并且，桿菌肽還具有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、提高機(jī)體免疫能力方面的作用，被譽(yù)為“綠色飼料添加劑”。隨著我國(guó)畜牧養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，桿菌肽的市場(chǎng)需求與日俱增。溶菌酶是一種廣泛分布于生物體內(nèi)的小分子堿性蛋白，具有抗菌、消炎、抗病毒等諸多的生物功能［2］。作為血漿中的小分子蛋白，溶菌酶在白細(xì)胞中含量高，是生物體內(nèi)不可或缺的非特異性體液免疫因子。并且，溶菌酶能夠作為一種選擇性載體蛋白和很多的外源和內(nèi)源性物質(zhì)結(jié)合，從而行使其生物學(xué)功能［3］。因此，溶菌酶是一種用來研究小分子物質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的良好模型［4-6］。當(dāng)前對(duì)桿菌肽的研究大多集中于發(fā)酵生產(chǎn)和畜牧養(yǎng)殖應(yīng)用方面，對(duì)其與生物大分子相互作用方面的研究未見報(bào)道。因此，開展桿菌肽與溶菌酶的相互作用研究很有意義。

光譜法是研究蛋白質(zhì)與各種有機(jī)小分子相互作用的重要手段［7-8］。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用熒光光譜法研究溶菌酶與桿菌肽的作用，重點(diǎn)考察二者相互作用的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)以及結(jié)合熱力學(xué)參數(shù)，并利用三維熒光光譜研究桿菌肽對(duì)溶菌酶結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桿菌肽 上海金穗生物科技有限公司；溶菌酶北京索萊寶科技有限公司；磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉西隴化工股份有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

1.3 方法

以0.1 mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）為溶劑配制1.0×10-3mol/L的溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)溶液備用，桿菌肽使用超純水配成1.0×10-3mol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。準(zhǔn)確移取一定量的桿菌肽標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL具塞玻璃試管中，再加入溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)溶液，以0.1 mol/L pH 7.4 PBS定容，使體系中溶菌酶濃度達(dá)到1.0×10-3mol/L，然后分別在298、308、318 K條件下恒溫1 h。在激發(fā)和發(fā)射光柵狹縫均為5 nm，激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm條件下，掃描一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)溶菌酶和溶菌酶-桿菌肽的熒光光譜。在激發(fā)波長(zhǎng)為250～400 nm和發(fā)射波長(zhǎng)為250～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行三維熒光掃描，比較溶菌酶與桿菌肽-溶菌酶體系的熒光等高線圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光猝滅光譜

蛋白質(zhì)的熒光特性主要取決于結(jié)構(gòu)中的3 種氨基酸，即色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）。上述3 種氨基酸的熒光強(qiáng)度比通常為100∶9∶0.5，即大多數(shù)情況下可以認(rèn)為蛋白質(zhì)的熒光主要來自色氨酸殘基的貢獻(xiàn)［9-10］。溶菌酶是由129 個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，分子內(nèi)部含有2 個(gè)色氨酸殘基［11］，因而在280 nm激發(fā)波長(zhǎng)處能發(fā)射較強(qiáng)的內(nèi)源熒光。

由圖1可知，激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm時(shí)，不同溫度下溶菌酶的最大熒光強(qiáng)度位置分別為335.4（298 K）、335.3 nm（308 K）和335.6 nm（318 K）。結(jié)果說明，在不同溫度下溶菌酶的最大熒光強(qiáng)度位置變化不大，但是其最大熒光強(qiáng)度的絕對(duì)值呈現(xiàn)隨著溫度升高而降低的趨勢(shì)。加入桿菌肽后，不同溫度下溶菌酶的內(nèi)源性熒光強(qiáng)度均出現(xiàn)逐漸降低現(xiàn)象，溶菌酶的熒光明顯被猝滅，這說明桿菌肽與溶菌酶發(fā)生了相互作用。并且，桿菌肽的加入使溶菌酶最大熒光強(qiáng)度位置發(fā)生變化：當(dāng)加入桿菌肽濃度為50 nmol/L時(shí)溶菌酶在298、308、318 K的最大熒光強(qiáng)度位置變?yōu)?50.9、351.6、351.3 nm，分別紅移了15.5、16.3、15.7 nm。這說明加入桿菌肽后，溶菌酶中Trp殘基的微環(huán)境發(fā)生了變化，使其變得更加親水，從而猝滅了溶菌酶所發(fā)射的內(nèi)源熒光，這也印證了桿菌肽與溶菌酶發(fā)生了相互作用。

2.2 桿菌肽對(duì)溶菌酶的熒光猝滅機(jī)理

熒光猝滅主要分為動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅［12］，動(dòng)態(tài)猝滅是熒光體與猝滅劑之間因相互碰撞而使熒光體的熒光被猝滅，溫度升高可增加分子碰撞的機(jī)會(huì)，能夠提高猝滅效率［13］；而靜態(tài)猝滅是熒光體與猝滅劑之間形成了不發(fā)熒光的復(fù)合物引起的，溫度升高將引起配合物的穩(wěn)定度下降，從而減小靜態(tài)猝滅的程度?？梢允褂肧tern-Volmer方程分析熒光猝滅數(shù)據(jù)［14］。

式中：F0和F分別表示不加入和加入猝滅劑時(shí)體系的相對(duì)熒光強(qiáng)度；［Q］為猝滅劑的濃度/（μmol/L）；K在靜態(tài)猝滅時(shí)為配合物的形成常數(shù)/（L/mol），在動(dòng)態(tài)猝滅時(shí)為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)Ksv/（L/mol）。

路燈數(shù)據(jù)的上報(bào)分為兩大類：主動(dòng)上報(bào)，觸發(fā)型上報(bào)。其中主動(dòng)型包括定時(shí)路燈狀態(tài)上報(bào)，心跳上報(bào)用以鏈路?；睿挥|發(fā)型上報(bào)為事件觸發(fā)弄的，如主動(dòng)查詢，遠(yuǎn)程控制等。

式中：Kq為熒光猝滅速率常數(shù)/（L/（mol·s））；T0為不存在猝滅劑時(shí)熒光物質(zhì)的平均壽命/s，一般為10-8s。由式（1）作圖，得到Stern-Volmer猝滅曲線，結(jié)果如圖2所示。根據(jù)曲線斜率計(jì)算得到桿菌肽和溶菌酶之間相互作用的熒光猝滅速率常數(shù)Kq及猝滅常數(shù)Ksv，結(jié)果見表1。

由圖2可知，F(xiàn)0/F對(duì)［Q］線性良好，相關(guān)系數(shù)r值都大于0.99，表明桿菌肽與溶菌酶之間相互作用時(shí)只存在一種猝滅機(jī)制。由圖2中直線的斜率可求出Ksv值，動(dòng)態(tài)和靜態(tài)猝滅可根據(jù)猝滅常數(shù)Ksv隨溫度變化關(guān)系來判斷。由表1可知，隨著溫度的升高，溶菌酶的猝滅曲線斜率下降，Ksv值降低，說明桿菌肽對(duì)溶菌酶熒光的猝滅作用隨溫度升高而降低，符合靜態(tài)猝滅規(guī)律［11］。桿菌肽對(duì)溶菌酶的Kq值在1012數(shù)量級(jí)，大于各類猝滅劑對(duì)生物大分子最大擴(kuò)散控制的碰撞猝滅速率常數(shù)2.0×1010L/（mol·s）［15］，也說明桿菌肽對(duì)溶菌酶的熒光猝滅作用不是動(dòng)態(tài)猝滅。

2.3 桿菌肽與溶菌酶的結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

對(duì)于靜態(tài)猝滅過程，蛋白質(zhì)與小分子的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)可由式（3）導(dǎo)出［16］。

式中：F0和F分別表示不加入和加入猝滅劑時(shí)體系的相對(duì)熒光強(qiáng)度；［Q］為猝滅劑的濃度/（μmol/L）；KA和n分別為桿菌肽與溶菌酶的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。

以不同溫度下桿菌肽對(duì)溶菌酶的熒光猝滅結(jié)果，將lg［（F0-F）/F］對(duì)lg［Q］作圖，并進(jìn)行線性回歸。從圖3中回歸直線的斜率和截距可求得溶菌酶與桿菌肽的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n和結(jié)合常數(shù)KA。如表2所示，溫度分別為298、308、318 K時(shí)，lg［（F0-F）/F］對(duì)lg［Q］的線性關(guān)系良好，r值都達(dá)到0.99以上。桿菌肽與溶菌酶的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)均接近于1，表明二者近似的以1∶1形式結(jié)合而生成復(fù)合物，溫度對(duì)二者之間結(jié)合比例影響不大。本研究中，桿菌肽與溶菌酶在各溫度的結(jié)合常數(shù)KA值均達(dá)到或超過104數(shù)量級(jí)，表明二者之間的結(jié)合作用較強(qiáng)。

2.4 桿菌肽與溶菌酶結(jié)合熱力學(xué)參數(shù)及結(jié)合力類型

小分子物質(zhì)和蛋白質(zhì)之間的相互作用力主要有疏水作用力、氫鍵、范德華力和靜電引力等［17］。在溫度變化范圍不大時(shí)，可以近似認(rèn)為作用過程的焓變?chǔ)是一個(gè)常數(shù)。根據(jù)公式（4）～（6），可分別求得焓變?chǔ)、熵變?chǔ)和生成自由能變?chǔ)。Ross等［18］總結(jié)了小分子間與生物大分子反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)與主要作用力類型的關(guān)系，即當(dāng)ΔH＞0、ΔS＞0為典型的疏水作用力；ΔH＜0、ΔS＜0為氫鍵和范德華力；當(dāng)ΔH＜0、ΔS＞0時(shí)，主要存在靜電作用。根據(jù)熱力學(xué)公式（4）、（5）、（6）及不同溫度下的結(jié)合常數(shù)，可求得相應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)（表3）。

由表3可知，桿菌肽與溶菌酶相互作用時(shí)熱力學(xué)參數(shù)ΔH＜0、ΔS＞0，可以認(rèn)為二者之間的作用力主要為靜電相互作用。反應(yīng)的自由能變?chǔ)＜0，說明桿菌肽與溶菌酶的相互作用是自發(fā)進(jìn)行的。反應(yīng)的ΔH＜0，說明反應(yīng)為放熱反應(yīng)。并且，升高溫度將不利于反應(yīng)的進(jìn)行，這也符合前文所述的桿菌肽對(duì)溶菌酶的猝滅機(jī)制為靜態(tài)猝滅。

2.5 桿菌肽與溶菌酶的三維熒光光譜

三維熒光光譜是以激發(fā)波長(zhǎng)、發(fā)射波長(zhǎng)和熒光強(qiáng)度3 個(gè)參數(shù)分別為坐標(biāo)的熒光矩陣光譜［19-20］。同時(shí)，三維圖譜可用強(qiáng)度等高線代替以更為直觀地描述被測(cè)組分的熒光信息，是一種有價(jià)值的光譜指紋技術(shù)［21］。研究溶液狀態(tài)下蛋白質(zhì)-藥物小分子相互作用中蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化時(shí)，三維熒光光譜能提供比常規(guī)熒光光譜更完整的光譜信息。本實(shí)驗(yàn)在激發(fā)波長(zhǎng)250～400 nm和發(fā)射波長(zhǎng)250～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行三維熒光掃描，得到溶菌酶和桿菌肽-溶菌酶復(fù)合物的熒光等高線圖（圖4）。其中，使用的溶菌酶和桿菌肽濃度分別為100、20 μmol/L，實(shí)驗(yàn)溫度為298 K。

從峰的類別看，圖4a、b中都存在兩條“鉛筆”形紋線，它們的共同特征是激發(fā)波長(zhǎng)（λex）等同于發(fā)射波長(zhǎng)（λem），是典型的瑞利散射峰［22］。并且，圖4a、b中瑞利散射線左上方λex=300 nm左右都存在“指紋”形紋線，λem分別是340 nm和350 nm左右。上述“指紋”形紋線符合λex＜λem的規(guī)律，是熒光峰的典型特征。從峰的位置看，加入桿菌肽后，溶菌酶的瑞利散射峰起始位置及熒光峰位置均無顯著變化。從峰的強(qiáng)度看，圖4b中的“鉛筆”形和“指紋”形紋線變得稀疏，“指紋”形紋線的變化趨勢(shì)尤為明顯。也就是說，加入桿菌肽后瑞利散射峰和熒光峰的相對(duì)強(qiáng)度均有不同程度的降低。

溶菌酶是橢圓形的分子，在其表面有一個(gè)深陷而狹長(zhǎng)的凹槽。它的活性中心位于溶菌酶分子表面葡萄糖（Glu）35、天冬氨酸（Asp）52和Trp 62兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的溝槽內(nèi)。大多數(shù)的非極性和極性側(cè)鏈分別埋藏在分子內(nèi)部和分布在分子表面上［23］。據(jù)此推斷出桿菌肽可能在溶菌酶的非極性凹槽內(nèi)與之結(jié)合發(fā)生作用，誘導(dǎo)了溶菌酶構(gòu)象的變化。分析認(rèn)為，桿菌肽的加入使水溶液中溶菌酶疏水腔體內(nèi)微環(huán)境的極性和疏水效應(yīng)發(fā)生改變，從而導(dǎo)致溶菌酶構(gòu)象的變化［24］，表明溶菌酶和桿菌肽發(fā)生反應(yīng)而生成了一種新的復(fù)合物，這也印證了桿菌肽對(duì)溶菌酶的熒光猝滅機(jī)制為靜態(tài)猝滅。

3 結(jié) 論

利用熒光光譜法研究了桿菌肽與溶菌酶的相互作用。桿菌肽對(duì)溶菌酶的內(nèi)源熒光具有較強(qiáng)的猝滅作用，原因是桿菌肽與溶菌酶分子發(fā)生結(jié)合形成復(fù)合物。測(cè)定了不同溫度下桿菌肽與溶菌酶的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)和熱力學(xué)參數(shù)，結(jié)果表明桿菌肽對(duì)于溶菌酶的熒光猝滅機(jī)制為靜態(tài)猝滅，二者的結(jié)合主要是基于靜電作用，大約形成1 個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。三維熒光光譜研究表明，桿菌肽和溶菌酶之間結(jié)合導(dǎo)致了蛋白質(zhì)分子內(nèi)部疏水微環(huán)境極性的改變，進(jìn)而導(dǎo)致了溶菌酶構(gòu)象的變化。上述結(jié)果均說明溶菌酶是桿菌肽在機(jī)體內(nèi)的有效載體。

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Fluorescence Spectroscopic Study of the Interaction of Lysozyme with Bacitracin

NI Zhihua1，2， ZHANG Yuming1，*， DENG Chuanhuai1， ZHOU Yanfen1，2
（1. College of Life Sciences， Hebei University， Baoding 071002， China；2. Research Center of Bioengineering of Hebei Province， Baoding 071002， China）

The interactions between bacitracin and lysozyme were studied by fluorescence spectroscopy. The results showed that the intrinsic fluorescence of lysozyme could be quenched by bacitracin. The fluorescence quenching of lysozyme was analyzed at different temperatures. The quenching mechanism was accomplished in a static manner by forming a bacitracin-lysozyme complex. The binding parameters were determined according to Stern-Volmer equation， and the thermodynamic parameters were calculated. The results showed that there was only one binding site between bacitracin and lysozyme. The binding constants （KA） between bacitracin and lysozyme at different temperatures were 3.60 × 105（298 K），1.90 × 105（308 K）， and 4.51 × 104L/mol （318 K）， respectively. Thermodynamic analysis indicated that the interaction process was spontaneous， and electrostatic force might be primarily responsible for the interaction. In addition， the effect of bacitracin on the conformation of lysozyme was analyzed by three-dimensional fluorescence spectroscopy. The result indicated that the polarity of the microenvironment around Trp residues decreased.

bacitracin； lysozyme； interaction； fluorescence spectroscopy

10.7506/spkx1002-6630-201609026

TS201.2

A

1002-6630（2016）09-0139-05

倪志華， 張玉明， 鄧傳懷， 等. 熒光光譜法研究桿菌肽與溶菌酶的相互作用［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（9）： 139-143. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609026. http：//www.spkx.net.cn

NI Zhihua， ZHANG Yuming， DENG Chuanhuai， et al. Fluorescence spectroscopic study of the interaction of lysozyme with bacitracin［J］. Food Science， 2016， 37（9）： 139-143. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609026. http：//www.spkx.net.cn

2015-07-30

保定市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展指導(dǎo)計(jì)劃項(xiàng)目（15ZN001）；河北省高等學(xué)校科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（QN2015174）；河北大學(xué)中西部提升綜合實(shí)力專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目

倪志華（1979—），女，講師，碩士，研究方向?yàn)閼?yīng)用生物化學(xué)。E-mail：nizhihua@hbu.edu.cn

*通信作者：張玉明（1979—），男，講師，博士，研究方向?yàn)樯锘?。E-mail：zhangyuming@hbu.edu.cn