劉 洋，朱涵予，許丹云，張麗姣，馬愛(ài)民*

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070）

銀耳芽孢總蛋白提取方法的建立

劉 洋，朱涵予，許丹云，張麗姣，馬愛(ài)民*

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070）

采用超聲波與高壓均質(zhì)破碎細(xì)胞，通過(guò)顯微觀察細(xì)胞破碎效果、Bradford法測(cè)定蛋白含量并進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，比較了三羥甲基氨基甲烷（tris（hydroxymethyl）methyl aminomethane，Tris）-飽和酚法、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）-丙酮沉淀法及Tris-飽和酚結(jié)合TCA-丙酮沉淀法提取銀耳芽孢總蛋白的效果。結(jié)果表明：高壓均質(zhì)的細(xì)胞破碎效果優(yōu)于超聲波，3 種方法所得到的銀耳芽孢總蛋白質(zhì)量濃度分別為2.33、1.26、1.02 mg/mL，且Tris-飽和酚法經(jīng)傳統(tǒng)考馬斯亮藍(lán)染色法染色所得電泳條帶亮度及清晰度均優(yōu)于其他兩種方法。因此，Tris-飽和酚法是進(jìn)行銀耳芽孢總蛋白提取的一種有效方法。

銀耳；芽孢；蛋白提取方法

銀耳（Tremella fuciformis），又名白木耳，是一種著名的藥食兩用真菌，富含多糖、蛋白質(zhì)、維生素及無(wú)機(jī)鹽，被譽(yù)為“菌中之冠”［1］。在醫(yī)藥領(lǐng)域，銀耳多糖具有提高免疫、抗腫瘤、抗氧化及抗衰老等生理功能，如減輕化療和放療的毒副反應(yīng)，增強(qiáng)療效，提高癌癥患者的生存質(zhì)量及延長(zhǎng)生存期［2-3］；銀耳多糖中的特定成分在臨床上可與其他藥物配伍用于治療放療、化療或其他原因引起的白細(xì)胞減少癥，亦可作為放射損傷的輔助治療；銀耳酚酸具有抗氧化及抗炎作用等生理功能［4］。在食品加工領(lǐng)域，銀耳可被添加到食品中以改善其感官特性及提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，如Cha Minha等［5］在肉餡的制作中添加銀耳子實(shí)體既能降低油膩度又能提高肉餡的持油性；Tseng等［6］在制作面包時(shí)用銀耳子實(shí)體代替5%的小麥粉，其感官特性可被接受且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值得到了提高；Ulziijargal等［7］進(jìn)一步用銀耳菌絲體代替子實(shí)體制作面包，也能取得同樣的效果。

長(zhǎng)期以來(lái)對(duì)于銀耳生理功能的研究主要集中在銀耳多糖及酚酸等方面，而蛋白質(zhì)作為銀耳中第二大類(lèi)營(yíng)養(yǎng)成分，對(duì)其生理功能的研究較少［8］。銀耳總蛋白的有效提取是進(jìn)行銀耳蛋白質(zhì)生理功能研究的重要前提，不同食用菌材料的最適提取方法不同［9］，黃碧芳等［10］在對(duì)虎奶菇菌絲體自溶蛋白質(zhì)制備方法的研究中，比較了超聲波和液氮研磨兩種細(xì)胞破碎方法，發(fā)現(xiàn)液氮研磨得到的粗蛋白和純蛋白產(chǎn)量均高于超聲波法；劉靖宇［11］在草菇菌絲及子實(shí)體總蛋白的提取中采用了三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）-丙酮沉淀法；劉曉云等［12］在靈芝子實(shí)體原基總蛋白質(zhì)的提取中，比較了三羥甲基氨基甲烷（tris（hydroxymethyl）methyl aminomethane，Tris）-飽和酚法和TCA-丙酮沉淀法的提取效果，而有關(guān)銀耳總蛋白的提取目前卻鮮有報(bào)道。

銀耳芽孢是銀耳擔(dān)孢子產(chǎn)生的酵母狀分生孢子，俗稱(chēng)“芽孢”（yeast-like conidia，YLC），比菌絲體及子實(shí)體更易獲得［13］。本研究以銀耳芽孢為材料，在液氮研磨的基礎(chǔ)上分別采用超聲波與高壓均質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞破碎，比較Tris-飽和酚法、TCA-丙酮沉淀法及Tris-飽和酚結(jié)合TCA-丙酮沉淀法3 種方法提取銀耳芽孢總蛋白的效果，旨在建立一種有效的銀耳芽孢總蛋白提取方法，為后續(xù)銀耳蛋白質(zhì)生理功能的探索、蛋白質(zhì)組學(xué)的研究及在食品加工中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

銀耳3號(hào)芽孢 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖肉湯（potato dextrose broth，PDB）培養(yǎng)基 青島日水生物技術(shù)有限公司。

硫脲、脲、TCA、甲醇、乙醇、乙酸銨、Tris、HCl、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、冰醋酸、硝酸銀 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；3-［（3-膽固醇氨丙基）二甲基氨基］-1-丙磺酸（3-［（3-cholamidopropyl）dimethylammonio］propanesulfonate，CHAPS）、二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT）、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF） 合肥Biosharp公司；丙酮 天津市天力化學(xué)試劑有限公司；載體兩性電解質(zhì) 北京酷來(lái)搏科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)R-250、Tris-飽和酚 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

臺(tái)式冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckman公司；AH-100B高壓均質(zhì)機(jī) 安拓思納米技術(shù)（蘇州）有限公司；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；UV-1800紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本Shimadzu公司；超低溫冰箱 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；顯微成像系統(tǒng) 德國(guó)Leica公司。

1.3 方法

1.3.1 銀耳芽孢的培養(yǎng)［14］

傳統(tǒng)制造業(yè)需要積極適應(yīng)數(shù)字化轉(zhuǎn)型所帶來(lái)的變革，用發(fā)展的眼光看待變革，做好充分準(zhǔn)備，找準(zhǔn)目標(biāo)分步實(shí)施，為數(shù)字化轉(zhuǎn)型賦能。

將保藏的銀耳3號(hào)芽孢菌種轉(zhuǎn)管于PDA培養(yǎng)基上，活化3～6 d，接入裝有100 mL PDB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中。于25 ℃搖床上120 r/min培養(yǎng)3～5 d，10 000 r/min離心20 min，蒸餾水沖洗，再次離心，冷凍干燥后保存于-20 ℃冰箱，備用。

1.3.2 銀耳芽孢總蛋白的提取

1.3.2.1 Tris-飽和酚法［12，15-16］

稱(chēng)取0.1 g銀耳芽孢，液氮研磨后，加5 mL抽提液（0.1 mol/L pH 8.8 Tris-HCl、0.01 mol/L EDTA、0.01 mol/L PMSF、0.05 mol/L DTT，下同）。經(jīng)195 W、10 min或120 MPa、5 min破碎后，4 ℃、12 000 r/min條件下離心30 min，保留上清液。按1∶1（V/V）加入Tris-飽和酚，室溫混懸后4 ℃、12 000 r/min條件下離心30 min，保留酚相。在酚相中加入0.1 mol/L pH 8.8 Tris-HCl及0.01 mol/L DTT后再加入4 倍體積甲醇（含0.01 mol/L 乙酸銨（乙酸銨-甲醇（1∶24，V/V））及0.01 mol/L DTT（DTT-甲醇（1∶480，V/V））），-80 ℃沉淀1 h以上，4 ℃、12 000 r/min條件下離心30 min。沉淀用預(yù)冷的90%乙醇（含0.01 mol/L DTT（DTT-乙醇（1∶100，V/V））洗滌2～3 次，4 ℃、12 000 r/min離心20 min。蛋白沉淀物室溫干燥后，加入溶解液（8.5 mol/L脲、2.5 mol/L硫脲、5% CHAPS、1%載體兩性電解質(zhì)、0.1 mol/L DTT，下同）中，室溫混懸1 h，4 ℃、12 000 r/min條件下離心30 min，上清即為蛋白質(zhì)樣本溶液。

1.3.2.2 TCA-丙酮沉淀法［17-19］

稱(chēng)取0.1 g銀耳芽孢，液氮研磨后，加入5 mL裂解液（7 mol/L脲、2 mol/L硫脲、4% CHAPS、0.5%載體兩性電解質(zhì)、0.05 mol/L DTT、蛋白酶抑制劑混合物，下同）。經(jīng)195 W、10 min或120 MPa、5 min破碎后，4 ℃、12 000r/min條件下離心30 min，保留上清。加入5倍體積預(yù)冷的10 g/100 mL TCA-丙酮溶液，混勻后-20 ℃冰浴30 min。4 ℃、12 000 r/min條件下離心30 min，棄上清。沉淀用預(yù)冷的丙酮洗滌2～3 次，4 ℃、12 000 r/min條件下離心20 min，去除殘留的TCA和丙酮。蛋白沉淀物室溫干燥后，加入溶解液中，超聲波使其充分溶解，室溫混懸1 h，4 ℃、12 000 r/min條件下離心30 min，上清即為蛋白質(zhì)樣本溶液。

1.3.2.3 Tris-飽和酚結(jié)合TCA-丙酮沉淀法［20］

稱(chēng)取0.1 g銀耳芽孢，液氮研磨后，加入5 mL裂解液。經(jīng)195 W、10 min或120 MPa、5 min破碎后，4 ℃、12 000 r/min條件下離心30 min，保留上清。加入5 倍體積預(yù)冷的10 g/100 mL TCA-丙酮溶液，混勻后-20 ℃冰浴30 min。4 ℃、12 000 r/min條件下離心30 min，棄上清。沉淀用預(yù)冷的丙酮洗滌2～3 次，4 ℃、12 000 r/min條件下離心20 min，去除殘留的TCA和丙酮。沉淀室溫干燥后，加入5 mL抽提液，4 ℃、12 000 r/min條件下離心30 min，保留上清。按1∶1（V/V）加入5 mL Tris-飽和酚，室溫混懸后4 ℃、12 000 r/min條件下離心30 min，保留酚相。在酚相中加入0.1 mol/L pH 8.8 Tris-HCl及0.01 mol/L DTT后再加入4 倍體積甲醇（含0.01 mol/L乙酸銨及0.01 mol/L DTT），-80 ℃沉淀1 h以上，4 ℃、12 000 r/min條件下離心30 min。沉淀用預(yù)冷的90%乙醇（含0.01 mol/L DTT）洗滌2～3 次，4 ℃、12 000 r/min條件下離心20 min。蛋白沉淀物室溫干燥后，加入溶解液中，室溫混懸1 h，4 ℃、12 000 r/min離心30 min，上清即為蛋白質(zhì)樣本溶液。

1.3.3 細(xì)胞破碎效果的顯微觀察

將未作處理組、液氮研磨處理組、液氮研磨/超聲波處理組及液氮研磨/高壓均質(zhì)處理組樣品的細(xì)胞破碎效果應(yīng)用顯微成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察。

1.3.4 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

采用Bradford法［21］測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)的含量，取3 次重復(fù)。

1.3.5 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分析

1.3.5.1 凝膠的制備及電泳

按照谷歌生物科技公司SDS-PAGE凝膠制備試劑盒進(jìn)行凝膠制備，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%。

1.3.5.2 染色及脫色

采用傳統(tǒng)考馬斯亮藍(lán)染色法［22］、改良考馬斯亮藍(lán)染色法［23］及硝酸銀染色法［24］3 種方法進(jìn)行染色，3 種染色液配方見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞破碎效果的顯微觀察

由圖1可知，未作處理的銀耳芽孢主要呈圓形或橢圓形結(jié)構(gòu)，有的成鏈狀結(jié)構(gòu)，與未作處理的樣品相比，經(jīng)液氮研磨、液氮研磨/超聲波及液氮研磨/高壓均質(zhì)處理后的細(xì)胞均受到不同程度的破碎。其中，經(jīng)液氮研磨處理后的細(xì)胞破碎效果不是很明顯，芽孢基本保留了圓形或橢圓形結(jié)構(gòu)，只是鏈狀結(jié)構(gòu)明顯減少；經(jīng)液氮研磨/超聲波處理后的細(xì)胞破碎效果較為明顯，呈鏈狀結(jié)構(gòu)的芽孢基本消失，且可觀察到少量細(xì)胞破碎的碎片；經(jīng)液氮研磨/高壓均質(zhì)處理后的細(xì)胞基本變成細(xì)胞碎片，只有極少數(shù)呈圓形或橢圓形結(jié)構(gòu)的芽孢存在，可以看出3 種方法的細(xì)胞破碎效果依次增強(qiáng)。因此，由細(xì)胞破碎效果的顯微觀察結(jié)果可以看出液氮研磨/高壓均質(zhì)破碎細(xì)胞的效果最佳。

2.2 細(xì)胞破碎效果的SDS-PAGE分析

由圖2可知，在Tris-飽和酚法和TCA-丙酮沉淀法中，經(jīng)高壓均質(zhì)后所提取的銀耳芽孢總蛋白電泳條帶亮度與清晰度均優(yōu)于超聲波，且在TCA-丙酮沉淀法中效果更為明顯，因此在后續(xù)研究中采用高壓均質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞破碎。

2.3 蛋白質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果

由圖3可知，Tris-飽和酚法、TCA-丙酮沉淀法和Tris-飽和酚結(jié)合TCA-丙酮沉淀法這3 種方法所得到的銀耳芽孢總蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度分別為2.33、1.26、1.02 mg/mL。Tris-飽和酚法提取的銀耳芽孢總蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度明顯高于其他兩種方法。究其原因，可能是TCA-丙酮沉淀法經(jīng)歷了溶解、沉淀、再溶解的復(fù)雜過(guò)程，沉淀后的蛋白質(zhì)再溶解較為困難，從而引起銀耳芽孢總蛋白大量丟失［25-26］。Tris-飽和酚結(jié)合TCA-丙酮沉淀法所得銀耳芽孢總蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度最低，雖與TCA-丙酮沉淀法的缺陷有關(guān)，但更重要的原因可能是操作步驟過(guò)于繁瑣、周期過(guò)長(zhǎng)，以致銀耳芽孢總蛋白大量丟失。而在Tris-飽和酚法中，酚是蛋白質(zhì)的良好溶劑，蛋白質(zhì)和脂類(lèi)溶于酚相，鹽、核酸、多酚和多糖等可溶性物質(zhì)進(jìn)入水相，從而得以分離。酚層中的蛋白質(zhì)通過(guò)乙酸銨的甲醇溶液沉淀進(jìn)一步純化。乙酸銨在乙醇等有機(jī)溶劑中溶解性較好，因而可在沉淀洗滌過(guò)程中被除去，避免了重新引入離子。并且Tris-飽和酚法得到的蛋白質(zhì)沉淀溶解性優(yōu)于TCA-丙酮沉淀法，前者只需要稍微振蕩便可使沉淀溶于溶解液中，后者需使用超聲波助溶。雖經(jīng)超聲波助溶，蛋白質(zhì)沉淀都溶于溶解液中，但離心后，蛋白質(zhì)又重新沉淀下來(lái)，表明超聲波可能并不能真正使蛋白溶解。Tris-飽和酚法所得蛋白質(zhì)沉淀溶解后再離心，蛋白質(zhì)不會(huì)重新沉淀下來(lái)［27］。結(jié)果表明，采用Tris-飽和酚法提取的銀耳芽孢總蛋白樣品的穩(wěn)定性和重復(fù)性均非常高。

2.4 SDS-PAGE分析

將3 種方法所提取的銀耳芽孢總蛋白進(jìn)行了SDSPAGE分析，并采用傳統(tǒng)考馬斯亮藍(lán)染色法、改良考馬斯亮藍(lán)染色法及硝酸銀染色法3 種方法進(jìn)行染色，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，3 種方法均能較為有效地提取出銀耳芽孢總蛋白，就提取效果而言，Tris-飽和酚法所得蛋白質(zhì)含量最高，電泳條帶清晰且分辨率高，但毒性較強(qiáng)且耗時(shí)；TCA-丙酮沉淀法所得蛋白質(zhì)含量及電泳條帶清晰度雖不及前者，但操作簡(jiǎn)便且省時(shí)；Tris-飽和酚結(jié)合TCA-丙酮沉淀法所得蛋白質(zhì)含量及電泳條帶清晰度均不及前兩種方法，操作最為繁瑣且最耗時(shí)，因此Tris-飽和酚法可作為銀耳芽孢總蛋白提取的一種有效方法。就染色效果而言，傳統(tǒng)考馬斯亮藍(lán)染色法所得電泳條帶較為清晰，但所使用的甲醇有毒；改良考馬斯亮藍(lán)染色法是用乙醇代替甲醇，降低了毒性，但條帶清晰度卻不及傳統(tǒng)方法；硝酸銀染色法靈敏度較高，特別是在低分子質(zhì)量區(qū)間染色效果尤為明顯，但在高分子質(zhì)量區(qū)間電泳條帶分辨率較低，因此選擇傳統(tǒng)考馬斯亮藍(lán)染色法作為本研究的染色方法。

3 結(jié) 論

本研究采用超聲波與高壓均質(zhì)破碎細(xì)胞，通過(guò)Bradford法測(cè)定銀耳芽孢總蛋白質(zhì)量濃度并進(jìn)行SDS-PAGE分析，比較了Tris-飽和酚法、TCA-丙酮沉淀法及Tris-飽和酚結(jié)合TCA-丙酮沉淀法提取銀耳芽孢總蛋白的效果。結(jié)果表明：高壓均質(zhì)破碎細(xì)胞的效果優(yōu)于超聲波，Tris-飽和酚法在蛋白質(zhì)量濃度及電泳條帶清晰度方面均優(yōu)于其他兩種方法，因此Tris-飽和酚法是進(jìn)行銀耳芽孢總蛋白提取的一種有效方法，可為銀耳蛋白質(zhì)生理功能的研究及銀耳芽孢在食品加工中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為其他食用菌總蛋白的提取提供參考。

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Development of an Efficient Method for Total Protein Extraction from Yeast-Like Conidia of Tremella fuciformis

LIU Yang， ZHU Hanyu， XU Danyun， ZHANG Lijiao， MA Aimin*
（College of Food Science and Technology， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China）

In order to compare extraction efficiencies of total protein from the yeast-like conidia of Tremella fuciformis by Tris-saturated phenol method， trichloroacetic acid （TCA）-acetone precipitation method and their combination， the cells were disrupted by ultrasound and high-pressure homogenization， the efficiency of cell disruption was observed by microscope，protein content was determined by the Bradford method， and SDS-PAGE gel electrophoresis analysis was performed. The results showed that the efficiency of cell disruption by high pressure homogenization was better than that by ultrasound. The protein contents obtained by three extraction methods were 2.33， 1.26 and 1.02 mg/mL， respectively. The brightness and resolution of electrophoresis bands with traditional coomassie brilliant blue staining by Tris-saturated phenol method were better than those obtained by two other methods. Hence Tris-saturated phenol method can be considered as a feasible method for protein extraction from the yeast-like conidia of T. fuciformis.

Tremella fuciformis； yeast-like conidia； protein extraction method

10.7506/spkx1002-6630-201609007

TS201

A

1002-6630（2016）09-0035-05

劉洋， 朱涵予， 許丹云， 等. 銀耳芽孢總蛋白提取方法的建立［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（9）： 35-39. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609007. http：//www.spkx.net.cn

LIU Yang， ZHU Hanyu， XU Danyun， et al. Development of an efficient method for total protein extraction from yeastlike conidia of Tremella fuciformis［J］. Food Science， 2016， 37（9）： 35-39. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/ spkx1002-6630-201609007. http：//www.spkx.net.cn

2015-07-28

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31572182；30972072）

劉洋（1991—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：272222498@qq.com

*通信作者：馬愛(ài)民（1965—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：aiminma@mail.hzau.edu.cn