饒美芳，伍偉健，許 超，毛小曉，徐振林，王 弘，雷紅濤，孫遠(yuǎn)明

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642）

小分子化合物開放夾心免疫分析研究進(jìn)展

饒美芳，伍偉健，許 超，毛小曉，徐振林，王 弘*，雷紅濤，孫遠(yuǎn)明

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642）

基于抗原-抗體識(shí)別的免疫分析技術(shù)在小分子監(jiān)測(cè)領(lǐng)域占有重要地位，已成功應(yīng)用于生理活性物質(zhì)、化學(xué)有害物、農(nóng)獸藥等的快速檢測(cè)，在臨床診斷、環(huán)境、食品以及衛(wèi)生領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。由于缺乏結(jié)合位點(diǎn)，小分子化合物的分析大多采用競(jìng)爭(zhēng)模式，與傳統(tǒng)的三明治夾心法相比，穩(wěn)定性和靈敏度往往都難以滿足實(shí)際檢測(cè)需求。近幾年來，科學(xué)家開始嘗試建立針對(duì)小分子化合物的非競(jìng)爭(zhēng)模式免疫分析方法，比如基于抗獨(dú)特型抗體、基于抗體可變區(qū)片段、基于抗異型抗體及抗免疫復(fù)合物多肽。其中基于抗體重鏈和輕鏈結(jié)合的開放夾心免疫分析由于具有只需要單個(gè)抗體、快速非競(jìng)爭(zhēng)的均相檢測(cè)小分子等優(yōu)點(diǎn)，備受研究者關(guān)注。本文主要綜述基于抗體可變區(qū)片段的小分子非競(jìng)爭(zhēng)免疫分析方法，重點(diǎn)介紹了建立小分子非競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)模式所需要抗體可變區(qū)的獲得及篩選途徑、幾種形式信號(hào)放大載體的研究現(xiàn)狀，最后對(duì)其在小分子物質(zhì)檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用前景進(jìn)行了評(píng)述，期望能為本領(lǐng)域研究提供借鑒。

小分子化合物；非競(jìng)爭(zhēng)式；開放夾心免疫分析方法

基于抗原-抗體識(shí)別的免疫分析技術(shù)在小分子監(jiān)測(cè)領(lǐng)域占有重要地位，已成功應(yīng)用于生理活性物質(zhì)、化學(xué)有害物、農(nóng)獸藥等的快速檢測(cè)[1-3]，在臨床診斷、環(huán)境、食品以及衛(wèi)生領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。但是，由于缺乏結(jié)合位點(diǎn)，小分子化合物的分析大多采用競(jìng)爭(zhēng)模式，與傳統(tǒng)的三明治夾心法相比，靈敏度和線性范圍往往都難以滿足實(shí)際檢測(cè)需求[4-6]。為了克服這個(gè)缺點(diǎn)，學(xué)者們嘗試建立非競(jìng)爭(zhēng)式免疫分析檢測(cè)小分子。目前，小分子非競(jìng)爭(zhēng)的檢測(cè)方法主要有基于抗獨(dú)特型抗體非競(jìng)爭(zhēng)型檢測(cè)小分子化合物[7-8]、基于抗體可變區(qū)片段非競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)小分子化合物、基于抗異型抗體及抗免疫復(fù)合物多肽檢測(cè)小分子化合物[9]。研究表明，這些非競(jìng)爭(zhēng)的檢測(cè)方法具有高靈敏度、寬線性范圍、低性噪比等優(yōu)點(diǎn)，且不可取代。其中基于抗體重鏈和輕鏈結(jié)合的開放夾心免疫分析具備只需要單個(gè)抗體，就能快速非競(jìng)爭(zhēng)地均相檢測(cè)小分子等優(yōu)點(diǎn)，備受研究者關(guān)注。本文主要綜述基于抗體可變區(qū)片段建立的一種新的非競(jìng)爭(zhēng)免疫檢測(cè)方法，重點(diǎn)介紹了該小分子非競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)模式建立需要的抗體可變區(qū)獲得有效途徑、幾種形式信號(hào)放大載體的研究現(xiàn)狀，旨在擴(kuò)大該方法在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用、提高檢測(cè)靈敏度，為開放夾心免疫分析方法應(yīng)用提供一些參考。

1 開放夾心免疫分析的原理

1996年Ueda等[10]用表面等離子共振生物傳感器測(cè)定抗雞卵溶菌酶抗體的重鏈可變區(qū)（heavy chain variable region，VH）和輕鏈可變區(qū)（light chain variable region，VL）相互作用，發(fā)現(xiàn)抗原誘導(dǎo)抗體可變區(qū)結(jié)合穩(wěn)定化。目前，開放夾心的原理主要應(yīng)用于基于抗體可變區(qū)片段的非競(jìng)爭(zhēng)模式檢測(cè)小分子，用于篩選親和力高的抗體[11]；結(jié)合分子印跡技術(shù)，用表面等離子共振監(jiān)測(cè)分子的吸附和解吸[12]；利用熒光蛋白與抗體的融合蛋白熒光能量共振轉(zhuǎn)移，建立開放花式熒光免疫分析（open flower fluoroimmunoassay，OF-FIA），檢測(cè)分子質(zhì)量較大的生物標(biāo)志物[13]?；诳贵wVH和VL可變區(qū)之間相互作用檢測(cè)待測(cè)抗原而建立的免疫檢測(cè)方法（圖1），是待測(cè)抗原與抗體可變區(qū)結(jié)合，而不是傳統(tǒng)夾心法兩個(gè)抗體與待測(cè)抗原之間。因此，這種夾心法被稱為開放夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（open sandwich enzyme-linked immunosorbent assay，OS-ELISA）。與傳統(tǒng)的夾心法相比，OS-ELISA具有低檢測(cè)限、寬線性工作范圍和高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)。然而缺乏易于使用的抗體篩選及制備的方法，限制了OS-ELISA的應(yīng)用。只有一種情況適合建立OS-ELISA，即在缺少抗原時(shí)，抗體的可變區(qū)VH與VL之間存在微弱的作用，而抗原存在時(shí)，可以顯著增強(qiáng)VH與VL的作用，利用這個(gè)作用的差別來檢測(cè)待測(cè)抗原，如果這個(gè)作用沒有差別，或者前者大于后者，都不能建立OSELISA。所以，學(xué)者進(jìn)行了一系列的研究來改變VH和VL之間的作用差別。有報(bào)道指出，對(duì)于這個(gè)作用差別不大的可變區(qū)，可通過突變VH和VL相互作用的關(guān)鍵氨基酸，使檢測(cè)信號(hào)增強(qiáng)200%[14]。對(duì)于不適合構(gòu)建的OSELISA的抗體可變區(qū)，可通過VH和VL相互作用的蛋白質(zhì)工程，將其轉(zhuǎn)化為能夠建立OS-ELISA可變區(qū)[15]。然而，缺乏易于使用的抗體篩選及制備的方法。因此，尋求能夠快速、簡(jiǎn)單及有效地獲得可變區(qū)方法成為現(xiàn)今的熱點(diǎn)。

圖1 OS-ELISA的原理Fig.1 Principle of OS-ELISA[10]

2 OS-ELISA的建立方法

2.1 表面等離子共振分析VH和VL相互作用

起初OS-ELISA建立，是從單克隆抗體獲得VH和VL基因，利用該改造表達(dá)載體pKTN2在大腸桿菌表達(dá)抗體可變區(qū)（antibody variable fragment，F(xiàn)v）蛋白，用陰離子交換柱得到分離及純化后的可變區(qū)片段（即VH片段蛋白）和VL可變區(qū)片段相互作用，通過表面等離子共振探索抗雞卵溶菌酶抗體VH和VL相互作用，發(fā)現(xiàn)抗體的可變區(qū)VH與VL之間存在微弱的作用，而抗原存在時(shí)，可以顯著增強(qiáng)VH與VL的作用，基于此原理建立OSELISA[10]。然而，此篩選方法操作較為繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)。

2.2 VH篩選系統(tǒng)

噬菌體展示是具有篩選和評(píng)價(jià)蛋白相互作用功能的分子生物學(xué)技術(shù)[16]。這項(xiàng)技術(shù)不僅能展示抗體可變區(qū)，還可以用作為抗體展示和篩選。起初，基于VH蛋白庫篩選合適的Fv蛋白，Tsumoto等[11]根據(jù)抗雞卵溶菌酶抗體可以識(shí)別鳥類的溶菌酶，但是不能識(shí)別人類的溶菌酶，從分子機(jī)制的角度看，其最大區(qū)別在于抗雞卵溶菌酶抗體重鏈可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)（heavy chain complementarity determining region，HCDR2）?；诖私⒅劓淗CDR2的隨機(jī)突變庫，用人類溶菌酶以開放夾心的模式去篩選親和力高的Fv蛋白片段（圖2）。

圖2 開放夾心的模式篩選親和力高的Fv蛋白[11]Fig.2 Schematic representation of open sandwich selection method[11]

2.3 單鏈抗體（antibody split chain variable fragment，spFv）篩選系統(tǒng)

傳統(tǒng)的OS-ELISA是通過直接建立OS-ELISA檢測(cè)目標(biāo)物是否適合于該體系，操作耗時(shí)、繁瑣且不是所有的目標(biāo)物都適合于該體系，成為OS-ELISA廣泛應(yīng)用的限制因素。為了克服這個(gè)缺點(diǎn)，學(xué)者們研究簡(jiǎn)化篩選的方法。spFv展示系統(tǒng)（圖3）是M13輔助噬菌體外殼pIX和pVII的N端展示VH/VL蛋白片段，在這個(gè)系統(tǒng)中，在VL和VH基因之間設(shè)計(jì)了一個(gè)琥珀密碼子。當(dāng)在對(duì)琥珀密碼子產(chǎn)生作用的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，該系統(tǒng)只能展示VH蛋白片段，而VL蛋白片段分泌到上清。因此，能夠通過固定的VL蛋白檢測(cè)被固定的噬菌體的數(shù)量來研究?jī)蓚€(gè)片段的相互作用。這個(gè)方法已成功用于檢測(cè)人類骨鈣素[17]、類固醇[18]、雌激素的真菌毒素玉米烯酮[19]等。到目前為止，有許多展示系統(tǒng)被用于表面展示抗體及其片段，特別是建庫篩選高親和力的抗體。例如，許多用于spFv篩選的噬菌體載體如pIT2[20]、pCANTAB5E[21]以及用于Fab展示的載體如pComb3[22]和pCES[23]，這些載體適用于構(gòu)建文庫，篩選特異結(jié)合抗原的陽性克隆。然而，所有這類載體都不能評(píng)價(jià)兩個(gè)展示片段的相互作用。對(duì)于spFv展示系統(tǒng)，既能展示抗體，又能評(píng)價(jià)兩個(gè)展示片段的相互作用的噬菌體載體，用于篩選合適的抗體可變區(qū)片段。雖然這個(gè)系統(tǒng)可以用來篩選和克隆Fv片段，建立OS-ELISA，但是存在一些抗體Fv蛋白片段，它們不能有效結(jié)合抗原，或者是由于獨(dú)立的VL蛋白片段穩(wěn)定性比較差，分泌的VL蛋白片段太少，這些都不利于建立OS-ELISA。

圖3 SpFv載體及SpFv篩選技術(shù)[17]Fig.3 Structure of the phagemid for spFv display and selection method based on spFv-phage display[17]

2.4 抗體結(jié)合片段（antibody-binding fragment，F(xiàn)ab）篩選系統(tǒng)

Dong Jinhua等[24]研究了一種新型Fab噬菌體展示系統(tǒng)，可以用來展示Fab蛋白片段、篩選特異結(jié)合抗原的Fab蛋白片段，評(píng)估目標(biāo)物是否適合通過OS-ELISA檢測(cè)方法來定量。這個(gè)新型的噬菌體展示載體pDong1，具有兩個(gè)分泌表達(dá)信號(hào)肽（pelB和ompA）、琥珀密碼子（amber codon）和抗體重鏈的恒定區(qū)1（heavy chain constant region 1，CH1）兩端含有SgrAI酶基因。該載體可以在絲狀噬菌體的表面上展示的L鏈和H鏈在大腸桿菌周質(zhì)腔形成二硫鍵，展示Fab蛋白片段（圖4）。用SgrAI酶切切除CH1基因，使得展示的VH蛋白與分泌表達(dá)的L鏈不會(huì)在周質(zhì)腔形成二硫鍵，將噬菌體的展示Fab轉(zhuǎn)化成噬菌體展示的VH蛋白和分泌表達(dá)的VL，利用于生物淘篩，將Fab噬菌體展示系統(tǒng)成功被轉(zhuǎn)換為可以評(píng)價(jià)VH/VL相互作用的OS-ELISA。此方法直接繞過復(fù)雜的雜交瘤技術(shù)，通過免疫老鼠脾臟獲得可變區(qū)基因，簡(jiǎn)化了可變區(qū)制備過程。對(duì)比spFv展示系統(tǒng)和Fab展示系統(tǒng)，由于單鏈抗體scFv片段傾向于形成多聚體[25-26]，而Fab保持單體形成存在，在篩選高親和力抗體中，F(xiàn)ab有更大自由度[27-28]。因此，這個(gè)系統(tǒng)提供一個(gè)優(yōu)于傳統(tǒng)方法、快速、有效的篩選合適的可變區(qū)的途徑。目前，該方法已成功用于貝類毒素[29]、甲狀腺激素T4[30]。

圖4 pDong載體及Fab篩選技術(shù)[24]Fig.4 Structure of the phagemid for Fab display (pDong1) and selection method based on of Fab-phage display[24]

3 信號(hào)放大的方式

3.1 酶標(biāo)記法

起初的OS-ELISA，通過噬菌體展示的VH片段用來評(píng)價(jià)VH/VL的相互作用[10]。由于實(shí)驗(yàn)操作繁瑣，最終將VH/VL與細(xì)菌堿性磷酸酶融合表達(dá)，是通過加入標(biāo)簽底物，用比色法或化學(xué)發(fā)光信號(hào)來對(duì)檢測(cè)的抗原進(jìn)行量化。實(shí)驗(yàn)證明無論是包被生物素鏈接的VL檢測(cè)VH偶聯(lián)堿性磷酸酶（VH conjugated alkaline phosphatase，VH-phoA）的模式（圖5），還是包被生物素的VH檢測(cè)VL-PhoA的模式，都顯示融合蛋白模式在OS-ELISA檢測(cè)中應(yīng)用是可行的。目前主要應(yīng)用的酶是堿性磷酸酶[17]和辣根過氧化物酶[30]。此外，科學(xué)家還發(fā)現(xiàn)融合蛋白表達(dá)可以促進(jìn)目標(biāo)物在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)可溶表達(dá)[31]，而且研究表明VH-phoA融合蛋白的形式要比獨(dú)立的VH要穩(wěn)定[18]，不易形成二聚體，造成反應(yīng)高背景。推測(cè)原因是VH連接在一個(gè)較大的蛋白標(biāo)簽上，減少非特異性碰撞而不被聚合[32]。因此，酶標(biāo)記抗體可變區(qū)在OS-ELISA廣泛應(yīng)用的檢測(cè)信號(hào)。

圖5 酶標(biāo)記的OS-ELISA[17]Fig.5 Enzyme-labeled OS-ELISA[17]

3.2 共振能量轉(zhuǎn)移法

傳統(tǒng)的免疫方法通過固相載體來固定抗原或抗體，這需要繁瑣的洗滌步驟來將未結(jié)合的試劑洗去。為了克服該限制，Ueda等[10]研究了開放夾心熒光共振能量轉(zhuǎn)移（open sandwich fluoroimmunoassay，OS-FIA），這個(gè)方法基于VH和VL之間的共振能量轉(zhuǎn)移測(cè)定（圖6A），實(shí)現(xiàn)非均相檢測(cè)小分子物質(zhì)。熒光蛋白對(duì)主要有熒光素（fluocrescein，F(xiàn)I）和紅色熒光染料（rhodamine-X，Rh）[33]、增強(qiáng)型藍(lán)色熒光蛋白（enhanced blue fluorescent protein，EBFP）和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）[34]以及海腎熒光素（renilla luciferase，Rluc）和增強(qiáng)型黃色熒光染料（enhanced yellow fluorescent protein，EYFP）[35]，將VH與熒光蛋白供體偶連，VL與熒光蛋白受體偶連。當(dāng)偶連后的VH和VL與抗原混合，可以通過監(jiān)測(cè)兩個(gè)綠色熒光蛋白之間的共振能量轉(zhuǎn)移來測(cè)定抗原的濃度。這種測(cè)定方法較傳統(tǒng)的非均相OS-ELISA，具有操作簡(jiǎn)單、快速、檢測(cè)限低的優(yōu)點(diǎn)。然而，對(duì)于這種一般的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）而言，都存在因?yàn)閺?qiáng)激發(fā)光而導(dǎo)致的光漂白和自身熒光的局限。因此，為了克服這個(gè)缺點(diǎn)，后來出現(xiàn)了用生物熒光素酶代替FRET的供體，構(gòu)建了開放夾心生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移免疫測(cè)定（bioluminescence resonance energy transfer，OS-BRET）（圖6B）。這不需要外界激發(fā)熒光的參與，解決了FRET交叉激發(fā)的問題；背景熒光較FRET低，大大提高實(shí)驗(yàn)的簡(jiǎn)便性和可重復(fù)性[36]。

圖6 共振能量轉(zhuǎn)移[35-36]Fig.6 Schemes of OS-FIA and OS-BRET[35-36]

3.3 蛋白片段互補(bǔ)系統(tǒng)法

β-半乳糖苷酶互補(bǔ)系統(tǒng)常被用來研究蛋白質(zhì)的相互。學(xué)者們嘗試?yán)忙?半乳糖苷酶互補(bǔ)系統(tǒng)與OS-ELISA原理相結(jié)合，建立非競(jìng)爭(zhēng)均相免疫測(cè)定，即開放夾心酶互補(bǔ)免疫分析（open sandwich enzymatic complementation immunoassay，OS-ECIA）。將Δα、Δω分別與VH、VL融合表達(dá)，在抗原存在情況下，VH、VL相互作用，使得Δα、Δω蛋白之間結(jié)合形成β-半乳糖苷酶，通過酶活性來反映待測(cè)抗原的濃度（圖7）。與傳統(tǒng)的均相OS-ELISA比較，發(fā)現(xiàn)靈敏度提高了1 000 倍，降低了反應(yīng)的背景值。此外，減少了所需的反應(yīng)時(shí)間、操作、樣品量和測(cè)定的抗體試劑[36-37]。后來，Lee等[38]研究將綠色熒光蛋白互補(bǔ)系統(tǒng)綠色熒光蛋白的N端片段（N-terminal fragment green fluorescent protein，NGFP）和綠色熒光蛋白的C端片段（C-terminal fragment green fluorescent protein，CGFP）應(yīng)用在OS-ELISA，實(shí)現(xiàn)在活細(xì)胞中檢測(cè)赤霉素。

圖7 開放夾心酶互補(bǔ)免疫分析法[38]Fig.7 Principle of open sandwich enzymatic complementation immunoassay[38]

3.4 基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)免疫分析的技術(shù)法

傳統(tǒng)的開放夾心噬菌體免疫分析（open sandwich immunoassay based on phage display，OS-phage ELISA）（圖8A）是用辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）酶標(biāo)的抗M13噬菌體抗體結(jié)合固定在板上的噬菌粒，從而檢測(cè)抗原濃度。其背景信號(hào)主要受到非特異性結(jié)合的一些測(cè)定的試劑影響（噬菌體展示的抗體重鏈可變區(qū)蛋白和HRP酶標(biāo)的抗M13噬菌體抗體等）。而免疫分析法基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR），是一種超靈敏的檢測(cè)微量抗原的方法[39]。為了進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度，近來學(xué)者將OS-ELISA與定量PCR技術(shù)相結(jié)合，建立開放夾心免疫PCR方法（open sandwich immunoassay based on polymerase chain reaction and phage display，OS-phage immune-PCR）。該方法雖然是基于OS-phage ELISA，但是它的檢測(cè)步驟是定量。通過熱處理，將攜帶VH基因的噬菌體的載體洗脫出來，用于定量PCR檢測(cè)（圖8B）。理論上，其檢測(cè)靈敏度是由幅值和檢測(cè)背景信號(hào)決定的。因此OS phage immune-PCR不僅省略加入HRP酶標(biāo)的抗M13噬菌體抗體，而且通過PCR的擴(kuò)增來放大檢測(cè)信號(hào)，目前已經(jīng)應(yīng)用于檢測(cè)骨鈣素肽和17β-雌二醇[40]，其檢測(cè)特異性和靈敏度都高于傳統(tǒng)的OS-phage ELISA。

但是，由于噬菌體熱穩(wěn)定性好，用熱處理提取噬菌體攜帶的DNA效率重復(fù)性較差。且此檢測(cè)中的噬菌體必須要新制備的，這必然影響檢測(cè)的重復(fù)性和實(shí)用性。為了避免這個(gè)局限，Hasan等[41]建立了基于生物素鏈接的開放夾心噬菌體熒光定量PCR免疫分析方法（圖8C）。其主要的區(qū)別是將OS-ELISA與實(shí)時(shí)定量PCR相結(jié)合，在鏈霉親和素（chain mildew avidin，SA）-VL和生物素標(biāo)記的探針DNA同時(shí)加入包被了VH-麥芽糖結(jié)合蛋白（maltose binding protein，MBP）酶標(biāo)板中預(yù)反應(yīng)，再加入藥物。其檢測(cè)信號(hào)是用高度專一酶將反應(yīng)后的復(fù)合物的DNA鏈切下，作為實(shí)時(shí)定量PCR的探針，最終轉(zhuǎn)化為目標(biāo)抗原的濃度。目前已成功應(yīng)用于檢測(cè)人類骨鈣素C端片段，其最低檢測(cè)限達(dá)100 fg/mL，比以往的OS-phage-ELISA檢測(cè)限都低。該方法用酶切特異去洗脫作為檢測(cè)信號(hào)的DNA，對(duì)超靈敏的在線監(jiān)測(cè)小分子抗原發(fā)揮重要作用。

圖8 開放夾心免疫PCR法測(cè)定原理[39-41]Fig.8 Scheme of open sandwich immunoassay based on PCR and phage display[39-41]

3.5 傳感器法

近來，Sakata等[42]將OS-ELISA的機(jī)理與基于電場(chǎng)效應(yīng)的生物傳感器相結(jié)合，建立不需要添加檢測(cè)標(biāo)簽的新方法，即為開放夾心免疫電場(chǎng)效應(yīng)晶體管（open sandwich based immuno-field effect transistor，OS-FET）（圖9）。其理論依據(jù)是在場(chǎng)效應(yīng)中，小分子抗原驅(qū)動(dòng)VH與VL相互作用，使得修飾在晶體管的分子的內(nèi)部電荷改變[43]，以此作為檢測(cè)信號(hào)。已知可變區(qū)VH（在德拜長(zhǎng)度范圍內(nèi)）在水溶液中帶負(fù)電，將其修飾在在場(chǎng)效應(yīng)器件表面，當(dāng)加入抗原與一條可變區(qū)鏈，抗原會(huì)誘導(dǎo)抗體可變區(qū)VH與VL相互作用，固定在器件的生物分子的電荷密度就會(huì)發(fā)生改變并轉(zhuǎn)化成電信號(hào)，從而檢測(cè)抗原的濃度。與傳統(tǒng)的OS-ELISA比較，既避免繁瑣加入標(biāo)簽步驟，又可以提高檢測(cè)的靈敏度。

圖9 開放夾心免疫電場(chǎng)效應(yīng)晶體管[43]Fig.9 Principle of open sandwich-based immuno-field effect transistor (OS-FET)[43]

最新報(bào)道的另外一種新型基于微流芯片傳感器技術(shù)OS-ELISA，它的原理是將MBP-VL固定在聚苯乙烯微珠（物理吸附），孵育，接著微珠從入口孔進(jìn)入玻璃芯片的微堰處，將微珠截留在芯片處，而后沖洗過量的微珠，接著以一定的流速加入藥物和酶標(biāo)VH。沖洗微通道后，酶的底物泵入微通道。反應(yīng)積累的產(chǎn)物已一定的速度流出微通道，下游經(jīng)過激光誘導(dǎo)的熱透鏡顯微術(shù)檢測(cè)器，用其光電二級(jí)管探測(cè)比色法產(chǎn)物的峰強(qiáng)（圖10）。目前，已經(jīng)成功應(yīng)用于檢測(cè)骨鈣素[44]和甲狀腺激素[45]。在微流控芯片上進(jìn)行OS-ELISA，能有效地克服免疫分析的缺點(diǎn)，簡(jiǎn)化操作步驟，縮短檢驗(yàn)時(shí)間，樣品、試劑和能量消耗大大降低，有效降低檢測(cè)限、提高靈敏度。然而在OS-ELISA中，引入微流芯片傳感器技術(shù)，其關(guān)鍵因素是以信號(hào)/背景（signalling/background，S/B）的比率作為優(yōu)化條件的評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化抗體在微珠固定的方式、孵育/洗滌的條件、封閉試劑的濃度、反應(yīng)緩沖液的濃度、酶標(biāo)VH的濃度和流入微流控芯片的流速等的條件。

圖10 微通道的玻璃芯片應(yīng)用于OS-ELISA[44-45]Fig.10 Micro-ELISA system. A glass chip integrated with microfluidic channels is used for the open-sandwich ELISA reaction[44-45]

4 OS-ELISA在食品安全中的應(yīng)用

由于OS-ELISA原理是抗原驅(qū)動(dòng)抗體可變區(qū)穩(wěn)定化，通過此穩(wěn)定化的檢測(cè)信號(hào)檢測(cè)抗原的含量。Naoto等[46]通過獲得單抗的可變區(qū)，直接建立OS-ELISA方法檢測(cè)食品飲料業(yè)的桃子風(fēng)味物質(zhì)苯甲醛，易于實(shí)現(xiàn)快速靈敏在線檢測(cè)生產(chǎn)線中清洗殘留物。由于不是所有的抗體都適合建立OS-ELISA模式，Suzuki等[19]利用spFv噬菌體庫篩選合適的抗體可變區(qū)，獲得更優(yōu)玉米和小雜糧產(chǎn)生的雌激素真菌毒素玉米赤霉烯酮的檢測(cè)限及檢測(cè)線性工作范圍。然而，scFv傾向于形成多聚體，影響篩選多樣性。IHARA等[29]引入Fab噬菌體篩選文庫，建立直接以開放夾心的模式篩選體系檢測(cè)貝類毒素，其檢測(cè)最低檢測(cè)限為0.1 ng/mL，低于許多國家安全限量標(biāo)準(zhǔn)以及歐洲食品安全局的新的標(biāo)準(zhǔn)值，因此，此方法廣泛適用于飲用水和貝肉中貝類麻痹性貝毒的檢測(cè)。但是，前期研究表明，在OS-ELISA中隨抗體濃度變化響應(yīng)信號(hào)變化值小，造成檢測(cè)誤差大。隨著傳感器技術(shù)的迅速發(fā)展，傳感器的應(yīng)用為解決OS-ELISA所存在的問題提供了新的途徑。Hasan等[41]將場(chǎng)效應(yīng)晶體管與開放免疫分析相結(jié)合檢測(cè)雙酚A，直接對(duì)抗原進(jìn)行快速檢測(cè)，儀器簡(jiǎn)單，成本低廉，易于實(shí)現(xiàn)微型化，檢測(cè)限可以達(dá)到100 fg/mL。OS-ELISA在食品安全中的應(yīng)用研究進(jìn)展如表1所示。

表1 OS-ELISA檢測(cè)的小分子對(duì)象Table 1 Detection of small molecules by open sandwich immunoassay

5 結(jié) 語

基于可變區(qū)片段的OS-ELISA，與傳統(tǒng)的夾心法檢測(cè)相比，具有檢測(cè)單價(jià)抗原、僅需要單個(gè)抗體、測(cè)量時(shí)間縮短、靈敏度高、線性范圍廣和可用于均相檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，因此在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用前景。但是，我國還未見此方面的報(bào)導(dǎo)。而現(xiàn)階段，OS-ELISA已經(jīng)建立的檢測(cè)小分子化合物主要有生理活性物質(zhì)、生物毒素、添加劑及非法添加物等。近年來的研究正在嘗試基于抗體可變區(qū)的非競(jìng)爭(zhēng)免疫檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥和孔雀石綠及其代謝物隱性孔雀石綠，取得一定的進(jìn)展。但是，研究發(fā)現(xiàn)其應(yīng)用存在一些瓶頸問題：一是如何的高效和簡(jiǎn)便的獲得可以用于建立開放夾心檢測(cè)抗體的可變區(qū)；二是如何加大開放夾心免疫檢測(cè)的信號(hào)響應(yīng)變化。值得提及是結(jié)合噬菌體文庫技術(shù)和pDong載體可以高效篩選檢測(cè)目標(biāo)抗原的抗體可變區(qū)，大大促進(jìn)了開放免疫分析的發(fā)展。但是，不是每種抗體的可變區(qū)都可以直接滿足建立該檢測(cè)方法，研究者應(yīng)該加強(qiáng)其在抗原抗體識(shí)別機(jī)制方面的研究，建立構(gòu)效關(guān)系模型，從動(dòng)力學(xué)和分子水平上真正掌握其作用機(jī)理，建立隨機(jī)突變抗體庫篩或定向突變改造抗體可變區(qū)的作用力，使它適合于構(gòu)建開放夾心式免疫分析，使其廣泛應(yīng)用于檢測(cè)各類小分子物質(zhì)成為了可能。另外，可以開發(fā)新型的信號(hào)放大載體，其中都有：1）小型化的系統(tǒng)包括量子點(diǎn)、生物傳感器、生物芯片等，使微量的待測(cè)物濃度改變能夠帶來高檢測(cè)信號(hào)變化，能夠減少檢測(cè)時(shí)間、提高靈敏度和擴(kuò)寬線性范圍，滿足食品安全監(jiān)測(cè)的要求。同時(shí)，對(duì)分析儀器微型化、便攜化及自動(dòng)化中發(fā)揮重要作用，有可能實(shí)現(xiàn)食品安全的現(xiàn)場(chǎng)。2）結(jié)合熒光蛋白互補(bǔ)系統(tǒng)等的OS-ELISA，可以實(shí)現(xiàn)快速、簡(jiǎn)化操作的非競(jìng)爭(zhēng)均相檢測(cè)小分子化合物，應(yīng)用在食品安全等現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)具有巨大的潛在價(jià)值。

[1] JENNIFER K L, COUETNE Y, JERRY C H, et al. Thyroid hormones enhance the biomechanical functionality of scaffoldfree neocartilage[J]. Arthritis Research & Therapy, 2015, 17(1): 28. DOI:10.1186/s13075-015-0541-5.

[2] SCHRYVER E D, DEVUYST L, DERYCKE L, et al. Local immunoglobulin in the nasal mucosa: clinical implications[J]. Allergy, Asthma & Immunology Research, 2015, 7(4): 321-331. DOI:10.4168/ aair.2015.7.4.321.

[3] 張銘潤(rùn), 張燕, 王弘, 等. 食品污染物殘留的快速檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用綜述及展望[J]. 食品質(zhì)量安全檢測(cè)學(xué)報(bào), 2014, 7(5): 1951-1959.

[4] WEI J W, KARSENTY G. An overview of the metabolic functions of osteocalcin[J]. Current Osteoposis Reports, 2015, 13(3): 180-185. DOI:10.1007/s11914-015-0267-y.

[5] LONG Q, LI H T, ZHANG Y Y, et al. Upconversion nanoparticlebased fluorescence resonance energy transfer assay for organophosphorus pesticides[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2015, 68(15): 168-174. DOI:10.1016/j.bios.2014.12.046.

[6] LU G Y, SONG X X, YU Z M, et al. Environmental effects of modified clay flocculation on Alexandrium tamarense and paralytic shellfish poisoning toxins (PSTs)[J]. Chemosphere, 2015, 127(1): 188-194. DOI:10.1016/j.chemosphere.2015.01.039.

[7] VANGONE A, ABDEL S, CAPUTO I, et al. Basis for the Recognition in an idiotype-anti-idiotype antibody complex related to celiac disease[J]. PLoS ONE, 2014, 9(7): 1-12. DOI:10.1371/journal.pone.0102839.

[8] HUANG W J, LUO M E, ZHONG N, et al. Development of indirect competitive inhibition ELISA method for zearalenone based on idiotype-anti-idiotype reaction[J]. Chinese Journal of Biologicals, 2014, 27(3): 419-422.

[9] DONG J X, XU C, WANG H, et al. Enhanced sensitive immunoassay: noncompetitive phage anti-immune complex assay for the determination of malachite green and leucomalachite green[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2014, 62(34): 8752-8758. DOI:10.1021/jf5019824.

[10] UEDA H, TSUMOTO K, KUBOTA K, et al. Open sandwich ELISA: a novel immunoassay based on the interchain interaction of antibody variable region[J]. Nature Biotechnology, 1996, 14(13): 1714-1718. DOI:10.1038/nbt1296-1714.

[11] TSUMOTO K, NISHIMIYA Y, KASAI N, et al. Novel selection method for engineered antibodies using the mechanisms of Fv fragment stabilization in the presence of antigen[J]. Protein Engineering, 1997, 10(11): 1311-1318. DOI:10.1093/protein/10.11.1311.

[12] MINAMI K, IHARA M, KURODA S, et al. Open-sandwich molecular imprinting: making a recognition matrix with antigen-imprinted antibody fragments[J]. Bioconjugate Chemistry, 2012, 23(7): 1463-1469. DOI:10.1021/bc3000782.

[13] CHUNG C I, MAKINO R, DONG J H, et al. Open flower fluoroimmunoassay: a general method to make fluorescent proteinbased immunosensor probes[J]. Analytical Chemistry, 2015, 87(6): 3513-3519. DOI:10.1021/acs.analchem.5b00088.

[14] ABURATANI T, SAKAMOTO K, MASUDA K, et al. A general method to select antibody fragments suitable for noncompetitive detection of monovalent antigens[J]. Analytical Chemistry, 2003, 75(16): 4057-4064. DOI:10.1021/ac034280n.

[15] SASAJIMA Y, ABURATANI T, SAKAMOTO K, et al. Detection of protein tyrosine phosphorylation by open sandwich fluoroimmunoassay［J］. Biotechnology Progress， 2006， 22（4）： 968-973. DOI:10.1021/bp060104z.

[16] TOLED-MACHADO C M, BUENO L L, MENEZES-SOUZA D, et al. Use of phage displaytechnology in development of canine visceral leishmaniasis vaccine using synthetic peptide trapped in sphingomyelin/cholesterol liposomes[J]. Parasites & Vectors, 2015, 8(1): 1-8. DOI:10.1186/s13071-015-0747-z.

[17] LIM S L, ICHINOSE H, SHINODA T, et al. Noncompetitive detection of low molecular weight peptides by open sandwich immunoassay[J]. Analytical Chemistry, 2007, 79(16): 6193-6200. DOI:10.1021/ ac070653z.

[18] IHARA M, SUZUKI T, KOBAYASHI N, et al. Open-sandwich enzyme immunoassay for one-step noncompetitive detection of corticosteroid 11-deoxycortisol[J]. Analytical Chemistry, 2009, 81(20): 8298-8304. DOI:10.1021/ac900700a.

[19] SUZUKI T, MUNAKATA Y, MORITA K, et al. Sensitive detection of estrogenic mycotoxin zearalenone by open sandwich immunoassay[J]. Analytical Sciences, 2007, 23(1): 65-70. DOI:10.2116/analsci.23.65.

[20] WANG W Y, LUO J, XU L N, et al. Expression of scFv-Me1-Ga14 triple fusion protein as a targeted DNA-carrier in Escherichia coli[J]. Cell Biochemistry and Function, 2013, 31(8): 698-706. DOI:10.1002/ cbf.2958.

[21] HE Z, TIAN W Y, GAO Y, et al. Construction and screening of human single-chain antibody library of anti-mycobacterium smegmatis[J]. Journal of Natural Science of Human Normal University, 2011, 34(5): 70-74.

[22] XU L M, YIN C K, REN G P, et al. Establishment of bacteria display technology for Fab antibody library screening[J]. Chinese Journal of Cellular and Molecular Immunology, 2011, 27(10): 1090-1093.

[23] KIM H U, MI D, KIM J H, et al. Carbazole-containing fullerene derivatives for P3HT-based bulk-heterojunction solar cells[J]. Solar Energy Materials And Solar Cells, 2012, 105(10): 6-14. DOI:10.1016/ j.solmat.2012.05.017.

[24] DONG J, IHARA M, UEDA H. Antibody Fab display system that can perform open-sandwich ELISA[J]. Analytical Biochemstry, 2009, 386(1): 36-44. DOI:10.1016/j.ab.2008.11.045.

[25] WEIDNER K M, DENZIN L K, VOSS E W. Molecular stabilization effects of interactions between anti-metatype antibodies and liganded antibody[J]. Journal of Biological Chemistry, 1992, 267(15): 10281-10288.

[26] JOHNSON J L, ENTZMINGER K C, HYUN J. Structural and biophysical characterization of an epitope-specific engineered Fab fragment and complexation with membrane proteins: implications for co-crystallization[J]. Biological Crystallography, 2015, 71(4): 896-906. DOI:10.1107/S1399004715001856.

[27] KAVANAGH O, ELLIOTT C T, CAMPBELL K. Progress in the development of immunoanalytical methods incorporating recombinant antibodies to small molecular weight biotoxins[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2015, 407(10): 2749-2770. DOI:10.1007/ s00216-015-8502-z.

[28] RAUCHENBERGER R, BORDES E, THOMSSEN-WOLF E, et al. Human combinatorial Fab library yielding specific and functional antibodies against the human fibroblast growth factor receptor 3[J]. Journal of Biological Chemistry, 2003, 278(40): 38194-38205. DOI:10.1074/jbc.M303164200.

[29] IHARA Y, DONG J, UEDA H. Open-sandwich immunoassay for sensitive and broad-range detection of a shellfish toxin gonyautoxin［J］. Analytica Chimica Acta, 2013, 793(2): 107-113. DOI:10.1016/ j.aca.2013.07.024.

[30] ISLAM K N, IHARA M, DONG J, et al. Direct construction of an open-sandwich enzyme immunoassay for one-step noncompetitive detection of thyroid hormone T4[J]. Analytical Chemistry, 2011, 83(3): 1008-1014. DOI:10.1021/ac102801r.

[31] RARAN-KURUSSI S, KEEFE K, WAUGH D S. Positional effects of fusion partners on the yield and solubility of MBP fusion proteins[J]. Protein Expression and Purification, 2015, 110(1): 159-164. DOI:10.1016/j.pep.2015.03.004.

[32] SUZUKI C, UEDA H, TSUMOTO K, et al. Open sandwich ELISA with VH-/VL-alkaline phosphatase fusion proteins[J]. Journal of Immunological Methods, 1999, 224(1/2): 171-184. DOI:10.1016/ S0022-1759(99)00020-4.

[33] UEDA H, KUBOTA K, WANG Y, et al. Homogeneous noncompetitive immunoassay based on the energy transfer between fluorolabeled antibody variable domains (open sandwich fluoroimmunoassay）［J］. Biotechniques， 1999， 27（4）： 738-742.

[34] TIMO P, MATTI H, HANS S, et al. One-step homogeneous immunoassay for immunoassay for small analytes[J]. Analytical Chemistry, 2005, 77(8): 2637-2642. DOI:10.1021/ac048379l.

[35] ARAI R, NAKAGAWA H, TSUMUTO K, et al. Demonstration of a homogeneous noncompetitive immunoassay based on bioluminescence resonance energy transfer[J]. Analytical Biochemstry, 2001, 289(1): 77-81. DOI:10.1006/abio.2000.4924.

[36] YOKOZEK T, UEDA H, ARAI R, et al. A homogeneous noncompetitive immunoassay for the detection of small haptens[J]. Analytical Chemistry, 2002, 74(11): 2500-2504. DOI:10.1021/ ac015743x.

[37] UEDA H, YOKAZEKI T, ARAI R, et al. An optimized homogeneous noncompetitive immunoassay based on the antigen-driven enzymatic complementation[J]. Journal of Immunological Methods, 2003, 279(1/2): 209-218. DOI:10.1016/S0022-1759(03)00256-4.

[38] LEE Y, ASAMI T, YAMAGUCHI L, et al. A new gibberellin detection system in living cells based on antibody V(H)/V(L) interaction[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2008, 376(1): 134-138. DOI:10.1016/j.bbrc.2008.08.130.

[39] SUN R Y, ZHANG H S. Biotin-streptavidin-amplified real-time immune-PCR assay for detecting dimethyl phthalate in beverage and drinking water samples[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2015, 407(4): 1261-1265. DOI:10.1093/jat/20.7.559.

[40] DONG J H, HASAN S, FUIJIOKA Y, et al. Detection of small molecule diagnostic markers with phage-based open-sandwich immuno-PCR[J]. Journal of Immunological Methods, 2012, 377(1/2): 1-7. DOI:10.1016/j.jim.2012.01.005.

[41] HASAN S, DONG J, UEDA H. Protein-based open sandwich immuno-PCR for sensitive detection of small biomarkers[J]. Analytical Sciences, 2013, 29(9): 871-876. DOI:10.2116/analsci.29.871.

[42] SAKATA T, IHARA M, MAKINO I, et al. Open sandwich-based immuno-transistor for label-free and noncompetitive detection of low molecular weight antigen[J]. Analytical Chemistry, 2009, 81(18): 7532-7537. DOI:10.1021/ac900457m.

[43] WU Yun, ZOU Jianjun, HUO Shuai, et al. Benzocyclobutene（BCB） polymer as amphibious buffer layer for grephene field effect transistor[J]. Journal of Nanoscience and Nanotechnology, 2015, 15(8): 5706-5710. DOI:10.1166/jnn.2015.10034.

[44] ISLAM K N, IHARA M, DONG J, et al. Micro open-sandwich ELISA to rapidly evaluate thyroid hormone concentration from serum samples[J]. Bioanalysis, 2010, 2(10): 1683-1687. DOI:10.4155/ bio.10.125.

[45] HARA M, YOSHIKAWA A, WU Y, et al. Micro OS-ELISA: Rapid noncompetitive detection of a small biomarker peptide by opensandwich enzyme-linked immunosorbent assay (OS-ELISA) integrated into microfluidic device[J]. Lab on a Chip, 2010, 10(1): 92-100. DOI:10.1039/b915516c.

[46] SIUZUKI C, UEDA H, MAHONEY W, et al. Open sandwich enzymelinked immunosorbent assay for the quantitation of small haptens[J]. Analytical Biochemistry, 2000, 286(2): 238-246. DOI:10.1006/ abio.2000.4800.

[47] NAOTO S, TAKE O, KAZUTAKA N, et al. Noncompetitive immunodetection of benzadhyde by open sandwich ELISA[J]. Analytical Sciences, 2009, 25(9): 1095-1100. DOI:10.2116/ analsci.25.1095.

Progress in Noncompetitive Detection of Small Molecules by Open Sandwich Immunoassay

RAO Meifang, WU Weijian, XU Chao, MAO Xiaoxiao, XU Zhenlin, WANG Hong*, LEI Hongtao, SUN Yuanming
(Guangdong Provincial Key Laboratory of Food Safety and Quality, College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

Sensitive and quantitative determination of low molecular weight molecules is a major analytical task in biomedical, food and environmental fields. Although sandwich ELISA exhibits high specificity and sensitivity, it takes a long time and involves multiple incubation/washing steps. Moreover, the conventional sandwich immunoassay is not suitable to detect small molecules because of the lack of two discrete binding sites. Recently, open-sandwich immunoassay (OS-ELISA), phage anti-immune complex assay and idiotype-anti-idiotype reactions have been developed for the noncompetitive detection of haptens. However, OS-ELISA, based on antigen-dependent stabilization of antibody variable region to quantify various antigens, allows noncompetitive detection of small molecules with the applicability to a homogeneous assay, requires only a single antibody recognizing one epitope and simple instrumentation and suitable for full automation. In this paper， therefore， the principle， established methods， and signal amplification of this immunoassay are reviewed. The potential application of open sandwich immunoassay for detecting small molecules is also discussed.

small molecules; noncompetitive detection; open sandwich immunoassay

10.7506/spkx1002-6630-201607040

TS207.3

A

1002-6630（2016）07-0219-08

饒美芳, 伍偉健, 許超, 等. 小分子化合物開放夾心免疫分析研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(7): 219-226. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201607040. http://www.spkx.net.cn

RAO Meifang, WU Weijian, XU Chao, et al. Progress in noncompetitive detection of small molecules by open sandwich immunoassay[J]. Food Science, 2016, 37(7): 219-226. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607040. http://www.spkx.net.cn

2015-06-29

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31271866）；廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2014A030311043）；廣東省教育廳創(chuàng)新強(qiáng)校工程項(xiàng)目；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014J4100185）

饒美芳（1991—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。E-mail：rmfrwl@163.com

*通信作者：王弘（1973—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。E-mail：gzwhongd@163.com