叢 敏，李欣蔚，武俊瑞，岳喜慶

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110161）

PCR-DGGE分析東北傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜中乳酸菌多樣性

叢 敏，李欣蔚，武俊瑞，岳喜慶*

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110161）

以傳統(tǒng)自然發(fā)酵的酸菜為研究對象，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reactiondenatured gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術(shù)監(jiān)測酸菜發(fā)酵過程中細(xì)菌的動態(tài)變化，計算不同發(fā)酵時間細(xì)菌的多樣性指數(shù)，并對圖譜特異性條帶進(jìn)行克隆、測序、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明：酸菜發(fā)酵第40天多樣性指數(shù)達(dá)最高值，說明此時細(xì)菌種群多樣性最高；發(fā)酵過程中含豐富的乳酸菌，主要的優(yōu)勢菌群為乳桿菌屬，包括植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、短乳桿菌、干酪乳桿菌、棒狀乳桿菌、戊糖乳桿菌、唾液乳桿菌以及Iwatensis乳桿菌。其中發(fā)酵前期的優(yōu)勢菌群為乳酸乳球菌和戊糖乳桿菌，而植物乳桿菌為發(fā)酵中后期的優(yōu)勢菌種。

酸菜；變性梯度凝膠電泳；多樣性指數(shù)；乳酸菌；系統(tǒng)發(fā)育樹

酸菜作為我國東北地區(qū)一種獨(dú)特的傳統(tǒng)乳酸蔬菜發(fā)酵制品，具有悠久的歷史，其以營養(yǎng)豐富、酸鮮脆嫩、解膩開胃等特點(diǎn)深受廣大群眾的喜愛。酸菜自然發(fā)酵汁液中富含乳酸菌活菌，近年來由于乳酸菌特殊的生理活性和營養(yǎng)功能，日益受到人們的重視[1-2]。很多研究學(xué)者對乳酸菌進(jìn)行分離鑒定，但研究方法現(xiàn)在仍多沿用形態(tài)特征、生理生化反應(yīng)等傳統(tǒng)方法，該方法不僅實(shí)驗(yàn)周期長，而且不能對分離物種精確的鑒定、不能反映分離物間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、更不能獲得微生物多樣性的真正概貌，缺乏全面性、準(zhǔn)確性及可靠性[3-5]。自1993年Muyzer等[6]首次將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denatured gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）引入微生物生態(tài)學(xué)領(lǐng)域以來，該技術(shù)已成為研究微生物遺傳多樣性和種群結(jié)構(gòu)及其菌群差異的一種先進(jìn)手段?，F(xiàn)已廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域，如監(jiān)測食品微生物在時間及空間上的動態(tài)變化[7-9]、鑒定功能微生物和病原菌[10-12]、評價和控制食品質(zhì)量[13-14]等。本實(shí)驗(yàn)采用PCR-DGGE分子生物學(xué)技術(shù)，結(jié)合16S rDNA同源性分析及生物信息學(xué)手段，對傳統(tǒng)自然發(fā)酵酸菜中乳酸菌進(jìn)行全面系統(tǒng)研究，揭示不同時期的乳酸菌菌落結(jié)構(gòu)的真實(shí)狀態(tài)，挖掘豐富的微生物資源并確定不同發(fā)酵階段的優(yōu)勢菌群，旨在為進(jìn)一步深入研究和開發(fā)分離自然發(fā)酵酸菜中有益乳酸菌提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大白菜、食鹽 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)貿(mào)市場。

Marker 寶生物工程（大連）有限公司；DNA提取試劑盒 美國Mo-Bio公司；PCR引物以及所用酶試劑北京寶杰羅生物科技有限公司；PMD19-T載體 日本TaKaRa公司。

1.2 儀器與設(shè)備

5804R高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；DYY-8C型穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀 上海越磁電子科技有限公司；PCR擴(kuò)增儀、變性梯度凝膠電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)、DcodeTM的基因突變檢測系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)前處理

酸菜腌制過程：大白菜（去除黃葉、腐爛葉）→晾曬→開水漂燙（3～5 min）→入缸、壓實(shí)→加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的淡鹽水在室溫條件下進(jìn)行自然發(fā)酵，發(fā)酵時間為60 d。根據(jù)酸菜的傳統(tǒng)發(fā)酵工藝進(jìn)行自然發(fā)酵，分別采集酸菜第3、6、9、12、15、18、21、25、30、35、40、50、60天的發(fā)酵液（每組取3 個平行）作為研究對象，將采集的樣品用無菌紗布過濾以去除發(fā)酵液中的雜質(zhì)，并保存于－20 ℃，備用。

1.3.2 樣品中總DNA的提取

將酸菜發(fā)酵液在－4 ℃，12 000 r/min條件下離心5 min，棄上清取沉淀，用DNA提取試劑盒提取樣品中總DNA。

1.3.3 PCR擴(kuò)增

以提取的總DNA為模板，采用16S rDNA V3區(qū)通用引物：338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′；GC-534R：5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGG GGCGGGGGCACGGGGGG（ATTACCGCG GCT GCTGG）-3′，進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長約250 bp。采用50 μL擴(kuò)增體系，包括：10hPCR Buffer 5 μL、dNTP Mixture（各2.5 mmol/L）4 μL、引物338F（20 μmol/L）1 μL、引物534R（20 μmol/L）1 μL、模板DNA2.5 ng、TaKaRa rTaq酶（5 U/μL）0.25 μL、ddH2O補(bǔ)至50 μL。反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min（每個循環(huán)降低0.1 ℃），72 ℃延伸90 s，最終72 ℃延伸10 min，共30 個循環(huán)。PCR反應(yīng)的產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測[15]。

1.3.4 DGGE與條帶測序

采用Bio-Rad公司DcodeTM的基因突變檢測系統(tǒng)對樣品DNA的PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行變性梯度凝膠電泳。采用的凝膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%，變性范圍為30%～60%，電泳條件為150 V，420 min[16]。電泳結(jié)束后采用銀染進(jìn)行染色，將銀染好的凝膠用掃描儀成像，得到PCR-DGGE圖譜，并對特征性條帶進(jìn)行切膠，條帶回收，回收的條帶進(jìn)行一次無GC-夾板的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增子與PMD19-T載體連接進(jìn)行克隆，每個條帶隨機(jī)挑取3 個陽性克隆進(jìn)行測序分析，將其菌液送北京寶杰羅生物科技有限公司測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

將酸菜發(fā)酵液微生物群落DNA的PCR-DGGE圖譜用Gel-Pro Analyzer 4.5軟件進(jìn)行處理，通過分析樣品電泳條帶的數(shù)目和亮度，來計算樣品中微生物多樣性指數(shù)和菌種相對數(shù)量的多少。根據(jù)各樣品在DGGE圖譜中的信息對其相似性進(jìn)行聚類分析。其公式如下[17]。

式中：H為香農(nóng)指數(shù)；D為豐富度指數(shù)；Ni為樣品DGGE圖譜中第i條條帶強(qiáng)度；N為該樣品條帶總強(qiáng)度；EH為均勻度指數(shù)；S為某個樣品中所有條帶數(shù)目的總和。

測得的序列登錄美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST同源性對比分析（http://www.ncbi.nlm. nih.gov/BLAST/）。采用Mega 4.1軟件進(jìn)行分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析親緣關(guān)系及相似性。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌16S rDNA 的V3區(qū)PCR擴(kuò)增

細(xì)菌16S rDNA 的V3區(qū)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后得到的電泳圖見圖1。以338F和534R為引物的擴(kuò)增產(chǎn)物大小在250 bp左右位置，判斷其為目的片段。

圖1 酸菜樣品16S rDNA的V3區(qū)的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of 16S rDNA from sauerkraut samples

2.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物DGGE圖譜分析

圖2 酸菜樣品細(xì)菌總DNA的DGGE圖譜Fig.2 DGGE profile of PCR-amplified 16S rDNA （V3） fragments from bacteria in sauerkraut samples

DGGE電泳條帶的多少可以直觀地反映樣品中細(xì)菌菌落的遺傳多樣性，而條帶的亮度則在一定程度上反映該種細(xì)菌數(shù)量的多少[18]。從整個圖譜（圖2）結(jié)果來看，不同時期的發(fā)酵液具有較豐富的細(xì)菌多樣性。發(fā)酵前期條帶數(shù)量較少，而發(fā)酵中后期條帶數(shù)量有所增加，說明隨著發(fā)酵時間的延長，微生物數(shù)量與種類也發(fā)生了一定的變化。如泳道1在所有泳道中條帶數(shù)量最少，且條帶亮度較弱，表明酸菜在發(fā)酵第3天時細(xì)菌種類較少。隨著發(fā)酵時間變化，圖譜條帶數(shù)目、各條帶的強(qiáng)度和遷移率均存在一定程度的差異，表明不同發(fā)酵時期的優(yōu)勢菌群各不相同。如條帶1強(qiáng)度最高，且在泳道3至泳道14中均發(fā)現(xiàn)條帶1，表明該條帶所對應(yīng)的菌為酸菜發(fā)酵中后期的優(yōu)勢菌群，在發(fā)酵過程中起主導(dǎo)作用。

2.3 細(xì)菌種群多樣性指數(shù)分析

根據(jù)電泳圖譜中每條條帶的信息，對各樣品中的細(xì)菌多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)和均勻度指數(shù)指標(biāo)進(jìn)行了綜合分析。由表1可知，不同時期樣品中細(xì)菌種群的香農(nóng)多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)都有較大的差異。第3、6天樣品的多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)較高可能是由于發(fā)酵前期原料引入的雜菌較多所致，之后隨著乳酸菌數(shù)量的增加抑制了某些雜菌的生長，使其數(shù)值保持相對穩(wěn)定，而第40天時達(dá)到最高值，分別為3.457和6.077，表明此時細(xì)菌種群多樣性最高。這個結(jié)果與DGGE圖譜的直觀觀測結(jié)果相符。

表1 不同樣品細(xì)菌種群的多樣性指數(shù)、均勻度指數(shù)及豐度指數(shù)Table 1 Bacterial diversity indexes of sauerkraut samples

2.4 DGGE指紋圖譜聚類分析

圖3 酸菜發(fā)酵液中細(xì)菌的DGGE指紋圖譜聚類分析Fig.3 Cluster analysis of DGGE profiles for bacteria communities of sauerkraut

在DGGE指紋圖譜中，不同樣品共有條帶數(shù)目的多少可以反映不同樣品之間細(xì)菌群落相似性，通過計算群落相似性系數(shù)得到細(xì)菌群落之間差異的信息。聚類分析類群的劃分顯示出不同酸菜樣品中細(xì)菌組成之間的相似性和親緣關(guān)系。由圖3可知，圖中橫軸代表差異率，該值越小表明細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)的相似性越高。總體上看，所有樣品之間的差異率較低，表明各樣品細(xì)菌的種群結(jié)構(gòu)均有較高的相似性。酸菜發(fā)酵前9 d（編號1～3）的差異率約為0.023，即其同源性為97.7%；發(fā)酵第12～35天（編號4～11）的同源性約為98.1%；而發(fā)酵第40～60天（編號12～14）的同源性約為96.6%。由此可以看出酸菜在每個發(fā)酵階段具有極為相似細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)。

2.5 酸菜樣品中乳酸菌PCR-DGGE條帶測序結(jié)果分析

切取酸菜樣品細(xì)菌16S rDNA的PCR-DGGE圖譜中18 個優(yōu)勢條帶，對其編號、切割、回收重新擴(kuò)增、克隆后測序。并登錄NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST同源性對比分析，比對結(jié)果如表2。采用鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，自展數(shù)（Boot Strap）為1 000（圖4）。

表2 酸菜樣品中乳酸菌PCR-DGGE條帶測序結(jié)果Table 2 Sequencing results for lactic acid bacterial PCR-DGGE bands

所有序列與數(shù)據(jù)庫中16S rDNA序列的相似性在99%～100%之間，根據(jù)NCBI比對結(jié)果，從自然發(fā)酵酸菜液中分離的乳酸菌屬于乳桿菌屬、乳球菌屬，其中乳桿菌屬為主要優(yōu)勢菌屬，包括植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、棒狀乳桿菌（Lactobacillus coryniformis）、戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）、唾液乳桿菌（Lactobacillus salivarius）以及Iwatensis乳桿菌。發(fā)酵前期的優(yōu)勢菌群為L. lactis和L. pentosus，而L. plantarum為發(fā)酵中后期的優(yōu)勢菌種。自20世紀(jì)90年代開始，許多研究學(xué)者們開始對酸菜發(fā)酵過程中微生物進(jìn)行研究[19]。通過傳統(tǒng)分離培養(yǎng)與形態(tài)學(xué)鑒定相結(jié)合方法已從發(fā)酵體系中檢出分離到的常見乳酸菌包括L. plantarum、L. brevis、稍小乳桿菌（Lactobacillus minor）、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）、L. rhamnosus、耐酸乳桿菌（Lactobacillus acetotolerans）、L. casei和L. harbinensis等[20-22]。通過傳統(tǒng)分離與分子生態(tài)學(xué)技術(shù)鑒定相結(jié)合的方法研究發(fā)現(xiàn)，所分離的乳酸菌由乳桿菌屬、片球菌屬、明串珠菌屬和魏斯氏菌屬構(gòu)成[23]。所鑒定的乳桿菌屬包括L. plantarum、L. brevis、羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）和清酒乳桿菌（Lactobacillus sakei）、彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）、腸膜明串珠菌屬（Leuconostoc mesenteroides）、L. fermentum等[24-25]。本研究中發(fā)現(xiàn)的L. coryniformis、L. salivarius、L. pentosus、L. iwatensis在自然發(fā)酵酸菜中利用傳統(tǒng)方法和分子生態(tài)學(xué)方法均并未分離到。

圖4 酸菜中乳酸菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of lactic acid bacteria in sauerkraut

由圖4可知，條帶2-2與L. brevis具有較高的親緣關(guān)系，序列相似性達(dá)98%；條帶15-2與L. casei有較高的親緣關(guān)系，序列相似性為100%；條帶10-3、8-1與L. lactis有較高的親緣關(guān)系，序列相似性為100%；條帶1-2、17-2、3-2、12-1與L. plantarum和L. pentosus屬于一類群，3-1、2-1、15-1、7-1與L. iwatensis、L. rhamnosus、L. coryniformis、L. salivarius屬于一類群。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用16S rDNA結(jié)合PCR-DGGE技術(shù)對自然發(fā)酵酸菜發(fā)酵液中乳酸菌進(jìn)行了多樣性研究，結(jié)果表明，在酸菜發(fā)酵第40天時細(xì)菌多樣性指數(shù)以及豐富度指數(shù)達(dá)最大值，分別為3.457和6.077，表明此時細(xì)菌種群多樣性最高；所測序列與乳酸菌已知16S rDNA V3區(qū)序列的相似性高達(dá)99%～100%；同時酸菜發(fā)酵過程中含有豐富乳酸菌，主要的優(yōu)勢菌群為乳桿菌屬，其中發(fā)酵前期的優(yōu)勢菌群為L. lactis和L. pentosus，L. plantarum為發(fā)酵中后期的優(yōu)勢菌種。本研究中發(fā)現(xiàn)的L. coryniformis、L. salivarius、L. pentosus、L. iwatensis在自然發(fā)酵酸菜中利用傳統(tǒng)方法和分子生態(tài)學(xué)方法均并未分離到。這些結(jié)果直觀展現(xiàn)出傳統(tǒng)自然發(fā)酵酸菜中乳酸菌的多樣性，為發(fā)掘優(yōu)良乳酸菌發(fā)酵劑以及實(shí)現(xiàn)發(fā)酵酸菜產(chǎn)業(yè)的規(guī)?；?、標(biāo)準(zhǔn)化提供了理論支持。

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PCR-DGGE Analysis of Lactic Acid Bacteria Diversity of Chinese Traditional Sauerkraut in Northeast China

CONG Min, LI Xinwei, WU Junrui, YUE Xiqing*
(College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161, China)

The traditional Chinese sauerkraut obtained by natural fermentation was analyzed by polymerase chain reactiondenatured gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE) to monitor the dynamic change of lactic acid bacteria during the fermentation process. Meanwhile, the bacterial diversity index was calculated, and the representative bands were cloned and selected to be sequenced for the construction of a phylogenetic tree based on their sequences. The results indicated that the highest bacterial species diversity was found on the 40thday of fermentation. Lactic acid bacteria was abundant during the fermentation process, and lactobacillus was the dominant population, including Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei, Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus salivarius, and Lactobacillus iwatensis. Lactococcus lactis and Lactobacillus pentosus were the predominant lactic acid bacteria in the early stage of fermentation, while Lactobacillus plantarum was the predominant strain in the middle and late stages.

Chinese sauerkraut; denatured gradient gel electrophoresis (DGGE); diversity index; lactic acid bacteria; phylogenetic tree

10.7506/spkx1002-6630-201607015

TS201.3

A

1002-6630（2016）07-0078-05

叢敏, 李欣蔚, 武俊瑞, 等. PCR-DGGE分析東北傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜中乳酸菌多樣性[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(7): 78-82. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607015. http://www.spkx.net.cn

CONG Min, LI Xinwei, WU Junrui, et al. PCR-DGGE analysis of lactic acid bacteria diversity of Chinese traditional sauerkraut in northeast China[J]. Food Science, 2016, 37(7): 78-82. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201607015. http://www.spkx.net.cn

2015-07-01

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31370502）；國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）項(xiàng)目（2011AA100902）

叢敏（1991—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)閯游镄允称芳庸?。E-mail：731716246@qq.com

*通信作者：岳喜慶（1966—），男，教授，博士，研究方向?yàn)閯游镄允称芳庸?。E-mail：yxqsyau@126.com