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        基于指紋圖譜的生物體系中藥內(nèi)稟品質(zhì)等級(jí)的數(shù)理理論判別

        2016-11-14 08:39:32
        世界中醫(yī)藥 2016年9期
        關(guān)鍵詞:指紋圖譜提取物

        鄒 華 彬

        (山東大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院,濟(jì)南,250100)

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        中藥研究

        基于指紋圖譜的生物體系中藥內(nèi)稟品質(zhì)等級(jí)的數(shù)理理論判別

        鄒華彬

        (山東大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院,濟(jì)南,250100)

        品質(zhì)等級(jí)理論;生物信息論;十全大補(bǔ)丸;指紋圖譜;模式識(shí)別;鑒別

        多年來對(duì)中醫(yī)藥的持續(xù)深入思考及系統(tǒng)研究,作者認(rèn)為中醫(yī)藥現(xiàn)代研究可初步歸結(jié)為以下幾大核心科學(xué)問題:1)中藥內(nèi)稟品質(zhì)及品質(zhì)等級(jí)理論判別;2)中藥有效成分的精確判別;3)人體病證分子層次的系統(tǒng)精確診斷;4)人體疾病產(chǎn)生發(fā)展的分子層次機(jī)制;5)中藥藥性物質(zhì)及其治療疾病的分子層次的系統(tǒng)機(jī)制。中藥品質(zhì)精確判別又是其他幾個(gè)核心問題的基礎(chǔ)。

        中藥治療疾病的最直接的物質(zhì)基礎(chǔ)是其中所含有的各類化學(xué)成分。由于受到內(nèi)在基因變異、環(huán)境條件變化及加工、保存技術(shù)方法等諸多因素的影響,其品質(zhì)及療效都會(huì)顯著地發(fā)生變化。中藥復(fù)方由多味中藥材組成,這可能會(huì)導(dǎo)致不同廠家的同一配伍組成的中藥復(fù)方的品質(zhì)具有比單味藥材更加顯著的變化范圍。

        中藥的同一成分針對(duì)不同的疾病一般具有多效性,因此,目前法定采用一種或幾種成分的含量來評(píng)價(jià)中藥的質(zhì)量[1],無法得到準(zhǔn)確的質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果。

        中藥存在著客觀的品質(zhì)等級(jí)。為了保證中藥的品質(zhì)及其臨床治療疾病的有效性、藥理研究的可靠性,建立生物體系品質(zhì)及品質(zhì)等級(jí)的數(shù)理理論對(duì)中藥品質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析判別,是中醫(yī)藥現(xiàn)代研究的核心課題之一,具有極其重要的理論意義及應(yīng)用價(jià)值。

        目前中藥品質(zhì)等級(jí)研究可分為2個(gè)方面,1)中藥材品質(zhì)等級(jí),目前主要是依據(jù)品種、產(chǎn)地、尺寸、多種宏觀性狀及單位質(zhì)量藥材所包含的個(gè)數(shù)來確定其品質(zhì)等級(jí)[2-4],這些外觀性狀不能準(zhǔn)確反映中藥的內(nèi)在品質(zhì)。生物效價(jià)法亦用于研究不同產(chǎn)地的中藥材的品質(zhì)[5-6]。2)中藥復(fù)方品質(zhì)等級(jí)研究,利用液相色譜指紋圖譜及人為主觀確定的參數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)對(duì)不同廠家的復(fù)方進(jìn)行品質(zhì)等級(jí)研究,難以保證準(zhǔn)確反映其品質(zhì)的實(shí)際差異[7]。無論是中藥材還是中藥復(fù)方,目前尚缺乏品質(zhì)等級(jí)數(shù)理基礎(chǔ)理論的研究。

        中藥品質(zhì)評(píng)價(jià)研究的發(fā)展趨勢(shì)是發(fā)展符合中藥內(nèi)稟生物學(xué)特性規(guī)律的數(shù)理方法,基于中藥自身可以反映內(nèi)在品質(zhì)的全成分含量及結(jié)構(gòu)信息,獲取能夠無偏代表其品質(zhì)特征的量化指標(biāo),擺脫主觀經(jīng)驗(yàn),實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥品質(zhì)的無偏評(píng)價(jià)。關(guān)于十全大補(bǔ)丸的鑒別及質(zhì)量評(píng)價(jià)研究主要采用HPLC[7-11]、TLC[12]法或毛細(xì)管電泳法[13]測(cè)定其中的一種或幾種成分含量。

        生物代謝物及次生代謝物指紋圖譜反映了其品質(zhì)信息,指紋峰的穩(wěn)定性與其品質(zhì)的穩(wěn)定性直接相關(guān)。對(duì)中藥指紋圖譜的系統(tǒng)深入研究表明,紅外、色譜、磁共振成像及紫外指紋圖譜中的峰位信息較峰高度或峰面積信息,更能準(zhǔn)確反映中藥的品種品質(zhì)信息,可以基于此類信息構(gòu)建生物體系內(nèi)稟品質(zhì)等級(jí)理論。

        本研究提出并建立生物體系內(nèi)稟品質(zhì)等級(jí)理論。包括2個(gè)步驟,首先根據(jù)作者建立的相同品質(zhì)中藥的系統(tǒng)理論判別方法[14],在品種品質(zhì)層次上實(shí)現(xiàn)對(duì)不同中藥品種的精確鑒別分類,再依據(jù)分子層次性狀穩(wěn)定性與品質(zhì)穩(wěn)定性直接相關(guān)的生物基本性質(zhì),建立了以分子層次性狀頻率為自變量的生物體系品質(zhì)描述函數(shù)及不同品質(zhì)等級(jí)的數(shù)理標(biāo)準(zhǔn)。

        補(bǔ)中益氣丸和十全大補(bǔ)丸皆由10種中藥組方,且2者有5種主要的藥材相同,這使其鑒別及質(zhì)量控制較困難。本研究測(cè)試了不同中藥廠家生產(chǎn)的22個(gè)十全大補(bǔ)丸及9個(gè)補(bǔ)中益氣丸樣品的氯仿提取物的紅外指紋圖譜,對(duì)兩類組成非常相似的中藥復(fù)方品種進(jìn)行了精確鑒別,正確識(shí)別率為100%,然后基于中藥品質(zhì)等級(jí)數(shù)理理論分析了樣品的指紋圖譜數(shù)據(jù)并進(jìn)行了品質(zhì)等級(jí)理論判別。結(jié)果表明,不同廠家的22個(gè)樣品在理論上皆為優(yōu)級(jí)品(脂溶性提取物),但他們存在小的差異。

        1 中藥品質(zhì)等級(jí)數(shù)理理論的建立

        根據(jù)指紋圖譜峰頻率建立中藥品質(zhì)等級(jí)數(shù)理理論及標(biāo)準(zhǔn)。

        1.1基于中藥內(nèi)在品質(zhì)對(duì)中藥進(jìn)行精確鑒別分類根據(jù)作者博士期間獨(dú)立提出及建立的中藥質(zhì)量控制多維指紋圖譜共有峰率和變異峰率雙指標(biāo)序列分析法(簡(jiǎn)稱雙指標(biāo)序列分析)[15-16],及后來建立的雙指標(biāo)信息理論方程[17]。

        I=PglnPg+PalnPva+PblnPvb

        建立了相同品質(zhì)中藥的系統(tǒng)理論判別方法[14],在中藥的品種品質(zhì)層次進(jìn)行精確鑒別分類。

        1.2建立中藥品質(zhì)描述函數(shù)在基于生物體系內(nèi)稟品質(zhì)規(guī)律對(duì)中藥品種進(jìn)行精確鑒別的基礎(chǔ)上,根據(jù)同品種樣品的指紋圖譜構(gòu)建中藥品質(zhì)描述函數(shù),表示如下:q=q(f1,f2,f3,…,fi),(1),其中q是品質(zhì)函數(shù);f1,f2,f3,…,fi:同品種的不同中藥樣品中,每個(gè)指紋峰出現(xiàn)的頻率。fi的值越高,說明該指紋峰出現(xiàn)的機(jī)會(huì)越多,該指紋峰對(duì)應(yīng)的分子或分子結(jié)構(gòu)越能反映樣品的品質(zhì)特性。反之,fi的值越低,說明該指紋峰出現(xiàn)的機(jī)會(huì)越少,越不能反映中藥的品質(zhì)特性。頻率較高部分的指紋峰群可以反映并代表中藥的品質(zhì)特性。

        以此建立的理論分析方法,對(duì)品質(zhì)描述函數(shù)q=q(f1,f2,f3,…,fi)進(jìn)行分析。對(duì)于使中藥品質(zhì)描述函數(shù)q(f1,f2,f3,…,fi)發(fā)生顯著變化的fk,說明在該頻率前后,中藥品質(zhì)發(fā)生顯著地變化且品質(zhì)不同。根據(jù)不同的中藥品質(zhì)突變頻率,建立不同中藥品質(zhì)等級(jí)的頻率邊界值及頻率范圍,如下所示:Fj,j=1,2,…,F(xiàn)1>F2>F3,…(3)j代表中藥品質(zhì)等級(jí),F(xiàn)1,F(xiàn)2,…,分別對(duì)應(yīng)于第一、第二、…,品質(zhì)等級(jí)的頻率邊界值。作者的理論分析表明(另有專文待發(fā)表該理論),不同品質(zhì)等級(jí)的指紋峰頻率參數(shù)。見表1。

        表1 生物體系不同品質(zhì)等級(jí)的頻率分布

        1.4建立中藥品質(zhì)等級(jí)的理論判別標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)(1.3)中建立的不同品質(zhì)等級(jí)的頻率邊界值:Fj,j=1,2,…,在相同品種中藥的指紋圖譜中,確定fj≥F1的指紋峰組,作為該中藥的優(yōu)級(jí)品質(zhì)特征峰群,fj≥F2的指紋峰組,作為該中藥的良級(jí)品質(zhì)特征峰群,j越大,說明品質(zhì)越低。

        另外,由于生物生長(zhǎng)過程中及加工過程的隨機(jī)波動(dòng)性,同屬于一個(gè)等級(jí)的不同樣品所具有的該等級(jí)品質(zhì)的指紋峰數(shù)也會(huì)發(fā)生一定的變化,在何種變化范圍內(nèi)的樣品屬于同一等級(jí)。根據(jù)反映生物內(nèi)在本質(zhì)特性的雙指標(biāo)信息理論方程[17],依據(jù)其得到的相同品質(zhì)生物體系的理論標(biāo)準(zhǔn)是它們的指紋圖譜相似度Pg≥61%[14],該指標(biāo)可以作為生物體系相同品質(zhì)等級(jí)的理論判別標(biāo)準(zhǔn)。不同品質(zhì)等級(jí)個(gè)體樣品的理論判別規(guī)則建立如下。

        在各品質(zhì)等級(jí)中,判別標(biāo)準(zhǔn)Pg=61%~100%,顯示出同一理論品質(zhì)等級(jí)中的樣品還是存在品質(zhì)的較寬分布范圍。若將各品質(zhì)等級(jí)的范圍細(xì)分為2個(gè)區(qū)間,Pg=61%~80%,Pg=81%~100%,可以合理精細(xì)地表征每個(gè)樣品的品質(zhì)等級(jí),不同品質(zhì)等級(jí)細(xì)化標(biāo)準(zhǔn)表示。見表2。

        表2 細(xì)化品質(zhì)等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

        品質(zhì)等級(jí)判別的順序是:依次進(jìn)行優(yōu)級(jí)、良級(jí)、中級(jí)、合格級(jí)判別。這些品質(zhì)等級(jí)具有排它等級(jí)性。

        2 材料與方法

        2.1儀器美國(guó)NICOLET-5700-FT-IR傅立葉變換紅外光譜儀,光譜范圍:4 000 cm-1~ 400 cm-1,分辨率4 cm-1。高速粉碎機(jī),紫外分光光度計(jì)(UV-240,日本島津),分析天平(精確度0.001 g)。

        2.2中藥樣品及試劑三氯甲烷(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司,A.R.)。十全大補(bǔ)丸樣品:蘭州太寶制藥有限公司S1,S2(生產(chǎn)日期2007.07.24,批號(hào)59071123);北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠S3,S4(2006.12.04,6034209);S5~S9(2008.01.09,8030955);河南宛西制藥股份有限公司S10~S12(2003.09.22,030901);S13,S14(2006.04.29,060402);S15,S16(2007.07.14,070701);S17,S18(2007.07.31,070702);S19,S20(2007.08.23,070801);S21,S22(2008.03.15,080301)。補(bǔ)中益氣丸樣品:湖北瑞藥藥業(yè)有限公司S23,S24(2006.10.07,061001),馬鞍山神鹿科瑞有限公司S25(2007.05.28,20070545),S26(2008.01.05,20080108);蘭州太寶制藥有限公司S27(2007.05.28,83071462),S28(2007.06.14,83071463);湖北清達(dá)藥業(yè)科技有限公司S29(2005.03.19,050302),S30(2006.03.16,060301);北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司S31(2007.04.10,7080264)。

        2.3最佳提取條件采用索氏提取器加60 mL氯仿回流提取十全大補(bǔ)丸0.5 g粉末中脂溶性成分,最佳提取時(shí)間為1.5 h。

        2.4測(cè)試樣品的制備及測(cè)試條件每個(gè)樣品平行稱取3份粉末,2.00 g/份,得3份提取物,每份提取物平行測(cè)量3次,共得9個(gè)指紋圖譜,取其中每組共有峰的平均波數(shù)構(gòu)成各個(gè)樣品的組合指紋圖譜,作為十全大補(bǔ)丸品質(zhì)等級(jí)分析的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。方法同文獻(xiàn)[21]。

        2.5重復(fù)性及穩(wěn)定性試驗(yàn)十全大補(bǔ)丸樣品氯仿提的紅外指紋圖譜具有良好的重復(fù)性及穩(wěn)定性。

        3 紅外指紋圖譜及十全大補(bǔ)丸品質(zhì)等級(jí)分析

        3.1十全大補(bǔ)丸及補(bǔ)中益氣丸氯仿提取物紅外指紋圖譜十全大補(bǔ)丸及補(bǔ)中益氣丸氯仿提取物紅外指紋圖譜見圖1。

        圖1 十全大補(bǔ)丸及補(bǔ)中益氣丸氯仿提取物紅外指紋圖譜疊加圖

        注:3 400 cm-1處,由下到上依次為十全大補(bǔ)丸S1,S3,S5,S10,S15,S21,補(bǔ)中益氣丸S31,S29,S27,S25,S23。

        由圖1可知,十全大補(bǔ)丸與補(bǔ)中益氣丸氯仿提取物的紅外指紋圖譜具有高度的相似性及復(fù)雜性,難以直觀區(qū)分它們,需要采用數(shù)理理論來加以精細(xì)分析。根據(jù)共有峰及變異峰的理論判別法-Shaprio-Wilk W檢驗(yàn)判別法,來確定不同樣品紅外指紋圖譜中的共有峰及變異峰。

        3.2十全大補(bǔ)丸與補(bǔ)中益氣丸品種精確鑒別分類根據(jù)相同品質(zhì)中藥的系統(tǒng)理論判別方法[14],基于內(nèi)在品質(zhì)規(guī)律而不是外觀性狀對(duì)十全大補(bǔ)丸及補(bǔ)中益氣丸進(jìn)行了精確分類,在Pg≥58%(根據(jù)相同品質(zhì)中藥的系統(tǒng)理論判別方法,相同品質(zhì)中藥的相似度范圍x≤Pg≤100,x=58%~64%),31個(gè)樣品的特征序列如下,樣品的正確識(shí)別率為100%。

        十全大補(bǔ)丸的特征序列

        S1:(S1)aS2S21 S22b

        S2:S1(S2)S15 S10

        S3:(S3)S4 S5 S6 S7S8 S9 S12 S13 S14

        S4:S3(S4)S5 S6 S7 S8 S9 S12 S13 S14

        S5:S3 S4(S5)S6 S7 S8 S9 S11 S12 S13 S14 S15 S16 S21 S22

        S6:S3 S4 S5(S6)S7 S8 S9S12 S13 S14

        S7:S6 S3 S4 S5(S7)S9 S8 S13 S12 S14

        S8:S3 S4 S5 S6 S7(S8)S9 S11 S12 S13 S14 S15 S16 S17 S19 S21 S22

        S9:S3 S4 S5 S6 S7 S8(S9)S11 S12 S13 S15 S16

        S10:(S10)S12 S14 S15 S16 S19 S20 S21 S22

        S11:S5 S8 S9(S11)S12 S13 S14 S15 S19 S21 S22

        S12:S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11(S12)S13 S14 S15 S16 S20 S19 S21 S22

        S13:S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S11 S12(S13)S14 S15 S16 S20 S21 S22

        S14:S3 S4 S5 S6 S7 S8 S10 S11 S12 S13(S14)S15 S16 S20 S21 S22

        S15:S5 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14(S15)S16 S19 S20 S21 S22

        S16:S5 S8 S9 S10 S12 S13 S14 S15(S16)S20 S21 S22

        S17:S8(S17)S18 S19 S21 S22

        S18:S17(S18)S19 S21 S22

        S19:S8 S10 S11 S12 S15 S17 S18(S19)S20 S21 S22

        S20:S10 S12 S13 S14 S15 S16 S19(S20)S21 S22

        S21:S5 S8 S10 S11 S12 S13 S14 S15 S16 S17 S18 S19 S20(S21)S22

        S22:S5 S8 S10 S11 S12 S13 S14 S15 S16 S17 S18 S19 S20 S21(S22)

        補(bǔ)中益氣丸的特征序列

        S23:(S23)S24 S31

        S24:S23(S24)

        S25:(S25)S26 S29

        S26:S25(S26)S27 S28

        S27:S26(S27)S28

        S28:S26 S27(S28)

        S29:S25(S29)S30

        S30:S29(S30)

        S31:S23(S31)

        a.S1:(S1)aS2,S1的特征序列,其中S1屬于自身的最相似樣品,構(gòu)成其特征序列的成分,其他樣品各自構(gòu)成自身特征序列的成分。b.S21 S22.是緊鄰S1特征序列的非特征序列樣品,它們的Pg<58%,因S21S22與S1S2同屬于十全大補(bǔ)丸,這說明S1S2與S3~S22,確實(shí)屬于同類,但特征序列體現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2個(gè)組成非常相似的中藥品種的特征序列之間沒有交疊,十全大補(bǔ)丸S1~S22的特征序列完全由S1~S22構(gòu)成,而補(bǔ)中益氣丸S23~S31的特征序列完全由S23~S31構(gòu)成,實(shí)現(xiàn)理想的分類模式識(shí)別。

        3.3十全大補(bǔ)丸品質(zhì)等級(jí)數(shù)理理論分析結(jié)果根據(jù)本文建立的中藥品質(zhì)等級(jí)數(shù)理理論分析方法,對(duì)3個(gè)不同廠家的22個(gè)十全大補(bǔ)丸樣品的氯仿提取物的紅外指紋圖譜進(jìn)行分析。各個(gè)共有吸收峰波數(shù)對(duì)應(yīng)的峰頻率見表3。

        表3 十全大補(bǔ)丸氯仿提取物的紅外指紋圖譜峰對(duì)應(yīng)的頻率

        根據(jù)表3的數(shù)據(jù),可以計(jì)算平均頻率=8.92,標(biāo)準(zhǔn)偏差Sf=8.06,由此得不同品質(zhì)等級(jí)樣品的頻率邊界及范圍。及其對(duì)應(yīng)的指紋峰。見表4。

        表4 十全大補(bǔ)丸不同品質(zhì)等級(jí)樣品指紋峰頻率區(qū)間及其對(duì)應(yīng)的指紋峰群

        表5 十全大補(bǔ)丸樣品不同品質(zhì)等級(jí)指紋峰頻率及品質(zhì)等級(jí)

        根據(jù)雙指標(biāo)信息理論方程[17],可以推出,當(dāng)2個(gè)樣品的相似度Pg≥61%,2個(gè)樣品具有相同的品質(zhì)。根據(jù)這一理論結(jié)果,建立公式(4)~(7),可以判斷每個(gè)樣品的質(zhì)量等級(jí)。十全大補(bǔ)丸樣品優(yōu)、良、中級(jí)及合格等不同品質(zhì)等級(jí)指紋峰頻率f優(yōu),f良,f中,f合格及樣品的品質(zhì)等級(jí),根據(jù)表2中確定的品質(zhì)等級(jí)細(xì)化判別規(guī)則,22個(gè)十全大補(bǔ)丸的品質(zhì)等級(jí)判別結(jié)果見表5。

        表5分析結(jié)果顯示,雖然S1,S2與S3~S22有微小的差異,3個(gè)廠家生產(chǎn)的22個(gè)十全大補(bǔ)丸產(chǎn)品,皆為優(yōu)級(jí)品,說明3個(gè)廠家產(chǎn)品具有優(yōu)良的穩(wěn)定性,品質(zhì)一致性。根據(jù)表2,則可將S1,S2 2個(gè)樣品確定為優(yōu)級(jí)-,而S3~S22確定為優(yōu)級(jí)+,這也與它們的特征序列具有一定的差異相吻合。

        4 結(jié)論

        本研究建立的生物體系內(nèi)稟品質(zhì)等級(jí)數(shù)理理論,實(shí)現(xiàn)了中藥生物體系品質(zhì)等級(jí)的嚴(yán)謹(jǐn)理論判別,突破了幾千年來中藥品質(zhì)等級(jí)確定只能依賴于經(jīng)驗(yàn)知識(shí)及主觀規(guī)定的局限性。該理論方法的每個(gè)環(huán)節(jié)都基于嚴(yán)謹(jǐn)?shù)睦碚摶A(chǔ),因而對(duì)中藥品質(zhì)等級(jí)的理論判別結(jié)果具有科學(xué)合理性。建立的基于指紋圖譜峰頻率的品質(zhì)等級(jí)描述方法,具有一定的創(chuàng)新性。該方法理論上適用于所有種類的生物體系,包括中藥材、中藥復(fù)方品質(zhì)等級(jí)的理論分析,為解決中藥品質(zhì)的客觀精確定量評(píng)價(jià)問題探索了一條新的可行路徑。該理論方法確定的優(yōu)級(jí)品質(zhì)分子性狀亦可以作為生物體系的特征標(biāo)記群,用于生物體系的快速準(zhǔn)確定性鑒別。

        致謝:本研究論文的部分原始數(shù)據(jù)采自作者2007級(jí)碩士研究生董鳳娟的畢業(yè)論文。

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        (2015-10-12收稿責(zé)任編輯:徐穎)

        Fingerprint Spectra-based Mathematical Theory in Determining the Intrinsic Quality Grade of Biological System of Chinese Medicine

        Zou Huabin

        (School of Chemistry and Chemical Engineering of Shandong University, Jinan 250100, China)

        Quality grade theory; Biological information theory; Shiquan Dabu pills; Fingerprint spectra; Pattern Recognition; Identification

        山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào):2013-157)

        鄒華彬,博士,副教授,碩士研究生導(dǎo)師,研究方向:中藥鑒別及質(zhì)量評(píng)價(jià)理論方法學(xué)研究,E-mail:huabinzou@126.com

        R286.0

        A doi:10.3969/j.issn.1673-7202.2016.09.060

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