吳淑馨　孫宏峰　龍泓竹　張　力　田文楊　白　穎　叢佳林　楊曉暉

(北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京，100078)

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益消方對自發(fā)糖尿病小鼠血清和心肌組織IGF-1表達的影響

吳淑馨孫宏峰龍泓竹張力田文楊白穎叢佳林楊曉暉

(北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京，100078)

目的：觀察益消方對KKAy糖尿病小鼠血清和心肌組織IGF-1表達的影響，探討其對糖尿病心肌保護的可能機制。方法：選用KKAy小鼠及C57BL/6J小鼠，隨機分為正常組、模型組和中藥組，分別灌服蒸餾水及益消方中藥，在實驗的4、8、12周取材后，運用ELISA的方法檢測血清中IGF-1的表達，運用實時定量PCR的方法檢測心肌組織IGF-1 mRNA的表達。結(jié)果：在實驗的不同階段，與正常組相比，KKAy糖尿病小鼠模型組的血清及心肌組織中IGF-1的表達明顯降低(P<0.01)，而與模型組相比，中藥組的血清IGF-1在第8周和第12周表達明顯升高(P<0.05)。心肌組織的IGF-1 mRNA在第12周表達有升高的趨勢。結(jié)論：益消方可通過改善血清及心肌組織中IGF-1的表達，從而對自發(fā)糖尿病小鼠的心肌具有一定的保護作用。

糖尿病心肌病;益消方;KKAy;IGF-1

糖尿病心肌病(Diabetic Cardiomyopathy,DCM)是糖尿病的心血管并發(fā)癥之一，是獨立于高血壓、心臟瓣膜疾病、冠心病及其他心臟病因素所導致的心臟結(jié)構(gòu)和功能異常[1]。大量研究表明糖尿病心肌病是影響糖尿病患者生活質(zhì)量和危害生命的最重要并發(fā)癥之一，已成為糖尿病患者的主要死亡原因之一[2]，因此，早期干預顯得尤為重要。糖尿病心肌病在中醫(yī)學屬于“消渴病心病”范疇，其基本病理基礎(chǔ)是無形之痰與瘀血相互膠結(jié)所致的心內(nèi)微型癥結(jié)，楊曉暉教授以“益氣消癥散結(jié)”為治則，創(chuàng)制“益消方”，該方在臨床上對改善糖尿病心肌病患者的癥狀有一定的作用。本研究試圖通過觀察該方對自發(fā)糖尿病小鼠血清及心肌組織IGF-1表達的影響，探討其對糖尿病動物心肌保護的可能機制。

1　材料與方法

1.1動物及分組健康雄性C57BL/6J小鼠40只及KKAy小鼠80只，均為10～12周齡(許可證號：SCXK京2009-0007及SCXK京2009-0004)，購自中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所。飼養(yǎng)環(huán)境為室溫(21±1)℃、相對濕度30%～40%，通風自然，自由飲水，適應性飼養(yǎng)1周后，測血糖，80只KKAy小鼠測隨機血糖均≥13.9 mmol/L，符合糖尿病的診斷標準。

將80只KKay小鼠隨機分為模型組和中藥組，C57BL/6J小鼠為正常對照組，各組小鼠均為40只。

1.2給藥方法分組后給藥，灌胃量根據(jù)人與小鼠間的體表面積折算系數(shù)計算，經(jīng)計算，小鼠給藥劑量為20.2 g/kg體重，即中藥組予20.2 g/kg體重灌服“益消方”中藥，模型組及正常組予20.2 g/kg體重的劑量灌服蒸餾水，每組分別在4、8、12周末取材10只小鼠。留取血清做ELISA，留取心肌組織做RT-PCR。

1.3藥物及試劑益消方處方由黃芪等中藥組成，方中藥材購自東方醫(yī)院中藥房。IGF-1 ELISA檢測試劑盒(美國abcam公司，批號ab100695)；RT-PCR試劑盒(Promega公司,批號M6101)

1.4血清中IGF-1的測定采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)，分別設(shè)空白孔、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測樣品10 μL，經(jīng)過溫育、洗滌、加酶、再次溫育、洗滌、顯色，450 nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。

1.5心肌組織IGF-1的測定采用實時定量PCR方法檢測心肌組織IGF-1 mRNA的表達。取約50 mg心肌組織使用Trizol法提取心肌組織總RNA，測定總RNA的濃度和純度。引物設(shè)計后由上海生工生物公司合成引物。見表1。RT總體積：20 μL，反應條件：70 ℃預變性5 min，25 ℃退火5 min，42 ℃延伸60 min，70 ℃失活5 min，PCR總體積：20 μL，反應條件：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，延伸72 ℃ 30 s共40個循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。計算IGF-1與β-actin mRNA比值。

表1　IGF-1與β-actin引物序列

2　結(jié)果

2.1各組小鼠一般情況的觀察實驗期間，與正常組小鼠相比，KKAy小鼠的體型較大，體重增加明顯，飲水飲食較多，呈腹型肥胖，慵懶遲鈍，對抓取反抗不明顯，多次尾尖測血糖法測定血糖均>13.9 mmol/L，在12周的實驗期內(nèi)，血糖水平持續(xù)高于13.9 mmol/L，符合2型糖尿病的特征及血糖標準。

2.2各組小鼠血清中IGF-1的檢測結(jié)果如表2所示，與正常組比較，從第4周開始，模型組及中藥組小鼠血清IGF-1水平已明顯降低，在實驗的各個階段(第4、8、12周)差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，在第8周和第12周時，中藥組與模型組IGF-1的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；在第4周時，2組相比無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2　各組小鼠血清IGF-1的比較

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01，與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

表3　各組小鼠心肌組織IGF-1與β-actin mRNA比值的比較

2.3實驗末(第12周)各組小鼠心肌組織中IGF-1 mRNA的檢測結(jié)果由表3中可看出，在實驗的第12周，各組相比，心肌組織的IGF-1無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但從均數(shù)可看出，中藥組與模型組相比，有一定的上升趨勢。

3　討論

糖尿病心肌病的發(fā)生和發(fā)展是多因素所致，以舒張功能不全為主要表現(xiàn)，由于舒張功能障礙和心肌硬度增加最終可導致心力衰竭[3]，其主要病理特點是心肌間質(zhì)及血管周圍纖維化。心肌間質(zhì)纖維化是指心肌成纖維細胞過度增生從而導致細胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix，ECM)大量沉積而形成的病理演變。胰島素樣生長因子-1(IGF-1)是胰島素家族的分子量大約為7500kDa的一類多肽，在心、腎、腦、肺等都可合成并分泌，主要由肝臟合成，其主要作用是促進組織生長發(fā)育和參與機體代謝活動，IGF-1在心臟等多個器官中有表達，對于心臟生長、發(fā)育和舒縮功能的調(diào)節(jié)都有重要作用，還參與了新生心肌纖維的增殖，在成熟心肌細胞中也具有加強心肌纖維生長、促進發(fā)育的功能[4]。IGF-1還可以通過多種信號轉(zhuǎn)導通路影響血管張力，特別是交感神經(jīng)系統(tǒng)和RAS系統(tǒng)的相互作用[5]。IGF-1通過減弱P53功能，可以減少AngII產(chǎn)生及其受體ATl的激活，阻止心肌細胞死亡[6]，給予外源性IGF-I治療可以改善糖尿病動物的心肌細胞收縮障礙，IGF-I在糖尿病心肌病的心肌纖維化和發(fā)展中起著重要的作用[7]，糖尿病小鼠在造模成功后的第30天就可以有心肌細胞的凋亡，IGF-1是降低的[8]，可以說IGF-1是心血管的一個保護因子。IGF-1具有抑制細胞凋亡、促進心肌細胞增殖、增加心肌細胞數(shù)目、抗心肌纖維化從而起到對心臟的保護作用[9]，還可能影響到心肌細胞膜上鈣離子通道，改變細胞內(nèi)鈣的濃度而改善心臟收縮功能[10]。血糖控制和IGF-1之間亦存在密切關(guān)系，血糖控制越差，IGF-1水平越低[7]。

中醫(yī)藥防治DCM具有優(yōu)勢，并有顯著的療效，中醫(yī)認為本病屬于“消渴病心病”范疇。在古代文獻、臨床觀察和現(xiàn)代實驗研究的基礎(chǔ)上，楊曉暉教授提出了“心絡微型癥瘕”理論，認為糖尿病心臟并發(fā)癥是在氣血陰陽失調(diào)基礎(chǔ)上，出現(xiàn)心氣、心陰、心血、心陽不足和虛衰，導致氣滯、血瘀、痰濁、寒凝等痹阻心脈，瘀、痰、濁日久化熱，形成痰郁熱瘀，并相互膠結(jié)，阻于心之絡脈，初聚在氣，為聚散無常之“瘕”，久積在血，積而不散，瘀結(jié)于絡脈，為有形可征之“癥”，形成心絡微型癥瘕。其基本病機是氣陰兩虛、痰瘀互結(jié)、心脈痹阻。無形之痰與瘀血相互膠結(jié)于心之絡脈是心內(nèi)微型癥結(jié)的病理基礎(chǔ)，針對“心絡微型癥瘕”這一關(guān)鍵病機，以“益氣消癥散結(jié)”為治則，創(chuàng)制“益消方”，益消方在治療DCM有明顯療效，前期實驗研究發(fā)現(xiàn)，早期使用“益消方”可降低血糖、糾正脂肪代謝紊亂、改善微循環(huán)，減輕糖尿病動物的心肌壞死程度，縮小壞死范圍，減輕心肌纖維間RAS陽性物質(zhì)的沉積，減輕心肌細胞超微結(jié)構(gòu)的損傷[11]。

本研究使用ELISA法檢測了糖尿病小鼠血清中IGF-1的表達，從實驗結(jié)果可看出，在不同時間點(實驗的第4周、8周和12周)，模型組和中藥組的IGF-1水平與正常組相比均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，從整體趨勢看，IGF-1水平均有隨著時間而增長的趨勢，但模型組增幅更加明顯，在第8周和12周，模型組和中藥組的IGF-1水平相比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，均較模型組有明顯下降。使用實時定量PCR的方法檢測了糖尿病小鼠心肌組織中IGF-1mRNA的表達，在實驗的第12周，各組相比，心肌組織的IGF-1無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但從均數(shù)可看出，中藥組與模型組相比，有一定的上升趨勢。通過該研究我們發(fā)現(xiàn)，益消方可通過改善血清及心肌組織中IGF-1的表達，對自發(fā)糖尿病小鼠的心臟具有一定的保護作用，為臨床使用該方干預糖尿病心肌病提供了實驗依據(jù)。

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(2016-08-15收稿責任編輯：洪志強)

Effect of Yi Xiao Decoction on IGF-1 in Mice of Diabetic Myocardial Disease

Wu Shuxin,Sun Hongfeng,Long Hongzhu,Zhang Li,Tian Wenyang,Bai Ying,Cong Jialin,Yang Xiaohui

(Department of Endocrinology，Dongfang Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100078,China)

Objective:To study the protective effect of “Yi Xiao Decoction” on serum and myocardial tissue of KKAy mice model，and discuss the possible mechanisms of its diabetic myocardial protection.Methods:The KKAy and C57BL/6J mice were randomly divided into the model group，normal group and the TCM group.The mice in different groups were administered distilled water and Yi Xiao Decoction，respectively by gavage.Specifically，the TCM group was fed with Yi Xiao Decoction，while the model group and the normal group were given distilled water.The expression of IGF-1 in serum was detected by ELISA，and expression of IGF-1 mRNA expressions in myocardia by RT-PCR after 4,8,12 weeks′ treatment.Results:In the different stages of the experiment，compared with the normal group，the expression of IGF-1 in serum and tissues in diabetic KKAy mice decreased significantly in the model group(P<0.01)，and compared with the model group，the expression of serum IGF-1 in TCM group in 8th weeks and 12th weeks increased significantly(P<0.05).The expression of mRNA IGF-1 in cardiac muscle tissue increased in 12th weeks.Conclusion:Yi Xiao Decoction can improve IGF-1 expression in serum and myocardial tissues and protect cardiac muscle tissue of the diabetic mice model.

Diabetic cardiomyopathy； Yi Xiao Decoction； KKAy； IGF-1

高等學校博士學科點專項科研基金博導類(編號:20110013110004);北京中醫(yī)藥大學自主選題項目中青年教師類(編號：2015-JYB-JSMS126)

吳淑馨(1984.10—)，女，主治醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)藥防治糖尿病及并發(fā)癥，E-mail:15120039753@163.com

楊曉暉(1968.02—),男,博士,教授、主任醫(yī)師,博士研究生導師,研究方向:中醫(yī)藥防治糖尿病及并發(fā)癥,E-mail:yxh0616@126.com

R285.5

A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.09.052