黃彩梅　夏亦冬　胡國華

(1 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院，上海，200071； 2 上海市長寧區(qū)婦幼保健院，上海，200051)

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紫草素對子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞雌激素信號通路表達(dá)的影響

黃彩梅1,2夏亦冬1胡國華1

(1 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院，上海，200071； 2 上海市長寧區(qū)婦幼保健院，上海，200051)

目的：觀察紫草素對子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞雌激素信號通路表達(dá)的影響。方法：Ishikawa細(xì)胞體外培養(yǎng)，經(jīng)1、3、5M紫草素及相應(yīng)濃度紫草素中分別加入雌激素10 nM，處理細(xì)胞后，用MTT法分別檢測治療24 h、48 h、72 h后Ishikawa細(xì)胞生長抑制率；Western-blot及RT-PCR法檢測雌激素信號通路ERα、CyclinD1、c-myc蛋白表達(dá)情況及ERα基因的表達(dá)情況。結(jié)果：顯示隨著紫草素作用濃度的增加及干預(yù)時間的延長，Ishikawa細(xì)胞抑制率明顯上升；紫草素作用于子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞24 h后，ERα、CyclinD1、c-myc蛋白表達(dá)下降，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但是ERαmRNA表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)意義，與空白對照組比較(P>0.05)。結(jié)論：紫草素隨著濃度的增加及作用時間的延長，能夠顯著抑制Ishikawa細(xì)胞的增殖；紫草素通過抑制雌激素信號通路中ERα、CyclinD1、c-myc蛋白表達(dá)，起到抑制子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖的作用。

紫草素；子宮內(nèi)膜癌；雌激素信號通路；Ishikawa細(xì)胞

子宮內(nèi)膜癌(Endometrial Cancer，EC)是女性常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，在發(fā)達(dá)國家，該病目前已接近新發(fā)婦科惡性腫瘤的50%[1]。根據(jù)EC的病因、病理及生物學(xué)行為，臨床常將EC分為Ⅰ和Ⅱ 2種類型。其中70%～80%的散發(fā)EC屬于Ⅰ型癌，為雌激素依賴型EC[2]。孕激素治療是主要的內(nèi)分泌治療措施。但調(diào)查顯示,超過30%的早期患者對孕激素不敏感或在孕激素治療過程中產(chǎn)生孕激素抵抗,為子宮內(nèi)膜癌患者的激素治療帶來困難[3]。紫草素是從天然紫草中提取的萘醌類化合物，有研究表明新疆紫草素能誘導(dǎo)生殖系腫瘤細(xì)胞凋亡，從而抑制其體外增殖[4]。另有研究表明紫草素具有抑制雌激素受體陽性乳腺癌中雌激素依賴性基因翻譯的作用[5]。先前的研究表明紫草素具有通過PI3K/AKT信號通路誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞凋亡的作用[6]。本研究進(jìn)一步探索紫草素對子宮內(nèi)膜癌雌激素受體陽性Ishikawa細(xì)胞增殖及雌激素信號通路的影響。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞株雌激素受體陽性子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株：Ishikawa細(xì)胞(豐有吉教授贈予)。

1.2試劑與試藥紫草素(干燥粉末，純度>98%，中國藥品生物制品檢定所)，用5%二甲基亞砜(DMSO)幫助溶解，配制成濃度為1 mg/mL溶液，-20 ℃保存?zhèn)溆茫瑢?shí)驗(yàn)時將紫草素溶液稀釋到需要的濃度。DMEM培養(yǎng)基(GIBCO公司)；胎牛血清、胰酶(Sigma公司)；Cyclin D1、c-myc(cst公司)；ERa(abcam公司)；羊抗兔HRP標(biāo)記二抗、羊抗鼠HRP標(biāo)記二抗(碧云天生物有限公司)；引物由英俊生物科技有限公司合成。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器酶標(biāo)儀(美國BIOTEK公司)；倒置顯微鏡(Olympus公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(德國Heraeus)；Western blot電泳系統(tǒng)、化學(xué)發(fā)光儀(Bio-Rad公司)；電轉(zhuǎn)儀(大連競邁科技有限公司)；實(shí)時熒光定量PCR儀(美國ABI7500型號)；高速低溫離心機(jī)(德國EPPENDORF公司)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1細(xì)胞培養(yǎng)Ishikawa細(xì)胞株生長于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，放置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

1.4.2實(shí)驗(yàn)分組紫草素濃度參照前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果[6]，將實(shí)驗(yàn)分為空白組(只含細(xì)胞培養(yǎng)液)；治療組5組：紫草素的濃度分別為(1、3、5 μM紫草素)；對照組4組分別為雌二醇+紫草素(雌激素10 nM、紫草素1 μM+雌激素10 nM、紫草素3 μM+雌激素10 nM、紫草素5 μM+雌激素10 nM)。

1.4.3MTT法以每孔約5×103每孔接種到96孔培養(yǎng)板孔內(nèi)，每組設(shè)5個平行孔,培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞貼壁，細(xì)胞接近80%融合，吸棄培養(yǎng)液，用含0.2%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液靜止24 h，依據(jù)實(shí)驗(yàn)要求加藥。加藥后，繼續(xù)分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后每孔加入20 μL的5 mg/mL MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h。每孔加入二甲亞楓150 μL，輕輕震蕩，10 min后在490 nm波長處用酶標(biāo)儀測OD值，并計算增殖率，增殖率=(A實(shí)驗(yàn)-A對照)/A對照。每個濃度設(shè)5個重復(fù)孔。

1.4.4Western blot檢測Ishikawa細(xì)胞株接種于培養(yǎng)皿中，各組加入相應(yīng)終濃度紫草素或雌二醇，作用細(xì)胞24 h后，提取總蛋白。BCA蛋白定量法檢測蛋白濃度，取PBS、各樣品10 μL，加DW990 μL，灌膠上樣，電泳分離，轉(zhuǎn)PVDF膜，5%BSA封閉，一抗4 ℃孵育過夜，選擇合適的二抗室溫孵育60 min，顯色，混合等體積化學(xué)發(fā)光劑AB液，與PVDF膜共孵育1 min；放射自顯影：放入Bio-Rad化學(xué)發(fā)光儀檢測結(jié)果。

1.4.5RT-PCR檢測取對數(shù)生長期的Ishikawa細(xì)胞株接種于10 cm的培養(yǎng)皿中，加入含終濃度為0、1、3、5 μM的紫草素，作用細(xì)胞24 h后，提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s，共40個循環(huán)。GAPDH上游引物：5′-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3′；下游引物：5′-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3′。

2　結(jié)果

2.1紫草素對Ishikawa細(xì)胞增殖的影響MTT結(jié)果顯示，不同濃度的紫草素對Ishikawa細(xì)胞的增殖均有抑制作用，隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長，抑制增殖的作用越明顯。雌激素對Ishikawa細(xì)胞有促進(jìn)增殖作用，但在含有雌激素的培養(yǎng)液中逐漸增加紫草素，抑制增殖的作用顯著。見表1。

表1　紫草素不同濃度及作用時間對子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞株生長抑制作用

注：△與空白組比較P<0.05；☆與SK3UM組比較P<0.05；□與SK3UM+E10組比較P<0.05◆與24 h比較<0.01。

2.2Western blot檢測雌激素信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

2.2.1ERα、cyclinD1蛋白的表達(dá)分別用紫草素(1,3,5 μM)濃度組作用Ishikawa細(xì)胞，結(jié)果隨著紫草素濃度的增加，ERα蛋白的表達(dá)呈下降趨勢，與空白組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與紫草素低濃度組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；CyclinD1蛋白的表達(dá)隨紫草素濃度的上升呈下降趨勢，與空白組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與紫草素低濃度組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、表2。

圖1　不同濃度紫草素作用Ishikawa細(xì)胞24 h后，ERα及cyclinD1表達(dá)情況

組別ERαcyclinD1空白對照組1537±01423108±0577紫草素濃度組1μM1218±0710■1760±0364■3μM0960±0090■▲0750±0582■▲5μM0584±0057■▲0529±0330■▲

注：■與空白組比較P<0.05；▲與紫草素Ⅰ組比較P<0.05。

2.2.2紫草素對cyclinD1、 c-myc蛋白表達(dá)的影響Ishikawa細(xì)胞分別進(jìn)行空白對照組、Ⅰ組：雌激素10 nM、Ⅱ組：SK3 μM、Ⅲ組：雌激素10 nM+SK3 μM作用后用Western blot法檢測cyclinD1蛋白表達(dá)：雌激素組與空白對照組比較無差異，無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，單純紫草素組及紫草素與雌激素混合組與空白組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，單純雌激素組與單純紫草素組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；單純雌激素組與紫草素、雌激素混合組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；雌激素對Ishikawa細(xì)胞c-myc蛋白的表達(dá)無影響，與空白對照組比較，無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，紫草素促進(jìn)Ishikawa細(xì)胞c-myc蛋白的表達(dá)下降，與空白組比較，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，雌激素加紫草素混合培養(yǎng)Ishikawa細(xì)胞c-myc蛋白的表達(dá)也下降，與空白對照組比較，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；但與單純紫草素組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與單純雌激素組比較c-myc蛋白的表達(dá)下降有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2、表3。

圖2　Ishikawa細(xì)胞經(jīng)紫草素、雌激素或聯(lián)合作用24 h后cmyc及cyclinD1表達(dá)情況

組別cmycCyclinD1空白對照組1023±02741857±0527Ⅰ組0775±01401750±0608Ⅱ組0609±0944★0881±0198★●Ⅲ組0510±0109★●0703±0138★●

注：★與空白組比較P<0.05；●與Ⅰ組比較P<0.05。

2.3RT-PCR檢測紫草素對Ishikawa細(xì)胞中ERαmRNA的表達(dá)情況本實(shí)驗(yàn)將紫草素(1,3,5 μM)分別干預(yù)Ishikawa細(xì)胞24 h后，用RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)Ishikawa細(xì)胞中ERα mRNA表達(dá)與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

圖3　經(jīng)紫草素治療24 h后Ishikawa細(xì)胞ERα mRNA表達(dá)情況

3　討論

EC占女性生殖道惡性腫瘤20%～30%，其中近80%為與雌激素依賴密切相關(guān)的子宮內(nèi)膜樣腺癌，為Ⅰ型EC[7]。經(jīng)典通路認(rèn)為雌激素主要通過與細(xì)胞內(nèi)雌激素受體(Estrogen Receptor，ER)結(jié)合調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的作用[8]。ER、PR的缺失與細(xì)胞惡性程度上升、侵襲性增加有關(guān)[9]。對于Ⅰ型EC的發(fā)生與ERα的表達(dá)密切相關(guān)[10]。有研究表明子宮內(nèi)膜的慢性炎性反應(yīng)，引起巨噬細(xì)胞增多，巨噬細(xì)胞分泌的炎性反應(yīng)因子通過上調(diào)ERα的表達(dá)，增加雌二醇對子宮內(nèi)膜癌的增殖作用[11]。

《神農(nóng)本草經(jīng)》記載，紫草，味苦、性寒，入心、肝經(jīng)，具有清熱涼血、活血、解毒透疹之功。其有效成分紫草素可通過抑制類固醇硫酸酯酶減少雌激素合成，從而抑制MCF-7細(xì)胞的生長[12]。前期研究表明紫草素有抑制子宮內(nèi)膜癌生長的作用[6]，紫草素誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞凋亡，其凋亡機(jī)制可能與促進(jìn)Bax表達(dá)，抑制Bcl2表達(dá)相關(guān)[13]。本研究進(jìn)一步探索紫草素抑制雌激素受體陽性子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞的作用機(jī)制。用MMT法檢測發(fā)現(xiàn)紫草素對Ishikawa細(xì)胞的抑制作用顯著。

內(nèi)、外源性雌激素對子宮內(nèi)膜的長期刺激是子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的重要誘因，雌激素特定的受體ER在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[14]。有研究發(fā)現(xiàn)從正常子宮內(nèi)膜到癌變的子宮內(nèi)膜，隨著病理分級、臨床分期的增高，ER、PR含量逐漸遞減,ER、PR的缺乏是子宮內(nèi)膜癌惡性程度增高的表現(xiàn)[15]。而本研究發(fā)現(xiàn)隨著紫草素作用時間的延長及濃度的增加，Western Blot檢測顯示ERα的蛋白表達(dá)下降，但是RT-PCR檢測顯示對ERαmRNA表達(dá)無顯著差異。本研究結(jié)果與Yuan等研究紫草素具有抑制雌激素受體陽性乳腺癌ERα蛋白翻譯的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致[5]。說明紫草素通過對雌激素受體ERα的靶向作用可能抑制EC的生長，其原因有待進(jìn)一步研究探索。

CyclinD1與腫瘤發(fā)生有著密切的關(guān)系，是雌激素基因組應(yīng)答途徑的效應(yīng)蛋白之一[16]。有研究顯示子宮內(nèi)膜癌患者的內(nèi)膜組織中CyclinD1蛋白表達(dá)明顯高于正常對照組，提示CyclinD1蛋白可能成為子宮內(nèi)膜癌侵襲的篩查指標(biāo)[17]。本研究表明隨著濃度的增加，紫草素對子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞CyclinD1蛋白表達(dá)有明顯抑制作用，雌激素對子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞CyclinD1蛋白表達(dá)沒有抑制作用。

作為雌激素受體靶基因之一c-Myc，是通過過表達(dá)、基因高度擴(kuò)增或重排參與腫瘤的形成過程[18]。Cheng等[19]認(rèn)為 c-Myc在雌激素介導(dǎo)的雌激素受體轉(zhuǎn)錄中起重要作用。有研究表明c-Myc蛋白引起的細(xì)胞周期調(diào)控異常在EC發(fā)病中為重要的分子事件[20]。雌激素對子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞c-Myc蛋白表達(dá)無影響，紫草素能抑制子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞c-Myc蛋白的表達(dá)。

綜上所述，紫草素通過抑制ERα、CyclinD1、c-Myc蛋白表達(dá)，起到抑制子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖的作用。為紫草素成為防治子宮內(nèi)膜癌的基因靶向治療藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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(2015-11-12收稿責(zé)任編輯：張文婷)

Effect of Shikonin on Endometrial Cancer Ishikawa Cells Expression of Estrogen Signal Pathway

Huang Caimei1,2，Xia Yidong1，Hu Guohua1

(1 Shanghai Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200071,China；2 ShanghaiChangningMaternity&InfantHealthHospital，Shanghai200051,China)

Objective:To observe the effect of shikonin on endometrial cancer Ishikawa cells expression of estrogen signal pathway.Methods:Ishikawa cells cultured in vitro，after 1，3，5 μM Shikonin and the corresponding concentrations of shikonin were added 10 nm estrogen，MTT method were used to detect Ishikawa cells growth inhibition rate after 24，48，72 hours of treatment； Western blot and RT PCR method were applied to detect estrogen signaling pathway in ER alpha，cyclin D1，c-myc protein expression and ER alpha gene expression.Results:As shikonin concentration increased and intervention time extended，Ishikawa cell inhibition rate increased significantly； After 24 hours of shikonin intervention on Ishikawa endometrial cancer cells，ER alpha，CyclinD1，c-myc protein expression decreased，and the difference between the groups had statistical significance(P<0.05).But ER mRNA expression had no statistical difference，compared with the control group(P>0.05).Conclusion:As the concentration increased and time extended，shikonin significantly inhibited the proliferation of Ishikawa cells； through inhibiting the expression of ER alpha，cyclinD1 and c-myc protein expression，it prevented the endometrial carcinoma Ishikawa cell proliferation.

Shikonin； Endometrial cancer； Estrogen signaling pathway； Ishikawa cell

上海市衛(wèi)計委科研基金課題(編號：20134118)；上海市衛(wèi)生局進(jìn)一步加快中醫(yī)藥事業(yè)發(fā)展三年行動計劃項(xiàng)目“海派朱氏婦科流派傳承研究”(編號：ZY3-CCCX-1-1013)；上海市中醫(yī)藥事業(yè)發(fā)展三年行動計劃項(xiàng)目“胡國華上海市名老中醫(yī)學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)研究工作室”(編號：ZYSNXD-CC-MZY050)；上海市長寧區(qū)科委基金項(xiàng)目(編號：CNKW2015Y14)

黃彩梅(1981.01—)，女，博士,主治醫(yī)師，醫(yī)師，研究方向：主攻婦科內(nèi)分泌疾病中醫(yī)調(diào)理，E-mail:amycmhuang@aliyun.com

胡國華(1952.12—)，男，碩士，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，教授，研究方向：主攻中醫(yī)不孕癥治療,E-mail:hgh0083@163.com

R285.5

A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.09.051