趙彬，張敏，張付海，田丙正，王鑫

（安徽省環(huán)境監(jiān)測中心站，合肥 230071）

盤式固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法快速測定環(huán)境水樣中3種微囊藻毒素

趙彬，張敏，張付海，田丙正，王鑫

（安徽省環(huán)境監(jiān)測中心站，合肥 230071）

建立盤式固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜（UPLC-MS-MS）快速測定環(huán)境水樣中3種微囊藻毒素（MCs）的方法。環(huán)境水樣經過盤式固相萃取柱凈化，采用Waters BEH C18色譜小柱，以乙腈-0.2%甲酸水溶液為流動相，梯度洗脫分離后，UPLC-MS-MS多級監(jiān)測正離子模式下外標法進行定性定量分析。3種微囊藻毒素在0.05～10.0 μg/L范圍內呈現(xiàn)良好線性關系，相關系數均大于0.999 4，方法檢出限為0.02 ng/L。對同一環(huán)境樣品進行0.1，1.0，5.0 μg/L 3種濃度的加標回收試驗，平均回收率為82.8%～108.8%，測定結果的相對標準偏差為2.1%～10.1%（n=6）。該方法快速、靈敏、準確，可有效應用于環(huán)境水樣中微囊藻毒素的監(jiān)測。

盤式固相萃取柱；超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法；環(huán)境水樣；微囊藻毒素

微囊藻毒素（MCs）是藍藻死亡過程中釋放的一種水溶性肝毒素和神經毒素，目前已經有80多種不同結構的MCs得到鑒定，其中存在最為普遍、含量相對較多的是MC-LR，MC-RR，MC-YR［1-2］。近年來世界上淡水湖泊藍藻爆發(fā)頻率增加，巢湖做為我國第五大淡水湖，每年藍藻不時爆發(fā)。為了更好地監(jiān)測微囊藻毒素對巢湖地區(qū)生態(tài)環(huán)境的影響，建立這類物質的快速、靈敏和準確的監(jiān)測方法尤為重要。

目前測定微囊藻毒素的方法主要有生物化學法［3-4］、酶聯(lián)免疫檢測法［5］、高效液相色譜法［6-8］和液相色譜-質譜聯(lián)用法［9-11］等。生物化學法選擇性較差，靈敏度不夠，只能測定毒素總量，無法分別測定不同種類毒素的含量。酶聯(lián)免疫法假陽性出現(xiàn)幾率大，且重現(xiàn)性差。液相色譜法則因環(huán)境水樣基質復雜、背景干擾多等因素而不易用于定性，容易出現(xiàn)假陽性。液相色譜-質譜串聯(lián)法檢測能更好地應對基質復雜、存在背景干擾的樣品監(jiān)測要求。環(huán)境水樣品的前處理方法主要液-液萃取、加速溶劑萃?。ˋSE）、固相小柱萃?。⊿PE）等。目前選擇盤式固相萃取方法對環(huán)境水樣進行處理鮮有報道。

筆者比較了直接進樣、固相小柱萃取和盤式固相萃取法3種方法，最終建立了盤式固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜快速測定環(huán)境水樣中3種微囊藻毒素的方法。該方法檢出限低，快速、靈敏、準確，可有效應用于環(huán)境水樣的實際監(jiān)測。

1　實驗部分

1.1主要儀器與試劑

超高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀：Waters TQ-S型，美國Waters公司；

Masslynx4.1工作站：美國Waters公司；

膜盤萃取儀：Sepaths-6型，美國LabTech公司；

盤式固相萃取膜盤：C18，Φ47 mm，美國Waters公司；

固相萃取柱：C18，Φ47 mm，美國Waters公司；

定量平行濃縮儀：MultiVap-8型，北京萊伯泰科公司；

超純水制備儀：Millipore Milli-Q Integral15型，美國Millipore公司；

有機濾頭：0.22 μm，美國Waters公司；

MC-LR，MC-RR ，MC-YR標準物質：純度不小于99.9%，德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；

二氯甲烷、甲醇、乙腈：農殘級，美國Merk公司；

無水硫酸鎂：優(yōu)級純，中國國藥集團；

實驗室用水為Milli-Q純水系統(tǒng)制備的超純水。

1.2樣品的采集與保存

采集河流水樣儲存于5 L棕色玻璃采樣瓶中，用甲酸調至pH小于2，加入0.01～0.02 g抗壞血酸除去殘余氯，于4℃冷藏保存，24 h內分析。

1.3樣品前處理

盤式固相萃?。红o置水樣30 min以上，使其自然沉降。然后取上層水樣500 mL于萃取瓶中，加入0.5 mL甲酸，用盤式固相萃取膜盤萃取。

膜盤萃取條件：用10 mL甲醇潤洗，10 mL超純水平衡5 min，水樣流量約為50 mL/min，用10 mL甲醇-水（體積比為1∶10）凈化，抽至近干后，用15 mL甲醇-0.2%甲酸溶液（體積比為9∶1）洗脫。加入0.5 g無水硫酸鎂除水。洗脫液用濃縮氮吹儀于40℃下以乙腈-0.2%甲酸溶液（體積比為1∶4）分多次轉換溶劑定容至1 mL。用0.22 μm有機濾頭過濾，待測。

1.4儀器工作條件

1.4.1超高效液相色譜條件

色譜柱：Waters BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國Waters公司）；流動相：A為乙腈，B為水-0.2%甲酸溶液，采用線性梯度洗脫，洗脫條件見表1；流動相流量：0.4 mL/min；樣品溫度：10℃；色譜柱溫：40℃；檢測器：串聯(lián)四級桿質譜儀；進樣體積：5 μL。

表1　液相色譜線性梯度洗脫條件

1.4.2質譜條件

采用電噴霧離子源（ESI）正離子模式進行檢測，監(jiān)測模式為多級反應監(jiān)測模式（MRM）；噴射電壓：1.5 kV；源溫度：150℃；脫溶劑氣溫度：450℃，流量為800 L/h；錐孔氣流量：150 L/h；錐孔電壓和碰撞能見表2。

表2　MRM分析條件

2　結果與討論

2.1樣品前處理條件的優(yōu)化

2.1.1樣品凈化方法的選擇

目前環(huán)境水樣的前處理方式多采用液-液萃取、超聲萃取、固相小柱萃取等方法。

直接進樣可以避免樣品前處理過程帶來的目標物損失，但是不能應對復雜基質干擾；液-液萃取和超聲萃取操作繁瑣，基質復雜的環(huán)境樣品難以有效除去雜質，且會消耗大量有機試劑，對環(huán)境造成二次污染；加速溶劑萃取不能用于含水量過高的樣品；固相小柱萃?。⊿PE）大體積水樣操作時間過長且易發(fā)生小柱過載；而盤式固相萃取法具有固相小柱萃取凈化效果好的優(yōu)點，能夠快速萃取大體積水樣，消耗有機試劑少，操作自動化程度高，簡單易操作。因此選取盤式固相萃取柱法為樣品的前處理方法。

2.1.2洗脫液及其用量的選擇

影響固相萃取效果的主要因素有洗脫劑類型及其用量等。對于極性樣品，甲醇、乙腈等親水性有機溶劑作為常用洗脫劑被廣泛應用。對不同洗脫劑進行試驗，結果表明，用甲醇-0.2%甲酸溶液洗脫效果最佳。在甲醇中添加不同濃度的甲酸溶液（0.05%，0.1%，0.2%，0.3%，0.4%）進行試驗，結果表明，MC-RR和MC-LR的回收率明顯改善，但隨著甲酸濃度的增加MC-YR的回收率有所下降，原因可能是加入甲酸后，微囊藻毒素在酸性環(huán)境下多肽質子化，同時也減少了其和硅膠表面硅醇基之間的相互作用，使其更容易被洗脫。最終選擇甲醇-0.2%甲酸溶液（體積比為9∶1）為洗脫液。

2.2色譜及質譜條件的優(yōu)化

2.2.1色譜條件的優(yōu)化

分別比較不同類型的反相色譜柱（Waters BEH C18，Waters HSS T3，Waters HSS C8）對待測物質的色譜分離效果。結果表明，MC-RR，MC-YR和MC-LR在Waters BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）上獲得了理想的分離效果。

甲醇和乙腈是液相色譜常用的流動相?？疾炝思状?水和乙腈-水流動相體系對目標物離子化程度的影響，發(fā)現(xiàn)乙腈-水為流動相時，儀器響應值高于甲醇-水流動相。由于目標物的基本結構是7個氨基酸組成的單環(huán)多肽，在正離子電離模式下溶液中能夠電離出H+，所以在流動相中適當加入酸性物質可以促進目標物的電離，從而獲得較高的離子化效率。選擇0.2%甲酸溶液作為流動相進行試驗，并獲得了最佳結果。選擇梯度洗脫方式，優(yōu)化流動相梯度洗脫條件，在5 min內實現(xiàn)了目標化合物的快速分離測定。

2.2.2質譜條件的優(yōu)化

根據微囊藻毒素具有多肽質子化的化學電離性質，選用正電離模式（ESI+），采用蠕動泵直接進樣進行質譜條件優(yōu)化。根據CAC和EU第657/2002 /EEC號決議有關規(guī)定，選擇兩對離子監(jiān)測MRM。通過儀器自帶軟件Masslynx4.1的自動優(yōu)化軟件IntelliStart，對目標物的錐孔電壓、碰撞能、定量離子和輔助定性離子進行了優(yōu)化和確定。MC-LR，MC-YR和MC-RR的MRM色譜圖見圖1。

2.3標準曲線、線性范圍及檢出限

將標準儲備液用流動相稀釋成6種不同濃度的系列標準溶液（0.05，0.1，0.5，1，5，10 μg/L），按實驗方法測定。以標準溶液的質量濃度為橫坐標，對應色譜峰面積為縱坐標進行線性回歸，得線性回歸方程及相關系數。根據HJ 168-2010方法檢出限計算公式MDL=t（n-1，0.99）S，重復空白試驗7次，計算得各組分的檢出限，結果見表3。

圖1　MC-RR、MC-YR和MC-LR的MRM色譜圖

表3　線性方程及檢出限

2.4回收試驗與精密度

對一實際環(huán)境水樣品（未檢出目標物）進行添加回收試驗，樣品分別添加低、中、高（0.1，1.0，5.0 μg/L）3個濃度的標準溶液，每個添加濃度平行測定6次，并計算其相對標準偏差?；厥赵囼灱熬芏仍囼灲Y果見表4。由表4可知，該方法具有較高的準確度和良好的精密度。

表4　種目標物的相對標準偏差和回收率（n=6）

3　結語

建立了盤式固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用技術同時快速測定環(huán)境水體中3種微囊藻毒素（MC-LR，MC-YR，MC-RR）的方法。環(huán)境水樣經盤式固相萃取，超高效液相色譜分離，串聯(lián)質譜（UPLC-MS/MS）正離子多級離子監(jiān)測（MRM）模式檢測，外標法定量。結果表明，該方法快速、靈敏、準確，操作簡單且具有較高的準確度和精密度，可以作為環(huán)境水樣中衡量微囊藻毒素的監(jiān)測方法。

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色譜和波譜自動連接技術“破解”中藥化學成分密碼

中藥及天然藥物化學成分與生物活性的研究是闡明中藥治療疾病的科學內涵及實現(xiàn)中藥現(xiàn)代化的前提和基礎。而天然藥物中活性成分分離是研究中的一大難關，工作量大、針對性差、重復率高等問題，使得活性成分分離效率難以提高。

中國藥科大學副校長孔令義帶領的團隊，經過20年的努力，創(chuàng)建了系列色譜和波譜技術自動連接制備分離和結構識別一體化的中藥和天然藥物化學成分分離新技術，發(fā)現(xiàn)了生物活性化合物和結構新穎的化合物。新技術的應用加快了中藥物質基礎研究與開發(fā)的步伐，推動了中藥的現(xiàn)代化和國際化，該項研究獲2015年國家科技進步二等獎。

1 探究中藥化學成分分離新技術

樣品損失、分離效率低是天然藥物化學成分研究中的攔路虎。20世紀80年代，美國學者研發(fā)的一項高速逆流色譜技術，以其無固體支撐、根據物質在兩相中分配系數的差異對物質進行分離，避免了傳統(tǒng)色譜技術因不可逆吸附而引起的樣品損失、失活、變性等，不僅使樣品能夠全部回收，回收的樣品更能反映其本來的特性，特別適合于天然生物活性成分的分離。

孔令義帶領團隊深入開展了高速逆流色譜在制備分離各類中藥活性成分中的適用性研究，創(chuàng)造性地將制備型色譜分離技術（HSCCC，HPLC，MPLC）和波譜測定技術（MS）連接，建立了色譜和波譜技術自動連接制備分離和結構識別一體化的中藥及天然藥物化學成分分離系列新技術，顯著提升了天然活性化合物和結構新穎化合物的發(fā)現(xiàn)和分離水平。

2 基于新技術的中藥成分研究

多年來，孔令義帶領課題組應用新技術，從60余種中藥及天然藥物中分離鑒定了5 000余個化合物，發(fā)現(xiàn)了600余個新化合物，其中新骨架化合物25個。同時，建立了中藥和天然藥物化合物庫，在中藥和天然藥物的研究和開發(fā)中發(fā)揮了重要作用。此外，該項目對化合物的生物活性開展了系統(tǒng)研究，闡明了部分中藥和藥用植物臨床治療疾病的物質基礎，確定了具有降血糖、抗過敏性哮喘、抗腫瘤等顯著活性的化合物42個，并為開發(fā)具有自主知識產權的新藥奠定了基礎，其中2個化合物被列為國家科技重大專項重大新藥創(chuàng)制候選藥物。

課題組將分離新技術應用到中藥化學對照品的研究制備中，取得了很好的效果。將分離制備的中藥化學對照品應用于《中國藥典》2010年版的質量控制研究中，起草了12個中藥及飲片的質量標準，并已頒布實施，保證了相關中藥臨床應用的安全性和有效性。

（ 中國分析計量網）

珠海投資3 000萬改造市場食品檢測室

珠海市在不久前召開全市食品安全工作會議暨創(chuàng)建食品安全城市動員會上公布了《珠海市食品安全城市創(chuàng)建試點工作實施方案》，要求到2018年5月，全市各區(qū)達到廣東省食品安全城市考核評價標準的各項要求，成為“廣東省食品安全城市”；2019年年底通過國家食品安全考核驗收，成為“國家食品安全城市”。

會上，珠海市副市長龍廣艷代表市政府與各行政區(qū)簽訂了食品安全責任書。食品安全責任書明確了創(chuàng)建食品安全城市的“七個工程”，分別是國家食品安全橫琴創(chuàng)新工程、小作坊集中加工區(qū)建設工程、食用農產品批發(fā)農貿市場升級改造工程、餐廚垃圾無害化資源化工程、四小行業(yè)經營規(guī)范工程、食品安全監(jiān)管科技工程和監(jiān)管隊伍素質提升工程。

其中，農貿市場升級改造這一工程珠海老百姓并不陌生，珠海市政府2015年已投入6 000多萬元，已建成11家新農貿市場，完成83家舊農貿市場的改造升級，今后3年，珠海市還將繼續(xù)投入3 000多萬元，對全市94家農貿市場的食品檢測室進行提升和完善。

（儀器信息網）

Rapid Determination of Three Kinds of Microcystin Algae Toxins in Environmental Water Sample by Disk SPE-Ultra High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

Zhao Bin， Zhang Min， Zhang Fuhai， Tian Bingzheng， Wang Xin
（Anhui Provincial Environmental Monitoring Center Station， Hefei 230071， China）

A rapid determination of three kinds of microcystin algae toxins（MCs） in environmental water samples method by using disk SPE-ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS-MS） was established. Environmental water samples was extracted by disc solid-phase extraction column（C18）， three kinds of MCs was separated by Waters BEH C18chromatographic column with acetonitrile-0.2% formic acid solution as mobile phase，gradient elution separation， UPLC-MS-MS multi-stage monitoring mode （MRM） under the external standard method was used for quantitative analysis. Three kinds of MCs in the range of 0.05-10.0 μg/L showed good linear relation， the correlation coefficient were more than 0.999 4， the method detection limit was 0.02 ng/L. Under 0.1， 1.0， 5.0 μg/L standard addition for the same environmental samples， the average recovery was 82.8%-108.8%. The relative standard deviation of determination results was 2.1%-10.1%（n=6）. This method is rapid， sensitive and accurate， it can be effectively applied monitoring of algal toxins in environmental water samples.

disc solid-phase extraction column； ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry； environmental water sample； microcystin algae toxins

O657.7

A

1008-6145（2016）02-0048-04

10.3969/j.issn.1008-6145.2016.02.014

聯(lián)系人：張敏；E-mail： zhaobin19831102@163.com

2015-12-18