郭平，萬(wàn)建春，祝建新，占春瑞，左海根

（江西出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫綜合技術(shù)中心，南昌 330038）

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蔬菜中6種極性農(nóng)藥殘留量*

郭平，萬(wàn)建春，祝建新，占春瑞，左海根

（江西出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫綜合技術(shù)中心，南昌 330038）

建立了百草枯、敵草快、矮壯素、縮節(jié)胺、單甲脒、滅蠅胺6種極性農(nóng)藥的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法。采用SCX和C18復(fù)合填料（質(zhì)量比為1∶20）的Shiseido CAPCELL PAK CR色譜柱分離，用超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。利用響應(yīng)面法優(yōu)化得到樣品的前處理?xiàng)l件，蔬菜樣品用甲酸-乙腈溶液均質(zhì)提取，三氯甲烷液-液萃取凈化，在定量限的1，2，10倍濃度水平，回收率在61.7%～116.8%之間，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于13.6%（n=6）。該法適用于蔬菜中百草枯、敵草快、矮壯素、縮節(jié)胺、單甲脒、滅蠅胺殘留量的測(cè)定。

百草枯；敵草快；矮壯素；縮節(jié)胺；單甲脒；滅蠅胺；蔬菜；殘留量；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

百草枯（paraquat，PQ）、敵草快（diquat，DQ）、矮壯素（chlormequat，CQ）、縮節(jié)胺（mepiquat，MQ）都是常見的季銨鹽類農(nóng)藥，它們易溶于水、揮發(fā)性低、在酸性和中性條件下化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定［1］；單甲脒（semiamitraz，ST）和滅蠅胺（cyromazine，CZ）是強(qiáng)堿性極性陽(yáng)離子有機(jī)化物，易溶于水等極性溶劑。

百草枯是用量?jī)H次于草甘膦的全球第二大除草劑［2］。百草枯毒性很強(qiáng)，目前臨床缺少有效的治療手段，百草枯中毒致死率非常高［3-4］。我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763-2014中規(guī)定了多種蔬菜品種中百草枯限量要求，目前蔬菜中百草枯殘留量的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法是紫外分光光度法［5］，該法專屬性不強(qiáng)，易受基質(zhì)干擾，而且操作步驟復(fù)雜。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)具有高靈敏度和專屬性強(qiáng)等特點(diǎn)，在復(fù)雜基質(zhì)樣品農(nóng)藥殘留分析中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。目前有較多研究者采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測(cè)定食品中農(nóng)藥殘留［6-11］，而對(duì)百草枯等強(qiáng)極性農(nóng)藥更多的是采用離子對(duì)試劑或用親水色譜柱進(jìn)行色譜分離。離子對(duì)試劑的使用會(huì)影響質(zhì)譜的靈敏度［12］，而親水色譜柱則需要高濃度的緩沖鹽，這同樣會(huì)影響質(zhì)譜的靈敏度。筆者采用SCX和C18復(fù)合固定相的反相色譜柱分離后進(jìn)行質(zhì)譜分析，建立了蔬菜中極性農(nóng)藥殘留量的快速測(cè)定方法。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1主要儀器與試劑

液質(zhì)聯(lián)用儀：TSQ-Quantiva 型，配ESI離子源，美國(guó)塞默飛世爾科技有限公司；

高速組織勻漿機(jī)：IKA-T25型，德國(guó)IKA公司；

超純水機(jī)：Milli-Q型，美國(guó)Millipore公司；

渦旋混勻器：Vortex-Genie2型，美國(guó)Scientific Industries公司；

常速離心機(jī)：TDL-5-A型，上海安亭公司；

高速離心機(jī)：5430R型，德國(guó)Eppendorf公司；

百草枯、敵草快、矮壯素、縮節(jié)胺、單甲脒、滅蠅胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司；

乙腈：色譜純，德國(guó)Merck公司；

甲酸：色譜純，美國(guó)Sigma公司；

三氯甲烷、乙酸銨：色譜純，上海安譜公司；

實(shí)驗(yàn)用水為超純水（Milli-Q超純水機(jī)制得）。

1.2溶液的配制

百草枯、敵草快、矮壯素、縮節(jié)胺、單甲脒、滅蠅胺標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別準(zhǔn)確稱取10 mg標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用水溶解并定容，制得1.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18℃下儲(chǔ)藏。標(biāo)準(zhǔn)中間液用水稀釋儲(chǔ)備液至適當(dāng)濃度備用。

甲酸-乙腈提取液：分別量取50 mL甲酸，加入250 mL乙腈，加水溶解并定容至1 000 mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3儀器工作條件

1.3.1色譜條件

色譜柱：Shiseido CAPCELL PAK CR柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）；柱溫：30℃；流動(dòng)相：A為5 mmol/L乙酸銨溶液（含0.1%甲酸），B為99%乙腈溶液（含5 mmol/L乙酸銨）；流動(dòng)相流量：0.3 mL/min；進(jìn)樣體積：5 μL；梯度洗脫程序見表1。

表1　梯度洗脫程序

1.3.2質(zhì)譜條件

正模式掃描；選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）；毛細(xì)管電壓：3 500 V；霧化氣壓力：276 kPa（40 psi）；鞘氣壓力：103 kPa（15 psi）；反吹氣壓力：138 kPa（20 psi）；離子傳輸管溫度：350℃；霧化氣溫度：400℃。6種農(nóng)藥的其它質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2　6種農(nóng)藥的質(zhì)譜參數(shù)

1.4樣品前處理

稱取試樣10.0 g至50 mL聚丙烯離心管內(nèi)，加入10 mL甲酸-乙腈提取液，高速勻漿提取1 min，加入10 mL三氯甲烷，以4 500 r/min離心5 min，上層清液全部轉(zhuǎn)移至25 mL比色管中，殘?jiān)性偌尤?0 mL甲酸-乙腈提取液，渦旋提取30 s后，以4 500 r/min離心5 min，合并上層清液至25 mL比色管中，用甲酸-乙腈提取液定容至標(biāo)線，混合均勻，取1 mL甲酸-乙腈提取液至1.5 mL離心管中，以15 000 r/min離心5 min，上層清液過(guò)0.22 μm濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

2　結(jié)果與討論

2.1質(zhì)譜條件的優(yōu)化

百草枯、敵草快、矮壯素、縮節(jié)胺都是季銨鹽類化合物，屬?gòu)?qiáng)極性化合物，而單甲脒、滅蠅胺結(jié)構(gòu)中也含有氨基結(jié)構(gòu)，在質(zhì)譜離子化時(shí)，形成正離子。在質(zhì)譜優(yōu)化時(shí)，由針泵注入1.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，為提高方法的優(yōu)化效果，設(shè)定0.3 mL/min 的流量，等比例注入流動(dòng)相A和流動(dòng)相B，調(diào)節(jié)質(zhì)譜源參數(shù)，在一級(jí)母離子掃描方式下使化合物的母離子響應(yīng)值達(dá)到最高。在子離子掃描方式下，設(shè)置碰撞氣為0.2 Pa，通過(guò)調(diào)節(jié)不同碰撞能量，得到較為理想的碎片離子信息，再利用儀器的自動(dòng)優(yōu)化功能，優(yōu)化離子對(duì)最佳碰撞能量和透鏡電壓。

2.2色譜條件的優(yōu)化

季銨鹽類化合物分子極性較強(qiáng)，在反相色譜柱中難有保留，通常加入七氟丁酸、庚烷磺酸鈉等離子對(duì)試劑，以改善其在反相色譜柱上的色譜行為，但離子對(duì)試劑會(huì)造成質(zhì)譜靈敏度降低。選擇CAPCELL PAK CR色譜柱，其固定相由SCX和反相C18填料組成，為避免季銨鹽類化合物的死吸附，選擇SCX和C18填料為1∶20的CR柱。乙酸銨緩沖溶液適合于質(zhì)譜分析，銨鹽也可洗脫陽(yáng)離子化合物，實(shí)驗(yàn)采用含5 mmol/L乙酸銨溶液的流動(dòng)相，并優(yōu)化了梯度洗脫條件。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相含有一定比例的有機(jī)相，可改善矮壯素的色譜峰形，而含有乙酸銨，可保證其它化合物充分洗脫。實(shí)驗(yàn)用空白蔬菜添加6種農(nóng)藥，按1.4步驟操作，得到空白蔬菜加標(biāo)試樣溶液，加標(biāo)試樣溶液在1.3儀器工作條件下測(cè)定，色譜圖見圖1。由圖1可知，6種農(nóng)藥分離較理想，色譜峰形非常尖銳，目標(biāo)物出峰位置沒有干擾峰。

圖1　空白蔬菜添加6種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖

2.3樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

百草枯、敵草快、矮壯素、縮節(jié)胺、單甲脒、滅蠅胺都是極性化合物，呈堿性，易溶于水，目前多采用酸性提取液提取，因蔬菜含色素較多，故采用甲酸溶液均質(zhì)提取，加入乙腈沉淀纖維，用三氯甲烷除去色素。6種農(nóng)藥的堿性強(qiáng)弱和極性差異有所不同，甲酸溶液的濃度和乙腈的加入量可能影響各目標(biāo)物的提取效率。以各化合物回收率為響應(yīng)值，對(duì)甲酸溶液的濃度和乙腈-水比例進(jìn)行2因素5水平響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)甲酸溶液的濃度和乙腈用量對(duì)提取效率均有影響，矮壯素隨甲酸溶液濃度的升高回收率升高明顯，單甲脒、滅蠅胺、縮節(jié)胺隨著乙腈用量的增加回收率下降明顯，可能是這些化合物極性相對(duì)偏弱，有部分溶解在有機(jī)相中所致。百草枯和敵草快回收率偏低，乙腈用量和甲酸溶液濃度的大小對(duì)其回收率影響不明顯，但不含甲酸的提取液相比含甲酸的提取液回收率明顯偏低，因此最終確定采用含5%甲酸-乙腈水溶液（體積比為25∶75）為提取溶液。

2.4線性方程和檢出限

用陰性蔬菜樣品進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，以待測(cè)物的信噪比（S/N）為10確定方法的定量限。質(zhì)譜法測(cè)定時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)難以避免，而百草枯和敵草快的絕對(duì)回收率偏低，本方法確定采用基質(zhì)添加匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行定量。6種農(nóng)藥的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限見表3。

表3　各化合物在蔬菜樣品中的檢出限、定量限、線性方程1）

2.5加標(biāo)回收試驗(yàn)

采用陰性蔬菜樣品，分別在1，2，10倍定量限水平進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果見表4。由表4可知，6種農(nóng)藥加標(biāo)回收率在61.7%～116.8%之間，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于13.6%，精密度和準(zhǔn)確度滿足分析要求。

表4　蔬菜中6種農(nóng)藥添加回收試驗(yàn)結(jié)果

3　結(jié)語(yǔ)

建立蔬菜中百草枯、敵草快、矮壯素、縮節(jié)胺、單甲脒、滅蠅胺殘留量的測(cè)定方法，使用陽(yáng)離子交換和反相填料的色譜柱進(jìn)行分離，對(duì)季銨鹽類農(nóng)藥有較理想的保留作用。該方法采用甲酸-乙腈水溶液提取，以三氯甲烷除去色素，對(duì)季銨鹽類農(nóng)藥提取效率高，靈敏度高，穩(wěn)定性好，操作簡(jiǎn)便。研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，百草枯和敵草快在蔬菜樣品中絕對(duì)回收率偏低，有研究表明百草枯在土壤中極易被鈍化［13］，這或許是百草枯和敵草快受到樣品中金屬離子的影響，而導(dǎo)致絕對(duì)回收率偏低的原因，這一現(xiàn)象還有待進(jìn)一步研究。

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Determination of Six Kinds of Polar Pesticide Residue in Vegetables by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

Guo Ping， Wan Jianchun， Zhu Jianxin， Zhan Chunrui， Zuo Haigen
（Comprehensive Technology Center of Jiangxi Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Nanchang 330038， China）

A HPLC-MS/MS method was established for determination of polar pesticides residues of paraquat，diquat， chlormequat， mepiquat， semiamitraz， cyromazine. The chromatographic separation was achieved by ultra high pressure liquid chromatography-tandem mass spectrometry， using a CAPCELL PAK CR column with SCX and C18mixing proportion of 1∶20. The sample pretreatment conditions was optimized by response surface method， vegetable samples were extracted with formic acid-acetonitrile solution， and purified by liquid-liquid extraction with chloroform. The recoveries were 61.7%-116.8% with the relative standard deviation not more than 13.6%（n=6） in the level of 1， 2， 10 times concentration of the limit quantification （LOQ）. The method is suitable for the determination of paraquat， diquat，chlormequat， mepiquat， semiamitraz， cyromazine residues in vegitables.

paraquat； diquat； chlormequat； mepiquat； semiamitraz； cyromazine； vegetable； residue； LC-MS/MS

O657.63

A

1008-6145（2016）02-0023-04

10.3969/j.issn.1008-6145.2016.02.007

*江西省科技廳科研項(xiàng)目（20141BBG70096）

聯(lián)系人：萬(wàn)建春；E-mail： wojiaoandy@aliyun.com

2015-12-04