王　越 ，趙鴻飛，林創(chuàng)鑫，任　婕，葉勇義，季中華，張世忠

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連翹苷對LPS刺激的BV2小膠質(zhì)細胞炎性反應的抑制作用

王越1，2，趙鴻飛3，林創(chuàng)鑫4，任婕5，葉勇義1，季中華6，張世忠1

目的探索連翹苷對脂多糖(LPS)刺激的小膠質(zhì)細胞BV-2的細胞炎癥因子釋放的抑制作用和機制。方法采用LPS(0.1 g/ml) 刺激小膠質(zhì)細胞建立神經(jīng)退行性疾病(帕金森病)炎癥模型， MTT法檢測連翹苷對BV2的細胞毒性；硝酸還原酶法檢測連翹苷對LPS刺激BV2細胞一氧化氮(NO)表達量的影響；一氧化氮合酶分型法檢測連翹苷對LPS刺激BV2細胞一氧化氮合酶(iNOS)活性的影響;Western-blot法檢測連翹苷對LPS刺激BV-2細胞TLR4蛋白表達影響。結(jié)果50～200 μg/ml連翹苷能抑制LPS誘導BV2細胞的炎癥反應。結(jié)論連翹苷能夠抑制小膠質(zhì)細胞活化產(chǎn)生的炎癥反應，其機制可能是通過抑制TLR4信號通路而發(fā)揮效用。

連翹苷；脂多糖；帕金森病；小膠質(zhì)細胞；炎癥反應

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)，又名震顫麻痹，是人類最常見的神經(jīng)退行性運動障礙性疾病之一，其特征是中腦黑質(zhì)致密部(SNpc)多巴胺能神經(jīng)元(DA)變性丟失，以及α-突觸核蛋白(α-synuclein)為主要成分的路易小體的形成[1,2]。帕金森病的病理機制復雜，隨著近年來對神經(jīng)退行性病變發(fā)病機制的研究發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細胞介導的腦內(nèi)慢性炎癥反應可能是其重要病理特征之一。在帕金森病早期，黑質(zhì)區(qū)活化的小膠質(zhì)細胞與多巴胺丟失程度相對應；小膠質(zhì)細胞的激活以及炎性因子的高表達參與帕金森病的發(fā)生、發(fā)展過程。神經(jīng)性炎癥明顯促進帕金森病的進展，尤其是小膠質(zhì)細胞的激活及促炎性因子、神經(jīng)毒素的表達，被認為能引起帕金森病患者多巴胺能神經(jīng)元的丟失[3～5]。因此，抗炎治療有望成為延緩或阻止疾病發(fā)展的神經(jīng)保護性治療手段。應用抗炎藥物尤其是抗炎、抗神經(jīng)毒素療效較好的中藥活性成分延緩或阻止帕金森病的發(fā)生、發(fā)展已成為該領(lǐng)域目前的新的研究熱點。

中藥連翹[Forsythia suspense (Thunb) Vahl]是我國藥典收載的常用中藥，臨床上治療緩解紅、腫、熱、痛等與急性炎癥相似的癥狀，臨床效果顯著[6]。其主要的活性成分連翹苷(Forsythin，F(xiàn)OR)，化學式為C27H34O11，是天然植物化學成分，在國家藥典中加以錄入。近年已有研究表明，連翹苷具有抗氧化、拮抗細菌內(nèi)毒素、降血脂等作用[7～9]，然而其有關(guān)抗炎作用及對神經(jīng)元的保護作用相關(guān)機制研究較少。本文通過脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激誘導小膠質(zhì)細胞活化模擬中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)慢性炎癥的發(fā)生，觀察連翹苷對該炎癥的抑制作用及其機制，為連翹苷與帕金森病等炎癥相關(guān)性退行性疾病的治療與開發(fā)提供依據(jù)。

1　材料及方法

1.1藥物與試劑小鼠小膠質(zhì)細胞BV-2細胞(BV-2 cells)(中國醫(yī)學科學院協(xié)和醫(yī)科大學基礎醫(yī)學細胞中心提供)，連翹苷(北京中科儀友化工技術(shù)研究院，純度98%)。RPMI-1640培養(yǎng)基(北京清大天一科技有限公司)；四甲基偶氮唑藍比色法(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)(Sigma USA)；青霉素-鏈霉素雙抗、小牛血清(上海谷研生物工程有限公司)；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)(Sigma USA)；二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)(Sigma USA)；一氧化氮(Nitric Monoxide，NO)試劑盒,誘導型一氧化氮合酶(inducible Nitric Oxide synthase，iNSO)合酶試劑盒(南京建成生物工程研究所)； BCA(bicinchonininc acid)蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)(西安晶彩生物技術(shù)研究所)；Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)抑制劑、TLR4兔抗鼠的TLR4一抗、HRP-山羊抗兔二抗IgG(北京博奧森科技有限公司)。

1.2儀器CO2培養(yǎng)箱(Binder，Germany)；倒置顯微鏡(Olympus，Japan)，酶標儀(Tecan，Switzerland)；電泳槽、轉(zhuǎn)印槽、電泳儀(Bio-Rad USA)。

2　方　法

2.1BV-2小膠質(zhì)細胞株的培養(yǎng)BV-2小膠質(zhì)細胞培養(yǎng)在含10%小牛血清、100 U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM置于培養(yǎng)基，置于37 ℃飽和濕度的CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d更換一次培養(yǎng)基，3 d進行一次傳代，選取對數(shù)生長期狀態(tài)優(yōu)良細胞做實驗備用。

2.2MTT(四甲基偶氮唑藍比色法)檢測LPS對BV-2的細胞毒性選取對數(shù)生長期狀態(tài)良好的BV-2細胞配制成細胞懸液接種于96孔板，分成4組(第一組為無藥組，其余3組為用藥組)，密度為6×103/孔，每孔100 μl，待細胞貼壁后，分別加入不同濃度的LPS(0.1 μg/ml、1 μg/ml、5 μg/ml)于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄上清液，在每孔90 μl無血清培養(yǎng)基中加入10 μl的MTT(濃度：0.5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液體，加入100 μl的DMSO，置搖床上充分震蕩使結(jié)晶溶解，在酶標儀490 nm處測定各孔光密度D(λ)值，計算細胞存活率。每組重復3次獨立實驗。計算公式如下:細胞存活率=[1-(D(λ)無藥組-D(λ)用藥組)/D(λ)無藥組]×100%。

2.3MTT法檢測連翹苷對BV-2細胞活力影響選取指數(shù)生長期狀態(tài)良好的BV-2細胞,配制成細胞懸液接種于96孔板，分成4組(第一組為無藥組，其余3組為用藥組)，密度為6×103/孔，每孔100 μl，待細胞貼壁后，分別加入不同濃度的連翹苷(50 μg/ml、100 μg/ml、200 μg/ml)預培養(yǎng)1 h，棄上清液，加入LPS(0.1 μg/ml)培養(yǎng)24 h，棄上清液，在每孔90 μl無血清培養(yǎng)基中加入10 μl的MTT(濃度：0.5 mg/ml)，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，棄上清液，加入100 μl的DMSO，置搖床上充分震蕩使結(jié)晶溶解，在酶標儀490 nm處測定各孔光密度D(λ)值，計算細胞存活率。每組重復3次獨立實驗。計算公式同上。

2.4一氧化氮合酶分型法檢測連翹苷對iNOS蛋白活性的影響選取指數(shù)生長期狀態(tài)良好的BV-2細胞,配制成細胞懸液接種于24孔板中，密度為6×105/孔，每孔1000 μl，分為連翹苷(50 μg/ml、100 μg/ml、200 μg/ml)藥物組、LPS組、DMSO組、對照組。細胞貼壁后，加入各濃度藥物預培養(yǎng)2 h，棄上清液，加入LPS(0.1 μg/ml)刺激12 h，收集細胞培養(yǎng)液(5000 rpm，10 min)，按照南京建成一氧化氮合酶檢測試劑盒說明書標準方法操作，檢測iNOS活性。每組重復3次獨立實驗。

2.5硝酸還原酶法檢測NO 的含量選取指數(shù)生長期狀態(tài)良好的BV-2細胞,配制成細胞懸液(密度為6×105/孔)接種于24孔板中，每孔1000 μl，分為連翹苷(50 μg/ml、100 μg/ml、200 μg/ml)藥物組、LPS組、DMSO組、對照組。細胞貼壁后，加入各濃度藥物預培養(yǎng)2 h，棄上清液，加入LPS(0.1 μg/ml)刺激12 h，收集細胞培養(yǎng)液(5000 rpm，10 min)，以亞硝酸鈉為標準對照，依照NO檢測試劑盒說明書標準方法操作，波長為550 nm處，讀取檢測值，計算培養(yǎng)液中NO的含量。每組重復3次獨立實驗。

2.6Western-blot 檢測連翹苷對TLR4蛋白表達的影響選取指數(shù)生長期狀態(tài)良好的BV-2細胞,配制成細胞懸液(密度為6×105/孔)接種于6孔板中，每孔2000 μl，分為正常對照組、LPS組、DMSO組、TLR4抑制劑組、連翹苷(50 μg/ml、100 μg/ml、200 μg/ml)藥物組。細胞貼壁后，加入各濃度藥物預培養(yǎng)2 h，棄上清液，加入LPS(0.1 μg/ml)刺激12 h，收集細胞培養(yǎng)液(5000 rpm，10 min)，用預冷的PBS清洗3次，每孔加200 L細胞裂解液，冰上裂解30 min，10000×g，4 ℃離心10 min，取上清，BCA法蛋白定量10%SDS-PAGE電泳分離蛋白，濕法轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)室溫下用封閉液封閉2 h后加入TLR4一抗(1∶1000)，4 ℃孵育過夜，洗脫一抗，與二抗(1∶2000)反應1 h，洗脫二抗，暗室曝光、顯影和定影，通過Image tool圖像分析軟件讀取目的電泳條帶的斑點密度掃描值,以各組β-actin條帶的掃描值為對照，標化其相應組的TLR4蛋白表達量。

3　統(tǒng)計分析

4　實驗結(jié)果

4.1LPS與連翹苷對BV2小膠質(zhì)細胞的毒性檢測實驗結(jié)果表明，與對照組相比，LPS組作用于BV-2細胞24 h，數(shù)據(jù)無顯著性差異，說明LPS (0.1、1、5 g/ml)對BV-2細胞不存在細胞毒性作用(見圖1)。經(jīng)實驗結(jié)果評價，優(yōu)選0.1 g/ml 濃度LPS作用于BV-2細胞，建立理想的體外細胞致炎模型。不同濃度連翹苷(50、100、200 μg/ml)作用BV-2細胞24 h，與對照組相比，細胞活力無統(tǒng)計學差異(見圖2)，結(jié)果表明在實驗條件下，連翹苷(50～200 μg/ml)與LPS(0～5 g/ml)均對BV-2細胞無明顯細胞毒性作用，實驗在該藥物濃度范圍內(nèi)進行具有科學依據(jù)。

4.2連翹苷對iNOS抑制作用結(jié)果顯示，不同濃度藥物干預后，BV-2細胞NO表達量發(fā)生明顯變化(F=109.511,P<0.001)。LPS組的iNOS活性(3.886±0.2677)U/ml顯著高于對照組(1.411±0.1431)U/ml和DMSO(1.375±0.1924)U/ml的表達量，與LPS相比，不同濃度的連翹苷預孵育1 h，iNOS活性濃度依賴性降低50～200 μg/ml，連翹苷作用BV-2細胞，iNOS活性分別為：(3.380±0.1260)、(2.884±0.1230)、(2.579±0.1124)與LPS組相比，50～200 μg/ml連翹苷對iNOS活性抑制率分別為13.02%、25.78%、33.63%。當連翹苷達到50 μg/ml時,與LPS單獨刺激組相比即有顯著性差異(q=5.1642，P=0.003)。當連翹苷濃度逐漸上升到100 μg/ml、200 μg/ml時，差異繼續(xù)增大(q=10.227,P<0.001；q=13.340,P<0.001)。表明連翹苷可明顯抑制LPS誘導BV2小膠質(zhì)細胞iNOS的表達(見圖3)。

4.3連翹苷對NO抑制作用結(jié)果顯示，不同濃度藥物干預后，BV-2細胞NO表達量發(fā)生明顯變化(F=152.160,P<0.001),LPS組的NO(84.52±4.12)mol/L濃度顯著性高于對照組(32.19±2.67)mol/L和DMSO(31.25±2.75)mol/L，與LPS相比，不同濃度連翹苷預孵2 h后，NO呈濃度依賴性降低(0～5 g/ml)，連翹苷作用BV-2細胞后NO的表達量依次為69.27±2.63、 55.25±2.36、53.89±2.63，與LPS組比較，50～200 μg/ml連翹苷對NO的抑制率分別為18.04%、34.63%、36.23%。當連翹苷達到50 μg/ml時,與LPS單獨刺激組相比即有顯著性差異(q=9.054,P<0.001)；當連翹苷上升至100 μg/ml時,差異繼續(xù)增大(q=17.377，P<0.001)，并隨著連翹苷濃度的增加，差異趨向平穩(wěn)(q=18.185，P<0.001)，表明連翹苷可明顯抑制LPS誘導的BV2小膠質(zhì)細胞NO的釋放(見圖4)。

4.4連翹苷對TLR4蛋白表達的影響結(jié)果本實驗采用Western blot檢測了TLR4蛋白的表達，結(jié)果顯示不同濃度藥物干預后，BV-2細胞TLR4蛋白表達量發(fā)生明顯變化(F=94.479,P<0.001)(見表1)，LPS組與對照組比較，表達量明顯增加，TLR4抑制劑(MST510)組及連翹苷各濃度組預孵育2 h，與LPS組TLR4蛋白表達量呈顯著性差異，TLR4蛋白表達量顯著降低，并呈濃度依賴性，表明連翹苷能明顯降低LPS的作用。連翹苷(200 μg/ml)與MST510組之間無顯著性差異(q=0.259，P=0.857),提示連翹苷可以有效抑制TLR4蛋白的表達。

表1　Western blot檢測連翹苷對BV2細胞TLR4蛋白的影響

與對照組比較*較*P<0.01；與LPS組比較△P<0.01

圖1不同濃度LPS對BV2細胞活力的影響

圖2不同濃度連翹苷對BV2細胞活力的影響

注:與LPS組比較*P<0.05，**P<0.01

注:與LPS組比較*P<0.05，**P<0.01

5　討　論

5.1帕金森病與小膠質(zhì)細胞的激活大腦內(nèi)的炎癥反應在帕金森病過程中起著重要的作用，炎癥反應與腦內(nèi)神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞構(gòu)成的炎性復合體有關(guān)，在成熟的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，小膠質(zhì)細胞在中腦黑質(zhì)中分布最密集，當腦組織遭受刺激時，小膠質(zhì)細胞被激活，形態(tài)變化為阿米巴樣，到達損傷部位后，釋放炎癥因子和自由基如超氧陰離子、NO、前列腺素等神經(jīng)毒性因子，增強氧化應激，觸發(fā)神經(jīng)元凋亡級聯(lián)反應[10]，引起神經(jīng)元進行性變性壞死，這可能是帕金森病發(fā)病過程的生理機制。小膠質(zhì)細胞激活和前炎性因子及活性氧族的釋放[11]均為神經(jīng)性炎癥的特征。病理檢測顯示，帕金森病患者的紋狀體中[12]以及暴露于MPTP的帕金森病患者腦內(nèi)[13]存在著小膠質(zhì)細胞的激活。因此研究藥物抑制小膠質(zhì)細胞活化機制，探尋其作用靶點，將成為有效防治帕金森病等神經(jīng)退行性疾病的重要策略之一，為相關(guān)的藥物開發(fā)提供了新思路。

5.2連翹苷對LPS誘導BV2細胞iNOS及NO生成的影響誘導型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide NOS,iNOS)主要涉及參與炎癥反應過程NO的產(chǎn)生。iNOS若感染、或在炎癥因子(TNF-α、IFN-γ、內(nèi)毒素等)刺激作用下，由巨噬細胞、膠質(zhì)細胞等生成大量NO，NO(Nitric oxide，NO) 是造成神經(jīng)細胞損傷死亡的重要炎癥因子，高濃度的NO通過脂質(zhì)氧化、線粒體損傷、抑制或激活信號通路和DNA損傷等機制發(fā)揮細胞毒性作用[14]。本研究顯示連翹苷可呈劑量依賴性的顯著下調(diào)iNOS表達，明顯降低LPS誘導的BV-2細胞的NO釋放量，從而抑制炎癥反應，保護神經(jīng)元細胞，這可能是連翹苷發(fā)揮抗炎作用，延緩神經(jīng)退行性疾病的機制之一。

5.3連翹苷對TLR4蛋白表達的抑制作用TLRs(Toll like receptors)是參與非特異性免疫(天然免疫)的一類重要蛋白質(zhì)分子，LPS或微生物入侵機體,TLR可以對其進行識別并活化下游信號轉(zhuǎn)導途徑,激活機體產(chǎn)生系列免疫細胞應答。其中TLR4 (Toll樣受體4分子)目前被認為是炎癥反應的啟動閘門,是引起機體炎癥反應的關(guān)鍵分子,病原體及其成分與靶細胞膜上的TLR4結(jié)合后跨膜信號通過TLRs的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域激活NF-κB、AP-1等轉(zhuǎn)錄因子,進一步引起等多種炎癥分子(IL-1、IL-8)的“瀑鏈式”釋放。實驗顯示，經(jīng)連翹苷處理后，TLR4的表達量較LPS組下降，因此提示連翹苷抗LPS的效應可能與其下調(diào)LPS信號轉(zhuǎn)導通路關(guān)鍵受體TLR4表達有關(guān)，表明TLR4可能是連翹苷的作用位點。

實驗結(jié)果提示連翹苷可以有效抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應，本研究結(jié)果為中藥連翹苷延緩和治療帕金森病提供新的思路和理論依據(jù)。

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The inhibitory effect of forsythin inflammation in LPS-induced BV2 microglia cells

WANGYue,ZHAOHongfei,LINChuangxin,etal.

(TheNationalKeyClinicalSpecialtyTheEngineeringTechnologyResearchCenterofEducationMinistryofChinaGuangdongProvincialKeyLaboratoryonBrainFunctionRepairandRegenerationDepartmentofNeurosurgery,ZhujiangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510282,China)

ObjectiveTo study the inhibitory effect of Forsythin on LPS-induced BV-2 cell and explore the underlying mechanism of this protective effect.MethodsBV-2 cells were treated with LPS(0.1 μg/ml) for disease (Parkinson’s disease,PD) inflammation model.MTT assay was used to detect the viability of BV-2 cells.NO was detected by the method of nitric acid reductase assay.iNOS enzyme activity was determined by type of nitric oxidesynthase assay.TLR4 protein expression was examined by the Western blot analysis.ResultsForsythin did not exhibit cytotoxicity of BV2 cells.(50～200 μg/ml) Forsythin significantly suppressed iNOS activity,the production of NO,iNOS and TRL4 protein expression in LPS-stimulated BV2 microglia cells in a dose dependent manner.ConclusionLPS induced activation of microglia lead to inflammatory response and its mechanism may be related to inhibiting TLR4 signaling pathway.

Forsythin;Parkinson’s disease(PD);Lipopolysaccharides(LPS);Microglia;Inflammatory response

1003-2754(2016)04-0338-04

2015-12-20；

2016-01-28

(1.國家臨床重點?？?，教育部工程技術(shù)研究中心；廣東省腦功能修復與再生重點實驗室；南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東 廣州 510282；2.吉林省長春市解放軍208醫(yī)院，吉林 長春 130062；3.長春中醫(yī)藥大學中醫(yī)腦病科，吉林 長春 130117；4.南方醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510282；5.長春解放軍四六一醫(yī)院護理部，吉林 長春 130021；6.珠海市人民醫(yī)院，廣東 珠海 519000)

張世忠，E-mail：shizhongzh@163.com

R742.5

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