郭恩會(huì)，路青山，楊霄鵬，許春陽，王一凡，張豪杰，楊幸文

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阿托伐他汀對(duì)大鼠頸動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊及hs-CRP和MMP-9表達(dá)的影響

郭恩會(huì)1，路青山1，楊霄鵬1，許春陽1，王一凡1，張豪杰2，楊幸文1

目的研究阿托伐他汀對(duì)大鼠頸內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊面積、數(shù)目及對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)表達(dá)和血清hs-CRP的影響。方法將48只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、常規(guī)劑量組、強(qiáng)化劑量組，14 w后采血測(cè)量hs-CRP,光鏡下觀察頸內(nèi)動(dòng)脈粥硬化易損斑塊病理學(xué)變化，計(jì)數(shù)易損斑塊數(shù)目及面積，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)易損斑塊中MMP-9的表達(dá)。結(jié)果與模型組相比，常規(guī)劑量組和強(qiáng)化劑量組易損斑塊計(jì)數(shù)、面積大小、MMP-9表達(dá)均明顯降低(P<0.01)，強(qiáng)化劑量組又低于常規(guī)劑量組(P<0.05)，強(qiáng)化劑量組和常規(guī)劑量組血清hs-CRP測(cè)定結(jié)果均明顯低于模型組(P<0.01)，強(qiáng)化劑量組又低于常規(guī)劑量組(P<0.05)。結(jié)論阿托伐他汀能夠穩(wěn)定及減少頸內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊的形成和進(jìn)展，對(duì)血清hs-CRP及MMP-9的表達(dá)具有抑制作用，并且其抑制作用與劑量具有量效關(guān)系。

頸動(dòng)脈粥樣硬化；阿托伐他?。灰讚p斑塊；基質(zhì)金屬蛋白酶-9

心腦血管疾病在我國已成為發(fā)病率和病死率第一的疾病，動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是其最常見的病因[1]，頸內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化是全身動(dòng)脈硬化的重要局部表現(xiàn)，頸內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊的突然破裂及血栓形成是腦梗死的重要發(fā)病機(jī)制之一[2]，對(duì)于通過穩(wěn)定和逆轉(zhuǎn)頸內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊而降低腦缺血卒中風(fēng)險(xiǎn)是目前臨床研究的重點(diǎn)。

高敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)是血管炎癥的敏感標(biāo)志物，是與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、演變和進(jìn)展有關(guān)的促炎因子[3]，作為基質(zhì)金屬蛋白酶家族重要成員之一的MMP-9的高度表達(dá)可通過介導(dǎo)血管中膜平滑肌細(xì)胞的遷移、增值、凋亡及細(xì)胞外基質(zhì)降解而參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，并通過降解纖維帽內(nèi)膠原纖維及結(jié)蹄組織致使纖維帽變薄而形成易損斑塊[4,5]，故MMP-9水平高度表達(dá)可作為頸內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的檢測(cè)指標(biāo)。

阿托伐他汀可降低炎性反應(yīng)、抗動(dòng)脈粥樣硬化、穩(wěn)定斑塊改善缺血性腦血管疾病，本研究旨在通過建立大鼠頸內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化及其易損斑塊模型，觀察不同劑量阿托伐他汀對(duì)頸內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊的穩(wěn)定及逆轉(zhuǎn)是否具有明顯差異。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性SD大鼠48只，體重200～250 g，(1～2月齡)，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK(豫)2010-0002。隨機(jī)分為4組(A、對(duì)照組，12只；B、模型組，12只；C、常規(guī)劑量組，12只；D、強(qiáng)化劑量組，12只)，飼料由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)大鼠在鄭大二附院專用動(dòng)物房喂養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境符合SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)條件要求。

1.1.2藥物及主要試劑阿托伐他汀(立普妥)由輝瑞制藥有限公司提供，批準(zhǔn)文號(hào)：H20130103。MMP-9免疫組織化學(xué)染色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物模型建立與實(shí)驗(yàn)分組模型組、常規(guī)劑量組、強(qiáng)化劑量3組大鼠均參照Wilgram等[6]的方法，建立AS模型，按813 g/kg基礎(chǔ)飼料，5 g/kg膽酸鈉，30 g/kg膽固醇，50 g/kg白糖，10 g/kg豬油，2 g/kg丙基硫氧嘧啶，配制成高脂飼料，飲水不限，A組大鼠飼養(yǎng)普通飼料；B、C、D 3組大鼠在喂食前腹腔注射VitD3(70萬U/kg)，分3 d給完，隔天一次，每隔1 m追加一次VitD3(30萬U/kg)。B、C、D 3組大鼠每天給予高脂飼料約15 g，同時(shí)分別給予C組大鼠阿托伐他汀5 mg/kg·d、D組大鼠10 mg/kg·d溶于1 ml生理鹽水中灌胃，A、B組給予同等容量的生理鹽水灌胃，飼養(yǎng)同時(shí)定期檢測(cè)大鼠體重及健康狀況，持續(xù)14 w。喂養(yǎng)12 w后處死各組大鼠各一只手術(shù)切取左側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈2 cm，10%甲醛固定、石蠟包埋連續(xù)切片HE染色，光鏡下觀察到B、C、D 3組大鼠切片頸內(nèi)動(dòng)脈硬化的病理特征已出現(xiàn)，說明造模成功。

1.2.2hs-CRP測(cè)定各組大鼠喂養(yǎng)至14 w末禁食12 h，于尾靜脈取血2 ml，6000 r/min離心5 min，取上層血清，由日本DLYMPUS公司生產(chǎn)的AD2700全自動(dòng)生化測(cè)試儀檢測(cè)血清hs-CRP水平。

1.2.3病理形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)檢測(cè)麻醉取血后，手術(shù)取各組大鼠雙側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈各2 cm，用10%甲醛常規(guī)固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，偶數(shù)張HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察血管病理形態(tài)改變，用圖像分析儀測(cè)量各組斑塊總面積及斑塊面積/動(dòng)脈總面積，并計(jì)量易損斑塊數(shù)。奇數(shù)張切片行MMP-9免疫組化染色，MMP-9免疫組化染色嚴(yán)格按其試劑盒說明書操作。

2　結(jié)　果

2.1血清hs-CRP水平檢測(cè)模型組血清hs-CRP水平均明顯高于常規(guī)劑量組和強(qiáng)化劑量組(P<0.01)，且常規(guī)劑量組顯著高于強(qiáng)化劑量組(P<0.01)(見表1)。

2.2頸內(nèi)動(dòng)脈壁斑塊面積的改變手術(shù)取大鼠頸內(nèi)動(dòng)脈，光學(xué)顯微鏡觀察血管病理形態(tài)改變，定量分析圖像分析儀測(cè)量頸內(nèi)動(dòng)脈斑塊結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組斑塊總面積及斑塊總面積/動(dòng)脈總面積與對(duì)照組比較明顯增加(P<0.01)；強(qiáng)化劑量組斑塊面積及斑塊總面積/動(dòng)脈總面積比常規(guī)劑量組明顯減小(P<0.05)；常規(guī)劑量組斑塊面積及斑塊總面積/動(dòng)脈總面積比對(duì)照組明顯減小(P<0.05)(見表2)。

2.3動(dòng)脈粥樣硬化斑塊特征的觀察將各組大鼠頸內(nèi)動(dòng)脈切片偶數(shù)張行HE染色后光鏡下觀察，對(duì)照組頸內(nèi)動(dòng)脈管腔均勻，管壁光滑，模型組頸內(nèi)動(dòng)脈管腔明顯變窄、內(nèi)膜明顯增厚，內(nèi)含大量的泡沫細(xì)胞及炎癥細(xì)胞，管壁質(zhì)地易碎并彈性明顯下降，常規(guī)劑量組粥樣硬化病變減輕，管腔狹窄、內(nèi)膜增厚較對(duì)照組減少，強(qiáng)化劑量組病變明顯減輕，可見鈣化斑形成，且動(dòng)脈較對(duì)照組柔軟有彈性(見圖1)，將脂質(zhì)核心大于斑塊40%者判定為易損斑塊，D組易損斑塊計(jì)數(shù)明顯小于C組(P<0.05)(見表3)。

2.4MMP-9免疫組織化學(xué)改變免疫組織化學(xué)染色鑒定MMP-9表達(dá)變化(結(jié)果見圖1)，常規(guī)劑量組MMP-9免疫組織化學(xué)染色強(qiáng)度、陽性細(xì)胞率、總積分與模型組比較明顯降低(P<0.05)，強(qiáng)化劑量組MMP-9免疫組織化學(xué)染色強(qiáng)度、陽性細(xì)胞率、總積分與常規(guī)劑量組比較明顯降低(P<0.05)(見表4)。

表1　4組大鼠血清hs-CRP水平比較

與對(duì)照組比較*較*P<0.05；與模型組比較△P<0.05；與常規(guī)劑量組比較#P<0.05

表2　4組頸內(nèi)動(dòng)脈總面積、斑塊面積及斑塊面積與動(dòng)脈總面積的比較

與對(duì)照組比較*較*P<0.05；與模型組比較△P<0.05；與常規(guī)劑量組比較#P<0.05

表3　各組粥樣硬化易損斑塊數(shù)比較

與模型組組比較*P<0.01；與常規(guī)劑量組比較#P<0.05

表4　MMP-9免疫組織化學(xué)表達(dá)

與模型組組比較*P<0.01；與常規(guī)劑量組比較#P<0.05

圖1A:正常組；B:模型組；C:常規(guī)劑量組；D:強(qiáng)化劑量組

3　討　論

AS引起血管腔狹窄、血液循環(huán)減少導(dǎo)致腦供血不足及易損斑塊破裂、栓子脫落引起的腦栓塞是缺血性腦卒中的主要病因。有研究表明[7，8]，在AS形成及斑塊的不穩(wěn)定性改變中，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPS)起到關(guān)鍵性作用，MMPS參與AS是的血管重構(gòu)、斑塊破裂、血栓形成等一系列病理生理過程，MMPS表達(dá)越高，其纖維成分大量降解，使斑塊破潰形成附壁血栓機(jī)率越高，斑塊越易脫落而導(dǎo)致腦栓塞等疾病的發(fā)生，其中MMP-9是MMPS中分子量最大的酶，有學(xué)者通過對(duì)因頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成導(dǎo)致頸動(dòng)脈重度狹窄的患者抽血檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血漿MMP-9水平在診斷為易損斑塊及具有臨床癥狀的患者中明顯升高[9]。國內(nèi)關(guān)良勁等[10]研究發(fā)現(xiàn)MMP-9與頸動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度、總斑塊積分、易損斑塊積分呈正相關(guān)性，而和穩(wěn)定斑塊積分無相關(guān)性，說明血漿MMP-9水平的提高和頸動(dòng)脈內(nèi)膜中層增厚及斑塊的不穩(wěn)定性有著密切的聯(lián)系。hs-CRP因其可引發(fā)炎癥反應(yīng)參與到AS的形成及進(jìn)展過程，還可促使AS易損斑塊的破裂及血栓形成，所以hs-CRP可作為AS易損斑塊形成及進(jìn)展的一個(gè)危險(xiǎn)指標(biāo)。

阿托伐他汀是甲基戊二酰輔酶A(HMC-COA)還原酶抑制劑通過抑制內(nèi)源性膽固醇合成而降低血清膽固醇，在臨床上被廣泛應(yīng)用于調(diào)脂，近年來，由于它的抗AS作用被發(fā)現(xiàn)后，越來越受到重視。日本ESTABLISH研究[11]及Wong B等[12]證實(shí)，阿托伐他汀具有逆轉(zhuǎn)AS作用，它可減少AS脂紋面積及巨噬泡沫細(xì)胞大小、炎癥細(xì)胞、CRP沉積，抑制泡沫細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生的MMPS、穩(wěn)定AS易損斑塊。本研究中，B組的頸內(nèi)動(dòng)脈管腔明顯變窄，內(nèi)膜增厚，內(nèi)含大量泡沫細(xì)胞及炎癥細(xì)胞，光鏡下可見易損斑塊內(nèi)新生血管增生，證明造模成功。C組和D組的血清hs-CRP及斑塊中MMP-9表達(dá)均明顯低于B組，這和國內(nèi)相似研究得出的結(jié)果相符。本研究中，采用不同劑量阿托伐他汀干預(yù)AS大鼠頸內(nèi)動(dòng)脈易損斑塊的形成及進(jìn)展，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在AS大鼠頸內(nèi)動(dòng)脈易損斑塊計(jì)數(shù)、總斑塊面積/總動(dòng)脈面積、斑塊內(nèi)MMP-9表達(dá)等均存在明顯差異(P<0.05)，提示阿托伐他汀抗AS、穩(wěn)定及逆轉(zhuǎn)斑塊、降低腦缺血卒中的作用與其劑量呈正相關(guān)性，同時(shí)在本實(shí)驗(yàn)中光鏡下發(fā)現(xiàn)易損斑塊內(nèi)新生毛細(xì)血管數(shù)明顯增多，提示新生毛細(xì)血管的形成可能參與了易損斑塊的形成及進(jìn)展，但新生血管形成的機(jī)制尚不清楚，是否能通過減少斑塊內(nèi)新生血管的形成來抗AS，需要更加深入的研究。

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Effect of atorvastatin on atherosclerotic plaque of carotid artery and the expression of matrix metallopro-teinases-9(MMP-9) and hs-CRP in rats

GUOEnhui，LUQingshan，YANGXiaopeng，etal.

(DepartmentofNeurology，TheSecondAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450000,China)

ObjectiveTo study the inhibition effect of atorvastatin on the aortic unstable plaque area of routine atherosclerosis and the expression of MMP-9 and hs-CRP.MethodsForty eight healthy male SD rats were divided into normal group,model group,conventional-dose group and Strengthening dose group.After fourteen weeks,we measured the hs-CRP of blood,observed the pathological changes of atherosclerotic plaque under light microscope,counted the number and area of the vulnerable plaques,and observed the expression of MMP-9 through immunohistochemistry.ResultsCompared with the model group,the number and area of the vulnerable plaques,and the expression of MMP-9 of conventional-dose group and strengthening dose group were all markedly reduced(P<0.01)，the results in Strengthening dose group was less than the conventional-dose group(P<0.05),the analysis results of hs-CRP in the conventional-dose group and the strengthening dose group were less than the model group(P<0.01),the Strengthening dose group was less than the conventional-dose group(P<0.05).ConclusionThe atorvastatin can enhance plaque stability and reduce the formation and progress of the aortic plaque,restrain the expression of MMP-9 and hs-CRP,and its restrain effect has dose-effect relationship with its dose.

Atherosclerotic plaque of carotid artery;Atorvastatin;Unstable plaque;Matrix metallopro-teinase-9

1003-2754(2016)04-0307-04

2016-02-23；

2016-03-30

河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(No.201303087)

(1.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州 450000；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京 100000)

楊霄鵬，E-mail:yaxipe39@126.com

R743.1

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