毛仁玲，段　宇，高　幸，張　鈺，張法永

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蛛網(wǎng)膜下腔出血引起大鼠長期認(rèn)知功能損害及其與海馬小清蛋白陽性中間神經(jīng)元細(xì)胞關(guān)系

毛仁玲1，段宇1，高幸1，張鈺2，張法永3

目的探討蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)后大鼠認(rèn)知功能損害及其海馬區(qū)小清蛋白(PV)陽性中間神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量變化。方法雄性成年SD大鼠隨機(jī)分為對照組、假手術(shù)組和SAH組。在SAH術(shù)后20 w，采用8-臂迷宮實(shí)驗(yàn)測定動(dòng)物的空間認(rèn)知功能，應(yīng)用免疫組織化學(xué)檢測海馬區(qū)PV陽性中間神經(jīng)元數(shù)量。結(jié)果與對照組和假手術(shù)組大鼠相比，SAH組大鼠訓(xùn)練時(shí)間明顯延長(P<0.05)；在記憶測試中，間隔1 h、12 h和24 h，3組準(zhǔn)確率相似；而間隔2 h、3 h和6 h，SAH組大鼠的記憶正確率明顯低于其它兩組(P<0.05)，顯示SAH引起長期記憶功能損害。免疫組化顯示，SAH組CA1區(qū)和齒狀回(DG)區(qū)PV陽性中間神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)明顯低于其它兩組(CA1，P<0.01；DG,P<0.05);CA2和CA3區(qū)3組之間未見明顯差異。結(jié)論SAH可引起長期認(rèn)知功能損害，這些損害可能與SAH引起海馬CA1和DG區(qū)PV陽性中間神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)減少有關(guān)。

蛛網(wǎng)膜下腔出血；認(rèn)知功能障礙；海馬；小清蛋白陽性中間神經(jīng)元細(xì)胞

蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)引起腦血管痙攣和認(rèn)知功能損害的治療一直是臨床難題，近年來對于SAH引起血管痙攣的預(yù)防和治療取得顯著進(jìn)展，大大降低SAH引起血管痙攣的發(fā)生率和嚴(yán)重程度，但SAH引起的長期認(rèn)知功能損害目前沒有有效的治療方法[1,2]。SAH引起海馬損害是其引起認(rèn)知功能損害的重要環(huán)節(jié)[3]，我們過去的研究顯示SAH可引起海馬區(qū)興奮性氨基酸急性積聚，可能導(dǎo)致認(rèn)知功能損害原因之一[4]。Han等[5]采用視交叉前池動(dòng)脈血注射法能制造可靠的SAH癡呆模型， SAH后海馬區(qū)神經(jīng)元電生理反應(yīng)發(fā)生改變，但未引起海馬區(qū)細(xì)胞明顯損害[5]。GABA能中間神經(jīng)元細(xì)胞是海馬區(qū)最主要的抑制中間神經(jīng)元細(xì)胞，對海馬區(qū)錐體細(xì)胞有重要調(diào)節(jié)作用，參與動(dòng)物的認(rèn)知功能，本研究選擇有快速棘波特征的小清蛋白(Parvalbumin,PV)陽性GABA能中間神經(jīng)元[6]，觀察SAH后海馬區(qū)該類型神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目變化情況。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料Sprague-Dawley 大鼠(清潔級(jí)，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司)，8-臂迷宮(Prof.William設(shè)計(jì))， 小動(dòng)物呼吸機(jī)100B(Anaheim,USA)，血液儲(chǔ)存器、膜氧交換器(Cobe Micro,Cole-Parmer Instrument,USA)，1∶100兔抗大鼠抗CD11b和ED1(Sigma-Aldrich CO,USA)，生物素化羊抗兔IgG (Sigma-Aldrich CO,USA)。

1.2實(shí)驗(yàn)分組和處理健康雄性Sprague-Dawley大鼠，體重300～350 g，鼠齡10 w (上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，中國)。隨機(jī)分為3組：對照組(Control)、假手術(shù)組(Sham)和蛛網(wǎng)膜下腔出血組(SAH)，每組10只。大鼠完成認(rèn)知功能檢查后做組織學(xué)檢測。大鼠在SAH前后于實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房內(nèi)飼養(yǎng)，自由飲食，室溫20 ℃～22 ℃，每日光照12 h，黑暗12 h。

1.3SAH模型手術(shù)方法參照Prunell等視交叉前池注射SAH模型[7]。大鼠在異氟醚吸入麻醉下，行氣管插管和機(jī)械通氣，通過調(diào)整呼吸參數(shù)，使大鼠動(dòng)脈血CO2分壓維持在38～42 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。手術(shù)過程行直腸溫度監(jiān)測，通過自動(dòng)調(diào)節(jié)加熱毯維持大鼠體溫在(37.3±0.2)℃；作尾動(dòng)脈穿刺監(jiān)測動(dòng)脈壓；大鼠頭立體定向儀固定后，正中切開頭顯示前囟，在其前7.5 mm旁開0.5 mm作顱骨鉆孔，27號(hào)針頭沿矢狀前30度進(jìn)針3 mm左右，到視交叉前池，SAH組注射0.25 ml動(dòng)脈血，假手術(shù)組注射0.25 ml生理鹽水，5 min后取出針頭，骨蠟封骨孔。

1.4認(rèn)知功能的檢測和評價(jià)參照Williams的方法并改進(jìn)[8～10]。SAH術(shù)后18 w，大鼠給予食物限量，每只大鼠飼料為10 g·d-1，連續(xù)2 w后，大鼠體重為限量進(jìn)食前的85%左右并維持。術(shù)后20 w開始記憶功能訓(xùn)練。本研究采用8臂迷宮檢測大鼠認(rèn)知功能，8臂迷宮為木質(zhì)灰色，中間直徑為40 cm中央平臺(tái)，與均勻放射排列的長60 cm、寬9 cm的8個(gè)臂相連，在臂的末端有直徑為2 cm的食物凹槽。于訓(xùn)練第1、2天，將大鼠放在8臂迷宮內(nèi)熟悉環(huán)境。第3天，在8臂迷宮中心和4個(gè)臂放置食物顆粒，用透明玻璃板關(guān)閉未置食物的其他4臂入口。將大鼠放在8臂迷宮中央，待大鼠吃完食物顆粒或在8臂迷宮內(nèi)停留超過5 min，將大鼠放回飼養(yǎng)籠內(nèi)；間隔5 min后，清除剩余食物。

在原來未放置食物的4個(gè)臂上放置食物顆粒，并開放8 臂入口，將大鼠再次放置在迷宮中心。待大鼠吃完食物或在迷宮內(nèi)停留超過5 min，將大鼠放回飼養(yǎng)籠內(nèi)，一次訓(xùn)練結(jié)束。大鼠身體通過入口為進(jìn)入迷宮臂，大鼠進(jìn)入迷宮臂并吃完臂里的食物為正確，其余均為錯(cuò)誤。大鼠正確進(jìn)入迷宮臂的次數(shù)除以大鼠進(jìn)入迷宮臂總次數(shù)×100%作為大鼠覓食的正確率。

如果大鼠連續(xù)2 d吃完食物且正確率超過80%，進(jìn)入第2階段訓(xùn)練，將間隔時(shí)間由5 min延長到15 min，其余方法同第1階段。如果連續(xù)2 d正確率超過80%，大鼠被認(rèn)為已經(jīng)學(xué)會(huì)尋食，可作記憶能力檢查。將間隔時(shí)間延長到1 h、2 h、3 h、6 h、12 h和24 h，觀察大鼠覓食的準(zhǔn)確率。在檢查結(jié)束后，間隔15 min對大鼠進(jìn)行再次檢查。如果準(zhǔn)確率仍高于80%，認(rèn)為大鼠仍處于學(xué)會(huì)狀態(tài)。大鼠進(jìn)入放置食物顆粒臂的正確率可反映大鼠的記憶能力，訓(xùn)練的天數(shù)用來評價(jià)學(xué)習(xí)能力。

1.5免疫組織化學(xué)檢測標(biāo)本獲?。捍笫蟾骨粌?nèi)注射10%水和氯醛麻醉后，經(jīng)左心室灌注0.1 mol·L-1PBS(pH 7.4)，直至右心房流出無色液體后，改為灌注4%多聚甲醛固定。斷頭取出腦組織，作快速冰凍切片。分別行尼氏染色(4只/每組)和抗小清蛋白(6只/每組)免疫組化染色(試劑購自Sigma-Aldrich公司，美國)，觀察海馬區(qū)是否存在神經(jīng)元細(xì)胞和PV陽性中間神經(jīng)元細(xì)胞損害。

2　結(jié)　果

2.18-臂迷宮的訓(xùn)練時(shí)間在SAH術(shù)后20 w，采用8臂迷宮進(jìn)行記憶功能訓(xùn)練，為達(dá)到連續(xù)2 d吃完食物且正確率超過80%，假手術(shù)組和對照組組間無差異，分別為13.8 d和12.9 d，SAH組大鼠所需訓(xùn)練時(shí)間較其他兩組顯著延長，需要17.6 d(P<0.05)(見表1)。

表1　8-臂迷宮的訓(xùn)練天數(shù)±s)

與對照組和假手術(shù)相比*P<0.05

2.2大鼠8臂迷宮內(nèi)覓食的準(zhǔn)確率經(jīng)過第一、二階段訓(xùn)練后，各組大鼠被認(rèn)為已經(jīng)學(xué)會(huì)覓食，即：間隔15 min 3組準(zhǔn)確率超過80%，開始行記憶能力的檢測(見表2)。隨著間隔時(shí)間的延長，SAH組大鼠迷宮內(nèi)覓食準(zhǔn)確率較其它兩組低，在間隔2 h、3 h和6 h具有顯著性差異(P<0.05)。間隔12 h和24 h，3組無明顯差異，提示間隔如此長時(shí)間可能使動(dòng)物的整體記憶都明顯下降。檢查結(jié)束后，大鼠進(jìn)行間隔15 min檢查，3組動(dòng)物準(zhǔn)確率超過80%，大鼠在檢查過程中一直處于“學(xué)會(huì)”狀態(tài)。

2.3組織化學(xué)檢測8-臂迷宮測試結(jié)束后，取各組大鼠腦組織行組織學(xué)檢查。尼氏染色：結(jié)果顯示海馬區(qū)內(nèi)神經(jīng)元數(shù)目均無顯著差異。抗小清蛋白(PV)細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色：由于海馬區(qū)不同部位的容易損傷程度和功能不同，參照Han等[11]將海馬分為CA1、CA2、CA3和DG(齒狀回)(見圖1)。實(shí)驗(yàn)各組PV陽性中間神經(jīng)元細(xì)胞計(jì)數(shù)(見表3)。對照組和假手術(shù)組在4個(gè)分區(qū)中PV陽性中間神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量沒明顯差異；在 SAH組中，中間神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)在CA1區(qū)和DG較其他兩組明顯減少。

表2　8-臂迷宮記憶功能檢測 ±s)

與對照組和假手術(shù)相比*P<0.05

表3　海馬不同區(qū)PV陽性中間神經(jīng)元細(xì)胞 ( ±s/mm2)

與對照組和假手術(shù)組相比*P<0.01；與對照組和假手術(shù)相比#P<0.05

圖1抗PV免疫組化染色的海馬(10×)(A為對照組；B為假手術(shù)組；C為蛛網(wǎng)膜下腔出血組；D為海馬分區(qū)示意圖)

3　討　論

隨著顯微神經(jīng)外科和血管內(nèi)介入技術(shù)治療動(dòng)脈瘤技術(shù)不斷發(fā)展，SAH患者預(yù)后較前有明顯改善，其死亡率和嚴(yán)重致殘率明顯下降，但引起長期認(rèn)知功能損害目前并無有效治療方法，嚴(yán)重影響患者的社會(huì)回歸和生活質(zhì)量。本研究顯示，SAH大鼠20 w后，其學(xué)習(xí)能力和空間記憶能力較對照組和假手術(shù)組明顯下降，提示SAH大鼠存在長期認(rèn)知功能損害。

海馬在認(rèn)知功能中起重要作用，各種因素導(dǎo)致海馬損害是引起認(rèn)知損害的中心環(huán)節(jié)[5，11]，在臨床上可見一些患者SAH后海馬體積變小，與認(rèn)知功能下降正相關(guān)[12]。本研究中，通過尼氏染色，發(fā)現(xiàn)SAH大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量未見明顯減少，結(jié)果與Han等[5]研究結(jié)果一致。通過免疫組織化學(xué)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，海馬區(qū)GABA能中間神經(jīng)元細(xì)胞主要亞型PV陽性神經(jīng)元細(xì)胞在海馬的部分區(qū)域明顯減少，且以CA1區(qū)和DG下降明顯。

海馬CA1區(qū)與學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能最為密切，CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞對各種損害如缺氧、外傷和應(yīng)激等最敏感，且最容易受到傷害，而海馬的CA3區(qū)和DG區(qū)對各種損害的耐受性較高，因此CA1區(qū)神經(jīng)損害可作為研究認(rèn)知功能損害的組織學(xué)指標(biāo)。Ouyavg等[13]認(rèn)為CA1區(qū)神經(jīng)最容易損害可能與該區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞受損害有關(guān)。海馬其它部位在認(rèn)知功能生理過程中也具有重要作用，DG對于多源性感覺輸入、空間及相關(guān)聯(lián)圖形的分辨和顳葉長期記憶的整合等輔助編碼具有關(guān)鍵作用，DG到CA3連接在海馬的功能中起重要作用， DG病變可明顯損害動(dòng)物的近距離圖像的分辨，因此在8-臂迷宮訓(xùn)練中需要更長的時(shí)間[14,15]。此外，和海馬齒狀回顆粒下區(qū)(subgranular zone,SGZ)存在有再生功能的神經(jīng)干細(xì)胞,可分化成神經(jīng)元細(xì)胞，整合到海馬中，可能海馬的CA3區(qū)和DG區(qū)對各種損害的耐受性較高的原因之一。

小清蛋白(PV)是一種鈣結(jié)合蛋白，它只存在于靈長類和嚙齒類動(dòng)物特定的神經(jīng)元細(xì)胞亞群。PV陽性中間神經(jīng)元代表著高代謝和高電活動(dòng)的GABA能神經(jīng)元細(xì)胞亞群，是體現(xiàn)中樞神經(jīng)抑制系統(tǒng)的主要標(biāo)志，在控制該區(qū)神經(jīng)元活動(dòng)中起重要作用。該神經(jīng)元細(xì)胞可以選擇性與周圍其他神經(jīng)元細(xì)胞形成突觸，通過抑制這些神經(jīng)元細(xì)胞活動(dòng)調(diào)節(jié)其興奮性和活動(dòng)性。海馬區(qū)PV陽性中間神經(jīng)元細(xì)胞對于各種損害因素如持續(xù)慢性應(yīng)激反應(yīng)、缺血缺氧等非常敏感，容易受到損害[16]。而該神經(jīng)元細(xì)胞損害可導(dǎo)致動(dòng)物的認(rèn)知功能損害，最近Koh等[17]通過氯胺酮誘導(dǎo)小鼠PV陽性細(xì)胞損害后，動(dòng)物的認(rèn)知功能出現(xiàn)明顯損害；也有研究表明，該類型細(xì)胞減少，導(dǎo)致的抑制降低同樣會(huì)影響海馬區(qū)錐體細(xì)胞的功能，損傷學(xué)習(xí)和記憶能力[18]。

DG對各種損害的耐受性高，可能SGZ存在可增生的神經(jīng)干細(xì)胞有關(guān)，但本研究結(jié)果顯示，SAH引起DG區(qū)域 PV陽性中間神經(jīng)元細(xì)胞也明顯減少，說明DG 中的PV陽性中間神經(jīng)元細(xì)胞對有害反應(yīng)抵抗能力較差。最近，Wei等[19]報(bào)道，癲癇可誘導(dǎo) DG 中GABA能中間神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量減少，并認(rèn)為與神經(jīng)元細(xì)胞的再生抑制有關(guān)，SAH引起PV陽性中間神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量減少是否與抑制神經(jīng)干細(xì)胞再生有關(guān)仍需進(jìn)一步證實(shí)。

SAH引起中間神經(jīng)元細(xì)胞損害的機(jī)制仍不清楚，SAH可引起氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等，引起海馬區(qū)細(xì)胞凋亡，或抑制神經(jīng)元細(xì)胞再生等，導(dǎo)致該細(xì)胞數(shù)量明顯減少。我們課題組曾報(bào)道[4]，SAH后早期海馬區(qū)域局部興奮性氨基酸大量釋放和細(xì)胞Ca+超載等過度反應(yīng)，可能是引起一系列神經(jīng)損害如：自由基形成、細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)和各種損害基因表達(dá)等的啟動(dòng)位點(diǎn)，也可能是導(dǎo)致PV陽性細(xì)胞數(shù)量減少原因之一。

綜上所述，本研究證實(shí)SAH可導(dǎo)致大鼠的長期認(rèn)知功能損害，學(xué)習(xí)和記憶能力下降。SAH引起海馬CA1和DG區(qū)PV陽性神經(jīng)元細(xì)胞減少可能與大鼠的認(rèn)知功能損害有關(guān)，而SAH選擇性損害海馬CA1和DG區(qū)PV陽性神經(jīng)元細(xì)胞的機(jī)制還有待于進(jìn)一步深入研究。

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The study of long term dysfunction of cognition and its relationship with parvalbumin-postive interneurons at hippocampus in rats with subarachnoid hemorrhage

MAORenling,DUANYu,GAOXin,etal.

(DepartmentofNeurosurgery,HuadongHospital,FudanUniversity,Shanghai200040,China)

ObjectiveTo investigate the long-term cognitive impairment and the variation of parvalbumin-postive (PV) GABAergic interneurons following subarachnoid hemorrhage.MethodsThe Sprague-Dawley rats were randomly assigned to control,sham and SAH group.Twenty weeks later,the cognitive function was tested by 8-arm maze.Immunohistochemical study was used to detect PV-positive interneurons in hippocampus.ResultsCompared to the other two groups,SAH rats needed more days for training (P<0.05),that implied with the decreased ability in learning.In memorial test,all three groups had the same correct rate at the intervals of 1 h,12 h and 24 h,however,SAH rats showed a significant decrease at 2 h,3 h and 6 h (P<0.05).The number of PV-positive interneurons of SAH rats decreased significantly at CA1(P<0.01) and dentate gyrus (P<0.05).ConclusionSAH can cause long-term cognitive deficits in rats,which may cause by the decrease of PV-positive interneurons in CA1and DG.SAH leads to persist decrease some interneurons in hippocampus,which may be one of the key reasons for the long lasting cognitive impairment.

Subarachnoid hemorrhage;Cognitive impairment;Hippocampus;Parvalbumin-postive interneuron

1003-2754(2016)04-0292-04

2016-02-12；

2016-03-30

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(No.81271296)

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院神經(jīng)外科，上海 200040；2.加州大學(xué)圣地亞哥分校生物化學(xué)系細(xì)胞生物學(xué)專業(yè)，美國 加州 92093；3.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院神經(jīng)外科，上海 200040)

張法永，E-mail:zhangfayong66@sina.com

R743.35

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