王珍+趙昌林+駱敏翔

[摘要]目的 構(gòu)建含人HSP72的慢病毒，篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)HSP72的hUC-MSC細(xì)胞系。方法 采用PCR方法從MGC fully sequenced human HSPAIA cDNA中調(diào)取HSP72基因的完整序列，利用雙酶切及體外重組的方法獲得pLV-HSP72-EGFP（2A）質(zhì)粒，經(jīng)PCR、測(cè)序方式鑒定成功后，對(duì)病毒進(jìn)行包裝。用病毒感染hUC-MSC，并用Puro進(jìn)行抗性篩選可穩(wěn)定表達(dá)HSP72的hUC-MSC細(xì)胞系。結(jié)果 構(gòu)建的pLV-HSP72-EGFP（2A）測(cè)序結(jié)果與GenBank收錄序列一致，包裝得到pLV-HSP72-EGFP（2A）病毒，篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)HSP72的hUC-MSC細(xì)胞系，ELISA方法檢測(cè)顯示獲得的細(xì)胞株可過(guò)表達(dá)HSP72。結(jié)論 構(gòu)建了獲得穩(wěn)定表達(dá)HSP72的hUC-MSC細(xì)胞系。

[關(guān)鍵詞]HSP72；人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；慢病毒載體；轉(zhuǎn)染

[中圖分類(lèi)號(hào)] R329.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2016）09（b）-0004-05

[Abstract]Objective To construct Lenti-viral Vector carrying human HSP72 gene，and to screen the hUC-MSC cell line with stable expression of HSP72.Methods The human HSP72 cDNA was amplified from "MGC fully sequenced human HSPAIA cDNA" by PCR.pLV-HSP72-EGFP （2A） plasmid was obtained by double enzyme digestion and in vitro recombination，then was confirmed by PCR and DNA sequencing.The pLV-HSP72-EGFP （2A） virus was packaged.hUC-MSC was infected by the virus，and the hUC-MSC cell lines stably expressing HSP72 were screened by Puro.Results The recombinant pLV-HSP72-EGFP （2A） was constructed.The sequence was consistent with that reported in GenBank.The pLV-HSP72-EGFP （2A） virus was packaged and infected hUC-MSC.By ELISA，it was confirmed that the HSP72 protein could be expressed and secreted into the supernatant of hUC-MSC strain culture.Conclusion hUC-MSC cell line with stable expression of HSP72 is constructed.

[Key words]Heat shock protein 72；Human umbilical cord mesenchymal stem cell；Lenti-viral Vector；Transduction

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是老年癡呆中最常見(jiàn)的一種類(lèi)型，其患病率隨年齡增高而升高，在65歲以上人群中約為5%，85歲以上人群中約為20%[1]。有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分子伴侶的主要成分HSP72可以通過(guò)減少Aβ的聚集，促進(jìn)Aβ的清除，減少tau蛋白的過(guò)度磷酸化，減少神經(jīng)元的丟失，促進(jìn)神經(jīng)突觸的可塑性等途徑參與AD發(fā)病進(jìn)展的多個(gè)環(huán)節(jié)，是防治AD的非常有價(jià)值的靶點(diǎn)之一[2]?；蛑委熓墙陙?lái)研究熱度非常高的一種治療策略，借助基因治療，尋找一種穩(wěn)定、長(zhǎng)效腦內(nèi)表達(dá)HSP72的給藥方法和策略值得進(jìn)一步探討。本研究通過(guò)第三代慢病毒載體系統(tǒng)，將HSP72插入慢病毒載體，并選擇具有神經(jīng)細(xì)胞分化潛能、來(lái)源豐富、無(wú)倫理學(xué)爭(zhēng)議的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSC）作為工具細(xì)胞，建立一種HSP72過(guò)度表達(dá)與hUC-MSC移植結(jié)合起來(lái)的治療方法和策略，為進(jìn)一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)療效評(píng)估和應(yīng)用安全性評(píng)估奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

hUC-MSC是本實(shí)驗(yàn)室從健康新生兒臍帶卡通式膠中分離純化培養(yǎng)所得，DMEM培養(yǎng)基（Hyclone公司，SH30021），胎牛血清（Gibco公司，8180833）；CD105-PE、CD73-PE、CD90-PE（BD公司，65414），mouse IgG1-PE（BD公司，78454），CD45-FITC、CD34-FITC和HLA2DR-FITC（BD公司，89470）、mouse IgG1-FITC（BD公司，87592）和mouse IgG2a-FITC（BD公司，86738）；MSC成骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞分化試劑盒（Cyagen公司分裝）；MGC fully sequenced human HSPAIA cDNA（Open biosystem，Thermofisher公司，2933），pLV-EF1a-EGFP（2A）Puro慢病毒載體（北京英茂盛業(yè)科技有限公司，VL3404），EcoRI限制性?xún)?nèi)切酶（Takara公司，D1040A），BamHI限制性?xún)?nèi)切酶（Takara公司，D1010A），T4DNA連接酶（Thermo公司，EL0011），DNA回收試劑盒（美基生物科技有限公司），KOD Plus DNA聚合酶（TOYOBO公司，201）、XL1-Blue MRF′感受態(tài)細(xì)胞（輝駿生物科技有限公司凍存），慢病毒轉(zhuǎn)染試劑（輝駿生物科技有限公司分裝）；HSP72 ELISA檢測(cè)試劑盒（武漢新啟迪生物科技有限公司，EIA05352）。

1.2方法

1.2.1 hUC-MSC的培養(yǎng)及鑒定 經(jīng)產(chǎn)婦知情同意后，留取健康新生兒近臍端5～10 cm，小心剔除兩條臍動(dòng)脈，一條臍靜脈，保留卡通式膠，剪碎至1 mm3，接種于培養(yǎng)瓶。待細(xì)胞自組織塊爬出并融合至60%時(shí)，去除組織塊繼續(xù)培養(yǎng)，常規(guī)1∶2傳代。取第三代hUC-MSC用熒光抗體標(biāo)記和流式細(xì)胞儀檢測(cè)的方法進(jìn)行表面標(biāo)志物的鑒定，并按說(shuō)明書(shū)要求的步驟進(jìn)行向骨、脂肪、軟骨方向分化能力的誘導(dǎo)和鑒定。

1.2.2 目的基因調(diào)取 以MGC fully sequenced human HSPAIA cDNA為模板，設(shè)計(jì)兩條引物，分別為序列5′-3′AT GAATTCATGGCCAAAGCCGCGGCGATC（含EcoRI酶切位點(diǎn)）和序列5′-3′AT GGATCC CTAATCCACCTCCTCAATGGTGGGG（含BamHI酶切位點(diǎn)），引物序列送廣州輝駿生物科技有限公司合成，做PCR調(diào)取目標(biāo)片段HSP72并純化回收。

1.2.3慢病毒載體的構(gòu)建及包裝 用EcoRI和BamHI酶切HSP72純化產(chǎn)物和慢病毒表達(dá)載體，基因片段與載體做連接反應(yīng)，獲得pLV-HSP72-EGFP（2A），轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞包裝，挑取檢測(cè)陽(yáng)性的菌落搖菌，抽提質(zhì)粒陽(yáng)性克隆送測(cè)序驗(yàn)證。按慢病毒表達(dá)系統(tǒng)操作手冊(cè)對(duì)構(gòu)建的慢病毒載體進(jìn)行包裝，進(jìn)行滴度測(cè)定，分裝凍存。

1.2.4慢病毒轉(zhuǎn)染及穩(wěn)表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建 第1天將hUC-MSC接種至6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜，添加含pLV-HSP72-EGFP（2A）病毒的細(xì)胞培養(yǎng)液（計(jì)算MOI值為200），感染6 h后，棄去含病毒的培養(yǎng)液，更換常規(guī)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，第4天傳代后觀察轉(zhuǎn)染率可達(dá)50%～60%，第5天更換含0.5 μg/ml Puro的培養(yǎng)液繼續(xù)進(jìn)行抗性篩選，3 d換液一次，以未感染病毒的hUC-MSC做對(duì)照，篩選持續(xù)到第12天，此時(shí)對(duì)照組未感染病毒的hUC-MSC幾乎全部死亡，可獲得穩(wěn)定表達(dá)HSP72的hUC-MSC細(xì)胞株。

1.2.5 HSP72蛋白表達(dá) 用ELISA的方法檢測(cè)該細(xì)胞株培養(yǎng)上清液HSP72的過(guò)表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)方法依照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以pLV-EGFP（2A） hUC-MSC和未感染病毒的hUC-MSC做對(duì)照。

2結(jié)果

2.1 hUC-MSC的獲得和鑒定

自第7天開(kāi)始有hUC-MSC從組織塊中爬出，細(xì)胞不斷增殖并傳代，細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣克隆性生長(zhǎng)，培養(yǎng)至2周左右，細(xì)胞呈均一的紡錘形，呈旋渦狀生長(zhǎng)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示CD105、CD73、CD90陽(yáng)性標(biāo)志物表達(dá)量均>95%，而陰性標(biāo)志物CD45、CD34和HLA2DR均<1%。提示hUC-MSC成骨、成軟骨、成脂誘導(dǎo)分化后，均有陽(yáng)性物質(zhì)檢出。

2.2質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶切，在2000 bp±、1000 bp±處可獲得兩條預(yù)計(jì)條帶，分別與1926 bp的HSP72和9549 bp的pLV-EF1a-EGFP（2A）Puro慢病毒載體相一致。基因片段與載體做連接反應(yīng)，獲得pLV-HSP72-EGFP（2A），轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞包裝，挑取檢測(cè)陽(yáng)性的菌落搖菌，抽提質(zhì)粒陽(yáng)性克隆送測(cè)序驗(yàn)證，分5段測(cè)序，拼接后與目的基因序列一致。

2.3穩(wěn)定表達(dá)HSP72的hUC-MSC細(xì)胞株的獲得

感染第4天，可看到感染組綠色熒光表達(dá)，表達(dá)率為50%～60%，加入Puro進(jìn)行抗性篩選后hUC-MSC對(duì)照組的細(xì)胞陸續(xù)壞死消融，pLV-HSP72-EGFP（2A） hUC-MSC和pLV-EGFP（2A） hUC-MSC組未轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞壞死，轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞不斷增殖，熒光顯微鏡下顯示綠色熒光表達(dá)量逐漸增多，篩選至12 d停止抗性篩選，收集細(xì)胞凍存?zhèn)溆茫▓D4）。

取pLV-HSP72-EGFP（2A） hUC-MSC、pLV-EGFP（2A） hUC-MSC和hUC-MSC對(duì)照組培養(yǎng)液上清進(jìn)行ELISA檢測(cè)，結(jié)果顯示pLV-HSP72-EGFP（2A） hUC-MSC細(xì)胞上清中的HSP72濃度為（14.14±1.76）pg/ml，明顯高于pLV-EGFP（2A） hUC-MSC對(duì)照組和hUC-MSC對(duì)照組（P<0.05），而pLV-EGFP（2A） hUC-MSC和hUC-MSC兩組表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3討論

隨著人口老齡化的進(jìn)程，AD發(fā)病率逐年提高，其特征性病理特征為：神經(jīng)元胞外β淀粉樣蛋白沉積形成的老年斑（SP），tau蛋白過(guò)度磷酸化形成的神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)（NFTs），神經(jīng)元、突觸的大量丟失[3]。Di等[4]在AD進(jìn)展的調(diào)查中進(jìn)行了一個(gè)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，結(jié)果顯示，輕度認(rèn)知障礙的患者海馬區(qū)、顳葉腦區(qū)內(nèi)的伴有多種HSPs（HSP27，HSP32，HSP60，HSP70，HSP90）表達(dá)量的增加，并建議HSPs作為AD的早期診斷監(jiān)測(cè)指標(biāo)，HSPs也可能成為治療AD的合適靶點(diǎn)之一。國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究顯示HSP70參與AD多個(gè)環(huán)節(jié)，可減少Aβ聚集、促進(jìn)Aβ清除、減少tau蛋白過(guò)度磷酸化、減少神經(jīng)元丟失，拮抗AD[5]。有研究顯示，替普瑞酮能誘導(dǎo)大鼠海馬區(qū)HSP70表達(dá)，進(jìn)而抑制線粒體凋亡途徑及部分死亡受體凋亡途徑的激活發(fā)揮抗凋亡作用，神經(jīng)元損傷下調(diào)，可見(jiàn)HSP70不僅作為細(xì)胞內(nèi)蛋白發(fā)揮作用，還可以通過(guò)旁分泌的途徑從免疫調(diào)節(jié)等其他方面發(fā)揮拮抗AD的作用[6]。本課題組在AD的防治方面進(jìn)行了大量的前期工作，提出通過(guò)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式構(gòu)建過(guò)表達(dá)HSP70的干細(xì)胞，移植后可長(zhǎng)期穩(wěn)定地表達(dá)HSP70，可能是治療AD的有效途徑。前期研究構(gòu)建腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HSP70至大鼠神經(jīng)干細(xì)胞，離體和在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均顯示可提高學(xué)習(xí)記憶功能，拮抗AD進(jìn)展[7]。但腺病毒存在免疫原性高，易被機(jī)體清除的致命弱點(diǎn)，故本研究將從尋找更佳的工具細(xì)胞（無(wú)創(chuàng)獲取、多代次傳代、可在體內(nèi)長(zhǎng)期存活、具備神經(jīng)再生功能、易推廣）和更佳的轉(zhuǎn)染方式（長(zhǎng)期穩(wěn)定的表達(dá)目的蛋白）入手，進(jìn)一步探討。

基因治療已經(jīng)作為一種手段進(jìn)行臨床疑難疾病的治療，初顯成效。其中工具細(xì)胞的選擇至關(guān)重要，間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymalstemcells，MSC）作為間葉組織的干細(xì)胞，既可以自我更新和繁殖，也可以分化成為多種組織成分，且其免疫原性低，在異體移植時(shí)不易發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，這些特性使MSC成為組織工程研究的熱門(mén)工具細(xì)胞。文獻(xiàn)報(bào)道從骨髓、臍帶血、脂肪、胎盤(pán)、臍帶等多種組織均能分離得到MSC，目前，用于構(gòu)建組織工程的工具細(xì)胞常選擇骨髓MSC，但隨著年齡的增長(zhǎng)，骨髓MSC細(xì)胞數(shù)量和增殖能力均顯著下降。本研究選擇hUC-MSC作為工具細(xì)胞有三方面優(yōu)勢(shì)：①臍帶來(lái)自產(chǎn)婦生產(chǎn)過(guò)程中的廢棄物，獲取方便，不存在倫理學(xué)爭(zhēng)議。②hUC-MSC免疫原性低，甚至有報(bào)道顯示MSC有類(lèi)似免疫抑制劑的作用，目前已有大量關(guān)于MSC與造血干細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用，減少移植物抗宿主病的文獻(xiàn)報(bào)道[8]，hUC-MSC已被批準(zhǔn)異體應(yīng)用于預(yù)防GVHD。故異體移植后能長(zhǎng)期存活在患者體內(nèi)，表達(dá)目的基因，持續(xù)發(fā)揮治療效果。③hUC-MSC在體內(nèi)外因素的誘導(dǎo)下，可分化為神經(jīng)樣細(xì)胞[9-10]，主要包括神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞，且已有hUC-MSC治療腦傷損性疾病的臨床試驗(yàn)研究報(bào)道，結(jié)果顯示有一定臨床應(yīng)用價(jià)值[11]。分化后的神經(jīng)樣細(xì)胞除了繼續(xù)表達(dá)轉(zhuǎn)染的基因發(fā)揮治療效果外，分化后的細(xì)胞本身對(duì)AD也起到神經(jīng)修復(fù)作用。本研究選擇hUC-MSC作為工具細(xì)胞，并根據(jù)國(guó)際細(xì)胞療法間充質(zhì)與組織干細(xì)胞委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)[12]，對(duì)獲得的hUC-MSC從形態(tài)學(xué)、表面標(biāo)志物、多向分化潛能方面進(jìn)行鑒定。

基因治療的另一關(guān)鍵問(wèn)題在于如何將目的基因準(zhǔn)確無(wú)誤地導(dǎo)入靶細(xì)胞，并使其在宿主細(xì)胞中高效穩(wěn)定地表達(dá)，因此，理想的載體應(yīng)具備以下條件：①轉(zhuǎn)染能力強(qiáng)，能夠轉(zhuǎn)染處于分裂期和非分裂期的各種細(xì)胞；②細(xì)胞毒性低或無(wú)細(xì)胞毒性；③能夠保證目的基因高效轉(zhuǎn)染和長(zhǎng)期表達(dá)；④載體容量大，可用于構(gòu)建多基因的共表達(dá)系統(tǒng)；⑤易合成，穩(wěn)定性好，便于濃縮和純化；⑥缺乏自我復(fù)制能力，可控性高。目前，常用的基因轉(zhuǎn)移載體包括質(zhì)粒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、慢病毒等，這些轉(zhuǎn)移介質(zhì)中，質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率很低，使用價(jià)值不大。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體則難以達(dá)到高滴度，只能轉(zhuǎn)染處于分裂期的靶細(xì)胞，而且它可以整合至靶細(xì)胞染色體的任意位置，有插入突變的潛在危險(xiǎn)，不適合臨床應(yīng)用。腺病毒雖然能夠轉(zhuǎn)染分裂期和非分裂期的細(xì)胞，但因其只能實(shí)現(xiàn)瞬時(shí)表達(dá)，不能發(fā)揮遠(yuǎn)期療效，且反復(fù)應(yīng)用易引起嚴(yán)重的免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致療效下降。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的慢病毒載體克服了上述轉(zhuǎn)染載體的諸多劣勢(shì)，其轉(zhuǎn)染能力強(qiáng)，載體容量大，此外還具備免疫反應(yīng)小，無(wú)復(fù)制能力等諸多優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用[13-14]。蘇玉金等[15]的研究顯示，腺病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染率骨髓MSC的轉(zhuǎn)染率僅為49.1%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于慢病毒載體的91.4%（P<0.01），提示以慢病毒為載體的轉(zhuǎn)染方式更適合干細(xì)胞的基因?qū)搿?/p>

本研究從GeneBank中獲取了人類(lèi)HSP70家族的主要成分HSP72的基因[基因名稱(chēng)HSPA1A，piens heat shock 70kDa protein 1A，mRNA（cDNA clone MGC：15236 IMAGE：4123837）]，選擇新一代的非融合性、雙啟動(dòng)子pLV-EF1a-EGFP（2A）Puro慢病毒載體，通過(guò)酶切和重組的方式獲得了pLV-HSP72-EGFP（2A），經(jīng)PCR、多酶切鑒定及測(cè)序的方式比對(duì)正確后，采用感受態(tài)細(xì)胞對(duì)該病毒進(jìn)行包裝。pLV-HSP72-EGFP（2A）病毒感染hUC-MSC，用puro抗性基因篩選三代后，獲得穩(wěn)表達(dá)HSP72的pLV-HSP72-EGFP（2A） hUC-MSC細(xì)胞系。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，pLV-HSP72-EGFP（2A） hUC-MSC培養(yǎng)液上清中的HSP72表達(dá)量明顯高于pLV-EGFP（2A） hUC-MSC細(xì)胞和hUC-MSC對(duì)照組，而pLV-EGFP（2A） hUC-MSC細(xì)胞和hUC-MSC對(duì)照組培養(yǎng)上清液中的HSP72表達(dá)量無(wú)明顯差別。pLV-HSP72 hUC-MSC細(xì)胞系的建立，為進(jìn)一步HSP72治療AD的實(shí)驗(yàn)研究提供工具和基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2016-06-20 本文編輯：王紅雙）