布仁其其格，高雅罕，任秀娟，包艷青，魏睿元，趙一萍，韓海格，烏云達來，黃金龍，芒 來,*（.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)蒙古馬遺傳資源保護及馬產(chǎn)業(yè)工程實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 0008；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 000）

不同發(fā)酵時期酸馬奶細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

布仁其其格1,2，高雅罕1，任秀娟1，包艷青1，魏睿元1，趙一萍1，韓海格1，烏云達來1，黃金龍1，芒 來1,*
（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)蒙古馬遺傳資源保護及馬產(chǎn)業(yè)工程實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110）

以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增16S rRNA基因序列采用454焦磷酸測序方法分析酸馬奶傳統(tǒng)發(fā)酵過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)演替變化。結(jié)果表明：在發(fā)酵的初期細(xì)菌多樣性最高，而細(xì)菌豐度在72 h時最高；硬壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）為酸馬奶中的優(yōu)勢細(xì)菌門；乳桿菌 屬（Lactobacillus）和乳球菌屬（Lactococcus）為其優(yōu)勢細(xì)菌屬；隨著發(fā)酵時間的延長，各個細(xì)菌門與屬都存在上升或下降的趨勢變化。本研究可為其他乳制品發(fā)酵過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)研究提供借鑒。

酸馬奶；傳統(tǒng)發(fā)酵；細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)；16S rRNA

布仁其其格, 高雅罕, 任秀娟, 等. 不同發(fā)酵時期酸馬奶細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(11): 108-113. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201611019. http://www.spkx.net.cn

Burenqiqige, GAO Yahan, REN Xiujuan, et al. Dynamic changes of bacteria community structure during koumiss fermentation[J]. Food Science, 2016, 37(11): 108-113. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201611019. http://www.spkx.net.cn

傳統(tǒng)發(fā)酵酸馬奶是以馬奶為原材料與發(fā)酵劑混合，在平均20～23 ℃溫度下定時上下?lián)v拌一定次數(shù)，發(fā)酵2～3 d即可成為略帶酸味、微噴酒香、沁人心脾、清爽適口的發(fā)酵乳飲品。發(fā)酵劑為上一個發(fā)酵周期保留的酸馬奶或上一年度酸馬奶通過直接冷凍保存或借助媒介（比如：蘸吸酸馬奶的干凈皮子、氈塊、米、野果等）干燥保留物，其中含有復(fù)雜的微生物群落結(jié)構(gòu)，長期連續(xù)參與到酸馬奶發(fā)酵中對其品質(zhì)起到及其重要的作用。

酸馬奶發(fā)酵微生物中細(xì)菌是重要組成部分。1985年，研究已發(fā)現(xiàn)酸馬奶中包含乳桿菌和乳球菌[1]。在新疆地區(qū)[2]、內(nèi)蒙古錫林郭勒盟[3]以及蒙古國[4]采集的傳統(tǒng)發(fā)酵酸馬奶中分別分離培養(yǎng)出不同數(shù)量的乳桿菌菌株。Hao等[5]采用變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技術(shù)研究了酸馬奶中細(xì)菌生物多樣性，而劉芳等[6]采用16S rRNA基因測序技術(shù)分析了酸馬奶乳酸菌菌群多樣性。伴隨分子生物學(xué)研究手段的引入對于酸馬奶中細(xì)菌的研究已取得了一定成果。然而，基于某一固定時間點采樣研究自然發(fā)酵酸馬奶中細(xì)菌群落，不能全面、客觀了解酸馬奶發(fā)酵過程中細(xì)菌群落的真實存在狀態(tài)和動態(tài)變化過程。2001年，殷文政等[7]采用傳統(tǒng)方法對酸馬奶傳統(tǒng)發(fā)酵過程中細(xì)菌進行分類鑒定，初步了解群落結(jié)構(gòu)動態(tài)變化情況。由于培養(yǎng)基方法的局限性[8]無法全面反映真實狀況，因此必須運用相對更加精確的技術(shù)研究酸馬奶發(fā)酵過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化情況。

細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性研究中應(yīng)用越來越多的方法是對所提取到的環(huán)境微生物宏基因組DNA進行16S rRNA基因（rDNA）序列的分析。16S rRNA基因全長為 1 542 bp，由 9 個可變區(qū)（V1～V9）和10 個保守區(qū)組成，保守區(qū)反映物種間的親緣關(guān)系，而可變區(qū)則揭示物種間的差異，適用于各類細(xì)菌生物進化和系統(tǒng)分類學(xué)研究[9]。針對16S rRNA基因的保守區(qū)域設(shè)計引物，所得不同的序列代表不同的菌種，經(jīng)測序分析便可確定群落結(jié)構(gòu)和多樣性。

近年來，迅速發(fā)展并推廣應(yīng)用的第2代高通量測序技術(shù)被應(yīng)用到對16S rRNA基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物測序中，可以同時對數(shù)十萬甚至數(shù)百萬序列片段進行測序且互不干擾[10]。高通量測序平臺中Roche公司454焦磷酸測序儀測序單序列讀長長（目前升級后的GS FLX＋最長可達到1 000 bp）、可重復(fù)性和精確性高，已被廣泛應(yīng)用于如海洋、湖泊、空氣、土壤、礦井、發(fā)酵食品[11]、反芻動物瘤胃、人類口腔及腸道等多種環(huán)境樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性研究。

為了探究傳統(tǒng)發(fā)酵過程中酸馬奶細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化過程，在內(nèi)蒙古錫林郭勒盟鑲黃旗選取當(dāng)?shù)蒯勚扑狁R奶時間最久，品質(zhì)最具有代 表性的牧戶，模擬其發(fā)酵酸馬奶過程進行樣品采集。后期對細(xì)菌16S rRNA基因序列進行454焦磷酸測序以及序列分析，從非培養(yǎng)水平上闡述酸馬奶發(fā)酵過程中細(xì)菌種群多樣性和群落結(jié)構(gòu)動態(tài)變化規(guī)律，結(jié)果將對酸馬奶傳統(tǒng)發(fā)酵過程中微生物動態(tài)變化研究，酸馬奶發(fā)酵機理研究，產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)控等具有實際的參考意義。

1 材料與方法

1.1 試劑

E.Z.N.A Soil DNA提取試劑盒 美國Omega公司；DL2000 DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、TransStart Fastpfu DNA Polymerase、Taq DNA聚合酶、10×Loading Buffer、6×Loading Buffer 日本TaKaRa公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Roche GS FLX 基因組測序儀 瑞士羅氏公司；UVP CDS-8000凝膠成像分析系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；Eppendorf 5810R臺式高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；GeneAmp?9700型PCR儀 美國ABI公司；QuantiFluor?-ST藍色熒光定量系統(tǒng) 美國Promega公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品

2013年7月，在內(nèi)蒙古錫林郭勒盟鑲黃旗，參照牧戶家做法釀制酸馬奶。發(fā)酵劑采用牧民家中酸馬奶，鮮馬奶與發(fā)酵劑以體積比13∶1混勻，一個體系3.5 L，共有3 個平行發(fā)酵（編號A、B、C），溫度為（22±2） ℃。每隔2.5 h搗拌300 次，每日共5 次。收集0～96 h的樣品，采樣之前測定pH值，液氮保存樣品帶回實驗室。

1.3.2 宏基因組DNA提取與檢測

選取0、12、24、48、72、96 h等6 個時期樣品，采用E.Z.N.A Soil DNA提取試劑盒按說明提取酸馬奶宏基因組DNA。

1.3.3 PCR擴增16S rRNA 基因序列V1～V3區(qū)

20 μL反應(yīng)體系：5×Fast Pfu Buffer 4 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、Forward Primer（5 μmol/L）0.8 μL、Reverse Primer（5 μmol/L）0.8 μL、FastPfu Polymerase 0.4 μL、Template DNA 10 ng，補ddH2O至20 μL。

引物序列為：27F 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3’，533R 5’-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’，測序起始端為533R，引物中加入7 個核苷酸標(biāo)簽（barcode）。PCR擴增條件為：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共27 個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。

1.3.4 樣品平衡及測序

PCR產(chǎn)物檢測定量，按每個樣品100 nmol/L的濃度將DNA樣品（每個樣品的核苷酸標(biāo)簽barcode不重復(fù)）混為一管，上機測序，由上海美吉生物公司完成。

1.3.5 高質(zhì)量序列篩選

篩選原則：序列barcode和引物必須完整；序列的長度大于300 bp；整條序列上質(zhì)量大于20的堿基所占比例須高于93%。

1.3.6 生物信息學(xué)處理

使用QIIME（v1.4.0）分析平臺開展序列的生物信息學(xué)分析[12-13]。PyNAST校準(zhǔn)排齊[14]序列，以100%相似性進行UCLUST歸并從而建立無重復(fù)的533R→27F序列集。采用兩步UCLUST歸并，在100%相似性歸并的基礎(chǔ)上進一步進行97%相似性的歸并，從而建立分類操作單元（operational taxonomic units，OTUs）。ChimeraSlayer[15]去除可能存在嵌合體序列的OTU，繼而使用核糖體數(shù)據(jù)庫項目（Ribosomal Database Project，RDP）工具classifi er[16]貝葉斯算法對OTU代表序列進行分類學(xué)鑒定。FastTree軟件[17]生成OTU代表序列的系統(tǒng)發(fā)育進化樹，在此基礎(chǔ)上進行Alpha多樣性計算。Alpha多樣性包括超1指數(shù)（Chao1 index）和香農(nóng)指數(shù)（Shannon index），分別對樣品菌群構(gòu)成的豐度和多樣性進行評價。

香農(nóng)指數(shù)計算公式為：

式中：Sobs為實際測量出的OUTs數(shù)目；ni為含有i 條序列的OTUs數(shù)目；N為所有的序列數(shù)。

超1指數(shù)計算公式為：

式中：SChao1為估計的OUTs數(shù)；Sobs為實際測量出的OUTs數(shù)；n1為只有一條序列的OTUs數(shù)目；n2為只有兩條序列的OTUs數(shù)目。用于指數(shù)評估的OTUs相似水平97%。

同時使用稀疏曲線（rarefaction curve）和香農(nóng)指數(shù)曲線評估每個樣本測序的多樣性以及在不同的OTUs劃分水平下的多樣性，以評價測序量是否能夠代表原始群落的多樣性?；赨niFrac[18]距離對樣品之間進行加權(quán)（weighted）和非加權(quán)（unweighted）的主坐標(biāo)分析（principal coordinate analysis，PCoA），同時采用基于UniFrac的非加權(quán)組平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）進行樣品聚類。

1.3.7 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析及圖表繪制

基于Matlab R2011b（The MathWorks, Natick, MA, USA）軟件，使用多元方差分析（multivariate analysis of variance，MANOVA）對不同時間點的酸馬奶細(xì)菌菌群群落結(jié)構(gòu)的差異進行顯著性分析，作圖采用Origin 8.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品16S rRNA基因序列質(zhì)量評估

通過454焦磷酸高通量測序，18 個樣品共產(chǎn)生67 514 條高質(zhì)量16S rRNA基因序列，每個樣品平均產(chǎn)生3 750 條。經(jīng)過PyNAST alignment和100%序列鑒定聚類分析后，共得到11 456 條代表性序列。繼而根據(jù)序列的97%相似性進行OTU劃分及嵌合體檢查，得到477 個OTUs進行下一步分析。

圖1 稀疏曲線Fig. 1 Sparse curve

圖2 香農(nóng)指數(shù)圖Fig. 2 Shannon index map

依據(jù)當(dāng)前的測序量每個樣品的稀疏曲線不能進入平臺期（圖1），但是Shannon多樣性曲線已經(jīng)飽和（圖2），表明即使隨著測序量的增加新的種系型可能會被發(fā)現(xiàn)，但是細(xì)菌多樣性已經(jīng)不再隨之發(fā)生變化，現(xiàn)有測序量可以反映樣品中絕大多數(shù)的細(xì)菌物種信息。

2.2 序列豐度和多樣性分析

圖3 酸馬奶發(fā)酵過程中Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和pH值變化Fig. 3 Changes in Chao1 index, Shannon index and pH level during the fermentation process of koumiss

以Chao1指數(shù)對不同發(fā)酵時間點酸馬奶中細(xì)菌菌群豐度進行評價，如圖3所示，顯示出發(fā)酵過程中細(xì)菌的豐度具有明顯的起伏變化。發(fā)酵起始12 h后細(xì)菌開始大量繁殖直至24 h，此后繁殖速率下降在48 h時細(xì)菌豐度最低，而72 h時轉(zhuǎn)為豐度最高。由圖3中Shannon指數(shù)變化情況可知，在酸馬奶發(fā)酵過程中細(xì)菌多樣性存在上下波動。0 h時樣品中細(xì)菌的多樣性較高，主要來源于發(fā)酵劑，隨著發(fā)酵時間的延長多樣性逐漸下降，而在72 h時其豐度會增至最高。

Chao1指數(shù)與Shannon指數(shù)變化規(guī)律表明在酸馬奶發(fā)酵24 h之內(nèi)細(xì)菌群落內(nèi)部存在激烈的生存競爭，部分菌群取得生存優(yōu)勢而大量繁殖。而24 h之后的生存環(huán)境更加惡化，直至48 h之后pH值變化緩慢趨于穩(wěn)定期，細(xì)菌豐度與多樣性都在增高，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與營養(yǎng)供給[19]和環(huán)境酸度[20]有關(guān)。

2.3 基于門屬水平的不同發(fā)酵時間點酸馬奶細(xì)菌構(gòu)成的研究

采用RDP數(shù)據(jù)庫同源性序列比對與聚類相結(jié)合的方法對序列進行鑒定，產(chǎn)生了17 個門，其中含量最多的2 個細(xì)菌門占到了測序序列總數(shù)的98.91%，分別為硬壁菌門（Firmicutes，85.55%）和變形菌門（Proteobacteria，13.36%）。此外檢測到擬桿菌門（Bacteroidetes，0.59%）、放線菌門（Actinobacteria，0.36%）、氰基細(xì)菌（Cyanobacteria，0.05%）和棲熱菌門（Deinococcus-Thermus，0.001%）所占比例較低。新疆地區(qū)酸馬奶研究[21]顯示優(yōu)勢細(xì)菌門同樣是硬壁菌門（95%以上），其次為變形菌門（低于5%），兩個地區(qū)酸馬奶發(fā)酵的優(yōu)勢細(xì)菌門相同，比例上存在差異。

圖4 基于門水平的不同發(fā)酵時間點酸馬奶細(xì)菌豐度變化Fig. 4 Changes in bacterial abundance at phylum level during the fermentation process of koumiss

由圖4可知，酸馬奶發(fā)酵至48 h硬壁菌門含量呈現(xiàn)出上升的趨勢，而后開始下降至72 h，隨后趨于穩(wěn)定。細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)中硬壁菌門在酸馬奶發(fā)酵過程中一直占據(jù)主導(dǎo)地位，是酸馬奶發(fā)酵的優(yōu)勢細(xì)菌門。變形菌門是酸馬奶發(fā)酵的次優(yōu)勢細(xì)菌門，其序列數(shù)量變化呈現(xiàn)出與硬壁菌門相反的趨勢，表明在發(fā)酵過程中兩者之間存在相互作用。

經(jīng)序列比對法對序列進行鑒定共得到54 個屬，有0.25%的序列不能鑒定到屬水平，表明酸馬奶發(fā)酵過程中細(xì)菌具有豐富的多樣性，還有發(fā)現(xiàn)新的菌種的可能性。分類結(jié)果顯示在酸馬奶傳統(tǒng)制作過程中乳桿菌屬（Lactobacillus）為優(yōu)勢細(xì)菌屬，乳球菌屬（Lactococcus）為次優(yōu)勢細(xì)菌屬。殷文正等[7]在其研究中也發(fā)現(xiàn)酸馬奶發(fā)酵過程中乳桿菌屬為優(yōu)勢細(xì)菌屬。酸馬奶發(fā)酵過程中細(xì)菌在屬水平上的多樣性動態(tài)變化如圖5所示，在發(fā)酵起始12 h后乳桿菌屬的繁殖速率加快，此時環(huán)境中酸度值能夠滿足其啟動生長，24 h后其含量又呈現(xiàn)出下降的趨勢，可能是菌群大量繁殖后出現(xiàn)了養(yǎng)分競爭而抑制了繁殖速率。與此相比，發(fā)酵起始后酸馬奶中乳球菌屬繁殖速率較快，至12 h后隨著乳桿菌屬數(shù)量增多其繁殖速率開始下降，當(dāng)乳桿菌屬自24 h開始數(shù)量下降時其繁殖速率又升高。72 h后乳桿菌屬數(shù)量增加，而乳球菌屬數(shù)量減少，在發(fā)酵過程中似乎兩者之間存在某種相互作用；酸馬奶發(fā)酵起始所含醋酸菌屬（Acetobacter）、不動桿菌屬（Acinetobacter）等多個細(xì)菌屬數(shù)量在發(fā)酵過程中減少，只有醋酸菌屬在48 h后其數(shù)量明顯增多；酸馬奶發(fā)酵過程中檢測到埃希菌屬（Escherichia）和志賀菌屬（Shigella）等致病菌，其平均含量為0.5%，發(fā)酵過程中受到抑菌活性物質(zhì)[22]以及酸度變高[23]等影響數(shù)量越來越少。

圖5 基于屬水平的不同發(fā)酵時間點酸馬奶細(xì)菌豐度變化Fig. 5 Changes in bacterial abundance at genus level during the fermentation process of koumiss

2.4 基于多元統(tǒng)計方法的不同時間點酸馬奶細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的比較分析

基于UniFrac的加權(quán)和非加權(quán)主坐標(biāo)分析，其第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）的貢獻率分別為65.23%和17.80%、25.97%和10.32%?；赨niFrac的加權(quán)（圖6）和非加權(quán)主坐標(biāo)分析圖（圖7）結(jié)果基本一致，即0 h時3 組樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)是相似的，隨著發(fā)酵時間的延長，A、B兩組樣品呈現(xiàn)出一定的交疊現(xiàn)象，說明A、B兩組樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出一定的相似性。而C組樣品呈現(xiàn)出一定的聚類趨勢，說明C組樣品相對于A、B兩組樣品來講具有自己特殊的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明酸馬奶傳統(tǒng)發(fā)酵過程中，除了溫度與搗拌次數(shù)以外還有其他因素容易影響到細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)而使其發(fā)生改變。

MANOVA基于Weighted Unifrac PCoA前85%主成分分析基礎(chǔ)上的馬斯距離聚類結(jié)果顯示（圖8），0 h酸馬奶的細(xì)菌菌群群落結(jié)構(gòu)與其他時間具有極顯著差異（P＜0.001）。12、72 h與96 h之間酸馬奶細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異不顯著（P＞0.05），24 h與48 h之間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異不顯著（P＞0.05），然而12、72、96 h與24、48 h之間酸馬奶細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異極顯著（P＜0.001）。經(jīng)過不同時間點酸馬奶細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的比較分析發(fā)現(xiàn)酸馬奶發(fā)酵過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著動態(tài)變化。細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化差異性將發(fā)酵過程大體劃分為3 個階段，即0～12、24～48、72～96 h。

圖6 基于操作分類單元（9977%相似水平）相對含量的不同發(fā)酵時間點酸馬奶細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)Unifrac加權(quán)PCoA分析分布圖Fig. 6 Principal coordinate analysis (PCoA) score plot based on the relative abundance of OTUs (97% similarity level) at different time points during the fermentation process of koumiss

圖7 基于操作分類單元（9977%相似水平）相對含量的不同發(fā)酵時間點酸馬奶細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)Unifrac非加權(quán)PCoA分析分布圖Fig. 7 Principal coordinate analysis (PCoA) score plot based on the relative abundance of OTUs (97% similarity level) of bacterial community structure atdifferent time points during the fermentation process of koumiss

圖8 基于MANOVA分析的不同發(fā)酵時間點酸馬奶細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)馬斯距離聚類分析Fig. 8 Mahalanobis distance cluster analysis based on MANOVA analysis of bacterial community structure at different time points during the fermentation process of koumiss

2.5 核心細(xì)菌群分析

研究發(fā)現(xiàn)不同的發(fā)酵時間點酸馬奶中細(xì)菌菌群構(gòu)成差異較大，但經(jīng)過進一步分析發(fā)現(xiàn)它們具有相同的核心菌群。由18 個樣品所得477 個OTUs中，有24 個OTUs存在于所有的樣品，其中1 個OTU為巨型球菌屬，9 個OTUs為乳球菌屬，13 個OTUs為乳桿菌屬，1個OTU為醋酸菌屬，即在酸馬奶發(fā)酵96 h過程中有4 個菌屬一直存在，對于酸馬奶品質(zhì)具有決定性作用，其分別為乳桿菌屬（51.06%）、乳球菌屬（30.29%）、醋酸菌屬（7.13%）和巨型球菌屬（0.70%）。

3 結(jié) 論

通過454焦磷酸高通量測序技術(shù)，得到了足夠的細(xì)菌16S rRNA基因高質(zhì)量序列，經(jīng)分析揭示了酸馬奶傳統(tǒng)發(fā)酵過程中細(xì)菌多樣性變化情況。酸馬奶發(fā)酵過程中存在豐富的細(xì)菌多樣性，其中硬壁菌門和變形菌門為優(yōu)勢細(xì)菌門，乳桿菌屬為優(yōu)勢細(xì)菌屬。

在酸馬奶發(fā)酵過程中，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著的演替變化。發(fā)酵初期細(xì)菌多樣性最高，主要來源于發(fā)酵劑。在發(fā)酵過程中不同菌群之間存在激烈的生存競爭和互生關(guān)系。酸馬奶發(fā)酵微生物中酵母菌[24]也是重要組成部分，將酵母菌等真核微生物一同進行分析是今后研究的重點。

基于非培養(yǎng)方法的分子生物學(xué)手段研究細(xì)菌多樣性雖然有著諸多優(yōu)點，但是基因測序只能知道相對物種豐度，只能得到數(shù)據(jù)庫里已知物種無法確定新物種，無法得到菌體。因此在研究中應(yīng)結(jié)合分離培養(yǎng)、形態(tài)觀察、生理生化特征鑒定等傳統(tǒng)方法，互相取長補短，才能更深入地揭示酸馬奶中微生物世界的奧秘。

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Dynamic Changes of Bacteria Community Structure during Koumiss Fermentation

Burenqiqige1,2, GAO Yahan1, REN Xiujuan1, BAO Yanqing1, WEI Ruiyuan1, ZHAO Yiping1, HAN Haige1, Wuyundalai1, HUANG Jinlong1, Dugarjaviin Manglai1,*
(1. Inner Mongolia Mongolian Horse Genetic Resources Protection and Industrial Engineering Laboratory, College of Animal Science, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China; 2. Department of Basic Medical, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110, China)

Samples of koumiss during the fermentation period were taken for the extraction of metagenomic DNA. PCR amplifi cation of the 16S rRNA gene sequence was conducted followed by 454 pyrosequencing to analyze the succession of bacterial community structure. The main fi ndings were as follows: 1) The highest diversity of bacteria occurred at the early stage of fermentation, while bacterial abundance showed the maximum value at 72 h. 2) Firmicutes and Proteobacteria were the dominant phyla in koumiss fermentation. Lactobacillus and Lactococcus were the dominant bacterial genera. 3) With the extension of fermentation time, there were rising or falling trends in bacterial counts at phylum and genus levels. This study has provided a new understanding of dynamic changes in bacterial community structure during koumiss fermentation, which may offer some

for exploring bacterial community structure in other fermented dairy products.

koumiss; traditional fermentation; bacterial community structure; 16S rRNA

10.7506/spkx1002-6630-201611019

TS252.56

A

2015-11-24

國家科學(xué)技術(shù)部對俄科技合作專項（2011DFR30860）；內(nèi)蒙古自治區(qū)科技廳重點實驗室建設(shè)項目（20130902）；內(nèi)蒙古自治區(qū)科技廳應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)項目（20140172）；呼和浩特市科技計劃項目（2014-農(nóng)-16）

布仁其其格（1982—），女，講師，博士研究生，研究方向為分子數(shù)量遺傳學(xué)。E-mail：qiqigejin@163.com

*通信作者：芒來（1962—），男，教授，博士，研究方向為分子數(shù)量遺傳學(xué)與馬的育種。E-mail：dmanglai@163.com