孫越宜，唐科夢，楊明英，朱良均

（浙江大學(xué)應(yīng)用生物資源研究所，浙江 杭州 310058）

絲素蛋白吸附金屬離子的性能及其機(jī)理的研究

孫越宜，唐科夢，楊明英，朱良均＊

（浙江大學(xué)應(yīng)用生物資源研究所，浙江 杭州 310058）

絲素蛋白是蠶絲的主要組成部分，具有較好的吸濕性、透氣性、吸附性等。而現(xiàn)今人類生活環(huán)境中存在較多的有害金屬離子，因此拓展絲素蛋白吸附金屬離子的用途具有重要的意義。本文在前期研究已證實(shí)絲素蛋白具有較好的吸附重金屬離子能力的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步測定分析了不同狀態(tài)下的絲素蛋白（溶液狀、凝膠狀、粉末狀）對金屬離子（以鋅為例）的吸附作用，探討了絲素蛋白二級結(jié)構(gòu)的變化，闡明了絲素蛋白吸附金屬離子的機(jī)理。結(jié)果顯示：絲素蛋白吸附鋅離子時(shí)，氫元素與氧元素參與了其反應(yīng)，而氮元素也可能參與了反應(yīng)，絲素蛋白肽鏈上的-OH、-CO-NH-以及-NH2與Zn2+通過配位鍵形成了配合物；且絲素蛋白β-折疊增加而無規(guī)卷曲減少，絲素蛋白與Zn2+形成的配合物具有更穩(wěn)定配位結(jié)構(gòu)；同時(shí)pH對該配位反應(yīng)過程也存在一定的影響。

絲素蛋白；金屬離子；吸附機(jī)理；二級結(jié)構(gòu)

1　引言

絲素蛋白（SF）是蠶絲的主要組成部分，具有較好的可加工性能、生物分解性能和生物相容性，是一種優(yōu)良的生物材料。隨著絲素蛋白研究領(lǐng)域的不斷拓寬，絲素蛋白的功能特性被不斷地發(fā)現(xiàn)和利用，如絲素蛋白的吸濕性、透氣性、吸附性等［1，2］。而目前，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的極大發(fā)展、工業(yè)化生產(chǎn)的普及等，在自然界和人類生活環(huán)境中，存在較多的有害金屬離子，危及人類和動(dòng)植物的健康［3］。研究表明，不同形態(tài)的絲素蛋白（SF，溶液狀、凝膠狀、粉末狀）對重金屬離子（銅、鋅、鉛）存在不同能力的吸附作用，且其吸附比率隨著絲素蛋白濃度的增加而增大，對單一金屬離子和混合離子具有同樣效果［4］。

如能利用絲素蛋白的吸附性能，研制具有吸附金屬離子功能的新型環(huán)保材料，不僅拓展絲素蛋白用途，提升蠶絲蛋白資源利用價(jià)值，而且對于改善生態(tài)環(huán)境等具有重要意義。因此，本研究從絲素蛋白的吸附性能入手，研究絲素蛋白對金屬離子（以鋅為例）的吸附性能，明確絲素蛋白吸附金屬離子的機(jī)理。為進(jìn)一步研制用于水或空氣的凈化等的絲素蛋白生物吸附材料建立理論基礎(chǔ)。

2　材料與方法

2.1材料與設(shè)備

2.1.1材料

家蠶蠶繭繭層，無水碳酸鈉（AR），99.9%溴化鋰（AR），氯化鋅（AR），濃鹽酸（AR）。

2.1.2設(shè)備

電子分析天平（1702型，Sartorius GMBH Gottingen公司）、電磁爐（CH8660型，CAPLE公司）、恒溫磁力攪拌器（78HW-3型，儀表電機(jī)公司）、空氣恒溫振蕩器（SPH-2102C型，世平公司）、超聲波細(xì)胞破碎儀（JY92-ⅡDN型，Scientz公司）、MD44透析帶（8 ku-14 ku）、四環(huán)真空冷凍干燥機(jī)（LGJ-10C型，博醫(yī)康公司）、數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱（GZX-9140MBE型，博迅公司）、傅立葉紅外光譜儀（8400s型，Shimadzu公司）、圓二色譜儀（J-815型，Jasco公司）、X射線光電子衍射儀（250Xi型，Escalab公司）。

2.2方法

2.2.1脫膠絲素纖維的制備

取蠶繭繭層剪碎備用，每20 g蠶繭繭層配備兩份10 g無水碳酸鈉粉末。將兩份碳酸鈉粉末分別溶于2000 mL去離子水，取其中一份溶液煮沸后，加入20 g繭層，繼續(xù)沸煮30 min，其間常用玻璃棒攪拌進(jìn)行第1次脫膠，脫膠完成后傾去溶液，取出蠶絲用蒸餾水反復(fù)洗滌并擰干，獲得一次脫膠絲。再取另一份碳酸鈉溶液煮沸，以相同方法進(jìn)行第2次脫膠，獲得完全脫膠絲，即純絲素纖維。將純絲素纖維放入120℃烘箱中烘干備用。

2.2.2絲素蛋白溶液的制備

稱取86.84 g溴化鋰粉末，在磁力攪拌器不斷攪拌的情況下緩慢溶解于約30 mL去離子水中。待溶液溫度達(dá)到室溫時(shí)，利用去離子水定容至100 mL，得100 mL 9 mol/L溴化鋰溶液。

取純絲素纖維，按0.1 g/ml的比例浸沒于上述溴化鋰溶液中，室溫下置于搖床上振蕩6 h，使絲素纖維溶解。然后用去離子水透析、濃縮后獲得絲素蛋白溶液（RSF（aq））。取1 mL絲素蛋白溶液至小平皿內(nèi)120℃烘箱中烘干、稱重，計(jì)算絲素蛋白溶液濃度。

2.2.3絲素蛋白凝膠及粉末材料的制備

將2.2.2中制備得到的絲素蛋白溶液用25 kHz超聲波處理（工作時(shí)間7 s，間隙時(shí)間3 s，超聲約2 min）后凝膠化。然后將凝膠狀絲素蛋白倒入平皿中于-4℃冰箱冷凍，再放入真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)干燥，研磨后獲得絲素蛋白凝膠材料（RSF材料（g））。

另取2.2.2中絲素蛋白溶液分裝倒入平皿中于-4℃冰箱冷凍，再放入真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)干燥，在紅外燈下研磨后獲得絲素蛋白粉末材料（RSF（s））。

2.3金屬離子的吸附

2.3.1絲素蛋白溶液材料對鋅離子的吸附

取36 mL11%的絲素蛋白溶液裝入透析袋中，置于含13.63 g氯化鋅的466 mL水溶液中，得氯化鋅-絲素蛋白（aq）混合溶液。若混合溶液出現(xiàn)絮狀沉淀即氫氧化鋅，則逐滴添加鹽酸直至絮狀沉淀消失，此時(shí)的pH約為6。將上述混合溶液放于磁力攪拌器上室溫條件下攪拌48 h，取透析袋中溶液進(jìn)行圓二色譜（CD）分析，另取透析袋中溶液即Zn2+-RSF（aq）混合溶液，制成Zn2+-RSF（aq）混合膜進(jìn)行X射線光電子能譜學(xué)（XPS）分析（測定O、N、C、Zn）。

以相同方法另制取兩份氯化鋅-絲素蛋白（aq）混合溶液，并分別用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至4～5及2～3，以相同方法處理、分析樣品。

另取絲素蛋白溶液進(jìn)行圓二色譜分析，并制成絲素蛋白膜進(jìn)行X射線光電子能譜學(xué)分析（測定O、N、C、Zn）；同樣取絲素蛋白溶液調(diào)節(jié)pH至2～3后進(jìn)行圓二色譜分析。

2.3.2絲素蛋白凝膠材料對鋅離子的吸附

取0.39 g絲素蛋白凝膠材料置于500 mL 0.2 mol/ L氯化鋅溶液中得氯化鋅-絲素蛋白（g）混合溶液。若混合溶液出現(xiàn)絮狀沉淀即氫氧化鋅，則逐滴添加鹽酸直至絮狀沉淀消失，此時(shí)的pH約為6。將上述混合溶液放于磁力攪拌器上室溫條件下攪拌48 h后，將溶液抽濾，收集濾渣，冷凍干燥并研磨成粉，得Zn2+-RSF（g）樣品。壓片后進(jìn)行傅立葉紅外（FT-IR）分析（透射）及X射線光電子能譜學(xué)分析（測定O、N、C、Zn）。

以相同方法另制取兩份氯化鋅-絲素蛋白（g）混合溶液，并分別用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至4～5及2～3，以相同方法處理、分析樣品。

另取絲素蛋白凝膠材料壓片后進(jìn)行傅立葉紅外分析（透射）及X射線光電子能譜學(xué)分析（測定O、N、C、Zn）。

2.3.3絲素蛋白粉末材料對鋅離子的吸附

配制500 mL 0.2 mol/L氯化鋅溶液，并取適量溶液溶解0.39 g絲素蛋白粉末材料，將溶解的絲素蛋白裝入透析袋中后置于該氯化鋅溶液中，得氯化鋅-絲素蛋白（s）混合溶液。若混合溶液出現(xiàn)絮狀沉淀即氫氧化鋅，則逐滴添加鹽酸直至絮狀沉淀消失，此時(shí)的pH約為6。將上述混合溶液放于磁力攪拌器上室溫條件下攪拌48 h，取透析袋內(nèi)含物冷凍干燥并研磨成粉，得Zn2+-RSF（s）樣品。壓片后進(jìn)行傅立葉紅外分析（透射）及X射線光電子能譜學(xué)分析（測定O、N、C、Zn）。

以相同方法另制取兩份氯化鋅-絲素蛋白（s）混合溶液，并分別用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至4～5及2～3，以相同方法處理、分析樣品。

另取絲素蛋白粉末材料壓片后進(jìn)行傅立葉紅外分析（透射）及X射線光電子能譜學(xué)分析（測定O、N、C、Zn）。

3　結(jié)果與分析

3.1圓二色譜測定分析［5～7］

根據(jù)絲素蛋白圓二色圖譜分析［8］，各液態(tài)實(shí)驗(yàn)樣品中各類二級結(jié)構(gòu)的比例如表1所示。由表1可知，絲素蛋白溶液與鋅離子反應(yīng)后，β折疊增多，β轉(zhuǎn)角消失，而無規(guī)卷曲減少；同樣，酸性條件也有助于其他二級結(jié)構(gòu)向β折疊轉(zhuǎn)變；其中，2.2.2中制備的絲素蛋白溶液為弱堿性，因此其二級結(jié)構(gòu)與其他實(shí)驗(yàn)組存在較大差異。但有文獻(xiàn)指出［5］，pH為2時(shí)，絲素蛋白分子鏈可能被破壞，此時(shí)圓二色譜的分析結(jié)果并不能準(zhǔn)確表示其二級結(jié)構(gòu)，這一點(diǎn)還有待考證。

表1　各液態(tài)樣品CD圖譜分析結(jié)果（各類二級結(jié)構(gòu)比例）Table 1　CD map analysis results of each liquid sample（proportion of various secondary structure）

3.2傅立葉紅外測定分析

各固態(tài)樣品傅立葉紅外光譜透射圖譜的特征峰值如表2、表3所示，其中酰胺Ⅰ帶的1700 cm-1、1625～1640 cm-1，酰胺Ⅱ帶的1515～1525 cm-1，酰胺Ⅲ帶的1265 cm-1、1235 cm-1，和酰胺Ⅴ帶的700 cm-1代表β-折疊；而酰胺Ⅰ帶的1650～1660 cm-1，酰胺Ⅱ帶的1535～1545 cm-1，酰胺Ⅲ帶的1235 cm-1，和酰胺Ⅴ帶的669 cm-1代表無規(guī)則卷曲［9，10］。因此，通過觀察、分析各樣品圖譜中酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶的峰值，可以直觀地比較絲素蛋白材料分別在凝膠狀態(tài)下與粉末狀態(tài)下，以及在添加Zn2+后在不同pH條件下二級結(jié)構(gòu)的差異。

此外，通過比較各樣品紅外譜圖中指紋區(qū)（1400～600 cm-1）與官能團(tuán)區(qū)（3700～1500 cm-1）各鍵與各官能團(tuán)的特征峰，也可以分析推斷參與絲素蛋白與鋅離子反應(yīng)的基團(tuán)［11］。

表2為凝膠狀絲素蛋白材料及其與鋅離子在不同pH條件下反應(yīng)的傅立葉紅外光譜（透射）分析結(jié)果。由此可見，與純凝膠狀絲素蛋白相比，加入鋅離子后，酰胺Ⅱ帶中代表無規(guī)卷曲的特征峰消失，說明蛋白二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)卷曲比例減小，這一點(diǎn)與絲素蛋白溶液相符。其次，pH=2～3時(shí)酰胺Ⅲ帶的特征峰消失，這可能與pH為2時(shí)，絲素蛋白分子鏈可能被破壞有關(guān)［5］。

表2　凝膠狀絲素蛋白材料組FT-IR光譜特征峰Table 2　FT-IR spectral characteristic peak of gel silk fibroin material group

凝膠狀絲素蛋白材料在與氯化鋅溶液混合后，表示醇羥基面內(nèi)彎曲振動(dòng)（δOH）的1410～1260 cm-1波段內(nèi)，多個(gè)特征峰偏移或者消失，說明醇羥基參與絲素蛋白與鋅離子的反應(yīng)；表示胺基面內(nèi)彎曲振動(dòng)（δNH）的1650～1590 cm-1波段內(nèi)，特征峰由1626.05 cm-1偏移至1624.12 cm-1，說明氨基參與反應(yīng)；表示酰胺氨氮?dú)滏I伸縮振動(dòng)（νNH）的3500～3100 cm-1波段內(nèi)，特征峰由3290.67 cm-1分別偏移至3288.74 cm-1、3288.74 cm-1、3286.81 cm-1，說明酰胺基參與反應(yīng)［11］。

表3為粉末狀絲素蛋白材料實(shí)驗(yàn)組的傅立葉紅外光譜（透射）分析結(jié)果。

表3　粉末狀絲素蛋白材料組FT-IR光譜特征峰Table 3　FT-IR spectral characteristic peak of powder silk fibroin material group

由于pH為6時(shí)，粉末狀絲素蛋白材料與氯化鋅溶液反應(yīng)后形成一種金黃色半透明狀晶體，且質(zhì)地堅(jiān)硬而極易吸濕，故該實(shí)驗(yàn)組樣品未能制成傅立葉紅外光譜分析（透射）用壓片，因此該實(shí)驗(yàn)組傅立葉紅外光譜分析（透射）結(jié)果缺失。

根據(jù)其他三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的傅立葉紅外光譜分析（透射）結(jié)果，鋅離子的加入使得粉末狀絲素蛋白材料酰胺Ⅱ帶處無規(guī)則卷曲的特征峰消失，而出現(xiàn)β-折疊的特征峰；與凝膠狀絲素蛋白材料相似，在pH為2～3時(shí)，包括酰胺Ⅴ帶在內(nèi)的多處特征峰消失，這說明在該pH條件下絲素蛋白結(jié)構(gòu)被破壞。

粉末狀絲素蛋白材料在與氯化鋅溶液混合后，表示醇羥基面內(nèi)彎曲振動(dòng)（δOH）的1410～1260 cm-1波段內(nèi)，1386.86 cm-1處的波峰分別偏移至1384.94 cm-1和1383.01 cm-1，說明醇羥基參與絲素蛋白與鋅離子的反應(yīng)；表示胺基面內(nèi)彎曲振動(dòng)（δNH）的1650～1590 cm-1波段內(nèi)，1637.62 cm-1處的波峰偏移至1635.69 cm-1，而1618.33 cm-1處的波峰消失，而1647.26 cm-1處出現(xiàn)新的波峰，說明氨基參與反應(yīng)；表示酰胺氨氮?dú)滏I伸縮振動(dòng)（νNH）的3500～3100 cm-1波段內(nèi)，多個(gè)波峰出現(xiàn)明顯遷移，說明酰胺基參與反應(yīng)［11］。

在粉末狀絲素蛋白材料實(shí)驗(yàn)組中，相比于凝膠狀絲素蛋白材料實(shí)驗(yàn)組，特征峰遷移更明顯，且受pH影響更大，這可能與凝膠狀絲素蛋白材料不溶于水而粉末狀絲素蛋白材料可溶于水有關(guān)，因此粉末狀絲素蛋白材料結(jié)構(gòu)及分子更易被改變。

3.3X射線光電子能譜測定分析［12-14］

3.3.1絲素蛋白溶液與鋅的XPS測定分析

絲素蛋白溶液及其與鋅離子在不同pH下反應(yīng)的X射線光電子能譜分析結(jié)果如表4所示。

表4　RSF（aq）與Zn2+在不同pH條件下反應(yīng)各原子的結(jié)合能（單位：eV）Table 4　Binding energy of each atom in the reaction between RSF（aq）and Zn2+with different pH

絲素蛋白與鋅離子反應(yīng)后，氧元素結(jié)合能明顯增加，其電子層密度增加，說明氧元素參與了絲素蛋白溶液與鋅離子的反應(yīng)；而氮元素的結(jié)合能基本不變，但有文獻(xiàn)［15］提到，N→Zn2+配鍵中有較大成分的d電子反饋，導(dǎo)致氮元素結(jié)合能變化不大，因此氮元素也可能參與反應(yīng)；碳元素的結(jié)合能雖然保持不變但各結(jié)合能比例明顯改變，即各峰面積比明顯變化，主要是醇比例的增減，同樣說明了氧元素參與了絲素蛋白溶液與鋅離子的反應(yīng)。

此外，當(dāng)pH低于5時(shí)，鋅元素的結(jié)合能明顯減少，電子云密度降低，說明鋅元素與絲素蛋白溶液發(fā)生配合，也因此推測氫離子參與絲素蛋白與鋅離子的反應(yīng)。

由此可以推測，在絲素蛋白溶液中，絲素蛋白主要通過氫元素、氧元素與鋅離子反應(yīng)，氮元素可能參與反應(yīng)。

3.3.2凝膠狀絲素蛋白與鋅的XPS測定分析

凝膠狀絲素蛋白及其與鋅離子在不同pH下反應(yīng)的X射線光電子能譜分析結(jié)果如表5所示。

根據(jù)表5的分析結(jié)果，基本與3.2.1中絲素蛋白溶液實(shí)驗(yàn)組一致，但氧元素的結(jié)合能有所降低；此外，凝膠狀絲素蛋白材料實(shí)驗(yàn)組中鋅元素結(jié)合能在不同pH下也未發(fā)生變化，這可能與凝膠狀絲素蛋白材料不溶于水，結(jié)構(gòu)受溶液pH影響較小有關(guān)，這一推測也與傅立葉紅外光譜測定結(jié)果一致。

因此，凝膠狀絲素蛋白材料與鋅離子在水溶液中發(fā)生反應(yīng)時(shí)，主要有氫元素、氧元素的參與，氮元素可能參與反應(yīng)，這一結(jié)論驗(yàn)證了傅立葉紅外光譜的分析結(jié)果。

表5　RSF（g）材料與Zn2+在不同pH條件下的原子結(jié)合能（單位：eV）Table 5　Binding energy of each atom in the reaction between RSF（g）and Zn2+with different pH

3.3.3粉末狀絲素蛋白與鋅的XPS測定結(jié)果

粉末狀絲素蛋白與鋅離子在不同pH下反應(yīng)的X射線光電子能譜分析結(jié)果如表6所示。

表6　粉末狀絲素蛋白材料與Zn2+在不同pH條件下的原子結(jié)合能（單位：eV）Table 6　Binding energy of each atom in the reaction between powder silk fibroin material and Zn2+with different pH

粉末狀絲素蛋白實(shí)驗(yàn)組的X射線光電子能譜分析結(jié)果中，鋅元素情況與3.2.2中凝膠狀絲素蛋白材料相似，其余元素與3.2.1中絲素溶液實(shí)驗(yàn)組相似。

因此，可以合理地推測粉末狀絲素蛋白與鋅離子反應(yīng)時(shí)，同樣有氫元素、氧元素的參與，氮元素可能參與反應(yīng)。

3.4絲素蛋白與鋅離子的配位反應(yīng)

根據(jù)前述傅立葉紅外光譜和X射線光電子能譜的共同分析結(jié)果可知，絲素蛋白與鋅離子反應(yīng)時(shí)，絲素蛋白肽鏈上的-OH、-CO-NH-及-NH2與Zn2+通過配位結(jié)合形成了配合物，推測其配位方式如圖1所示。

圖1　SF與Zn2+可能的配合方式Figure 1　Possible coordination type between SF and Zn2+

4　結(jié)論

4.1絲素蛋白與鋅離子反應(yīng)的二級結(jié)構(gòu)變化

根據(jù)3.1中絲素蛋白溶液、凝膠狀絲素蛋白及粉末狀絲素蛋白與鋅離子反應(yīng)二級結(jié)構(gòu)的變化可知，絲素蛋白與鋅離子反應(yīng)后β-折疊增加，無規(guī)則卷曲減少，且酸性條件有助于β-折疊結(jié)構(gòu)的形成。說明絲素蛋白與Zn2+結(jié)合形成的配合物具有更穩(wěn)定配位結(jié)構(gòu)。

同時(shí)pH對配合反應(yīng)過程也存在一定的影響，且受影響程度的順序?yàn)椋航z素蛋白溶液材料＞粉末狀絲素蛋白材料＞凝膠狀絲素蛋白材料。絲素蛋白與鋅離子反應(yīng)時(shí)，其二級結(jié)構(gòu)隨pH梯度變化的改變還需要一系列嚴(yán)格控制pH梯度的實(shí)驗(yàn)來探究。

4.2絲素蛋白與鋅離子的配位反應(yīng)

根據(jù)傅立葉紅外光譜和X射線光電子能譜的共同分析結(jié)果可知，絲素蛋白與鋅離子反應(yīng)時(shí)，絲素蛋白肽鏈上的-OH、-CO-NH-及-NH2與Zn2+通過配位結(jié)合形成了配合物。

同時(shí)pH對配合反應(yīng)過程也存在一定的影響，且受影響程度的順序?yàn)椋航z素蛋白溶液材料＞粉末狀絲素蛋白材料＞凝膠狀絲素蛋白材料。

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Study of the Adsorption and the Mechanism of Metal Ions by Fibroin

SUN Yue-yi，TANG Ke-meng，YANG Ming-ying，ZHU Liang-jun＊
（Institute of Applied Bioresources，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China）

Silk fibroin is the main component of the silk，with excellent properties like moisture absorption，air permeability and adsorption.Harmful metal ions in environment have an adverse influence on human life.Thus，it is of great importance that expanding the applications of silk fibroin into environment protection by taking advantage of its excellent properties.As my previous work indicated，silk fibroin has abilities to adsorb heavy metal ions such as copper，zinc，and lead.This study explored the adsorption mechanism of zinc ions onto RSF in different states（aqueous solution，gel，powder），and analyzed the conformational changes of RSF.It turned out：oxygen and hydrogen in RSF reacted with zinc ions，while nitrogen might be involved in the reaction，which means the-OH，-CO-NH-and-NH2of RSF coordinate with Zn2+；the content of β-sheet in RSF was increased while the random coil decreased during the reaction，which makes the RSF become more stable；pH was related to the reaction as well.

silk fibroin；metal ions；adsorption mechanism；secondary structure

S888.3

A

0258-4069［2016］01-026-06

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)（CARS-22）

孫越宜（1993-），女，浙江杭州人，本科生，從事蠶絲蛋白生物資源高分子材料研究。E-mail：303489670@qq.com

朱良均，男，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail：ljzhu@zju.edu.cn