吳安玥，邱麗華

·論著·

Fn14活化凋亡增強人上皮性卵巢癌細胞順鉑敏感度的研究

吳安玥，邱麗華

目的：探討成纖維細胞生長誘導(dǎo)因子14（Fn14）對人上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）細胞的順鉑（DDP）敏感度的影響及其可能機制。方法：蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）法檢測EOC細胞株SKOV3、CAOV3、OVCAR3、ES2、3AO、A2780、A2780/DDP中Fn14蛋白的表達情況，選擇低表達Fn14蛋白的細胞株轉(zhuǎn)染Fn14過表達質(zhì)粒后，觀察轉(zhuǎn)染后細胞株的Fn14蛋白、凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、cleaved caspase-3和Bcl-2的表達情況。CCK-8法檢測細胞增殖能力及DDP半數(shù)抑制濃度（IC50）。流式細胞學(xué)檢測細胞凋亡。結(jié)果：人EOC細胞株SKOV3、CAOV3、OVCAR3、ES2、3AO、A2780、A2780/DDP中，A2780/DDP細胞株Fn14蛋白表達水平最低。Fn14過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A2780/DDP細胞后，細胞內(nèi)Fn14表達水平上調(diào)（P＜0.05）；細胞的增殖能力無變化，但細胞DDP的IC50顯著降低（P＜0.05）。流式細胞學(xué)檢測結(jié)果進一步顯示Fn14可以增加DDP誘導(dǎo)的A2780/DDP凋亡細胞數(shù)目。同時，Western blotting結(jié)果顯示促凋亡蛋白caspase-3表達升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達明顯下降（P＜0.05）。結(jié)論：Fn14可能活化凋亡通路進而提高A2780/DDP細胞對DDP的敏感度。

卵巢腫瘤；成纖維細胞生長誘導(dǎo)因子14；順鉑；抗藥性，腫瘤；細胞凋亡

（J Int Obstet Gynecol，2016，43:335-339）

上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）死亡率占婦科惡性腫瘤的首位［1］，雖然腫瘤細胞減滅術(shù)聯(lián)合鉑類為主的化療對80%的患者有明顯臨床療效，但是大部分患者在初始治療18～24個月左右復(fù)發(fā)，僅有10%～15%能獲得長期緩解［2］。目前認為EOC患者因化療耐藥而引起腫瘤復(fù)發(fā)，是導(dǎo)致其5年生存率低下的主要原因之一［3-4］。故研究卵巢癌耐藥機制，從而找到靶點來減少或者逆轉(zhuǎn)卵巢癌鉑類耐藥，是改善卵巢癌預(yù)后的關(guān)鍵因素。成纖維細胞生長誘導(dǎo)因子14（Fn14）是Ⅰ型跨膜蛋白，是腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族中的最小成員，其配體是腫瘤壞死因子樣凋亡微弱誘導(dǎo)劑（TWEAK）。Fn14在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、化療耐藥中發(fā)揮重要作用［5-6］。目前研究顯示，F(xiàn)n14通過激活核因子κB（NF-κB）通路介導(dǎo)胃癌、小細胞肺癌的化療耐藥［7-8］，但其在EOC鉑類耐藥中的作用不明。本實驗擬研究Fn14在EOC順鉑（DDP）耐藥中的作用及其相關(guān)機制，為進一步尋找遏制EOC細胞化療耐藥提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 主要儀器及試劑改良型RPMI 1640細胞培養(yǎng)液（Hyclone公司）；FBS（Hyclone公司）；雙抗（青霉素、鏈霉素，Hyclone公司）；兔抗人Fn14抗體、兔抗人caspase-3抗體、兔抗人Bcl-2抗體（Cell Signaling Technology公司）；CCK-8試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所）；pcDNA3.1-Fn14質(zhì)粒（廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中心惠贈）；DH5α感受態(tài)菌（大連寶生物公司）；DDP（山東齊魯制藥有限公司）；無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取盒（北京天根科技有限公司）；細胞凋亡試劑盒（BD公司）；細胞培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板（Corning公司）；遠紅外熒光掃描儀（LICOR公司）；異丙醇、無水乙醇、氯化鈉等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗方法

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用Graphpad Prism 5軟件處理數(shù)據(jù)，定量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用配對t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人EOC細胞株中Fn14蛋白表達水平的比較

Western blotting結(jié)果顯示在人EOC的SKOV3、CAOV3、OVCAR3、ES2、3AO、A2780、A2780/DDP細胞株中，A2780/DDP細胞株內(nèi)Fn14蛋白表達水平最低，故采用低表達Fn14蛋白的A2780/DDP細胞株為研究對象進行后續(xù)實驗。見圖1。

圖1 各EOC細胞株中Fn14蛋白表達水平

2.2轉(zhuǎn)染Fn14過表達質(zhì)粒對A2780/DDP細胞株中Fn14蛋白表達水平的影響Western blotting結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Fn14過表達質(zhì)粒后的A2780/DDP細胞中Fn14表達水平較vector組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=7.147，P=0.002）。見圖2。

圖2 Fn14過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A2780/DDP細胞后，F(xiàn)n14蛋白表達水平的變化

2.3 轉(zhuǎn)染Fn14過表達質(zhì)粒對A2780/DDP細胞DDP敏感度（IC50）的影響CCK-8法檢測結(jié)果顯示Fn14過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，A2780/DDP細胞IC50由（46.450±0.922）μg/mL降至（24.368±0.352）μg/mL，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.875，P=0.019），見圖3A。這提示Fn14增加了細胞對DDP的敏感度。未加入DDP時，與vector組相比，F(xiàn)n14過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞OD450 nm值的變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；加入DDP（終濃度10 μg/mL）處理后，DDP對Fn14過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞增殖抑制作用更明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3B。這提示Fn14不影響細胞增殖，故Fn14促進DDP對A2780/DDP細胞增殖能力的抑制，非細胞增殖能力減弱所致。

2.4 Fn14對A2780/DDP細胞凋亡的影響流式細胞學(xué)檢測顯示，未加入DDP時，vector組和Fn14過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組總凋亡率均＜1%。當(dāng)加入DDP（終濃度為25 μg/mL）處理24 h后，vector組和Fn14過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的總凋亡率分別為（12.1±1.5）%和（27.3±2.5）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=8.864，P=0.001）。提示Fn14促進DDP所誘導(dǎo)的A2780/DDP細胞凋亡。見圖4。

2.5 轉(zhuǎn)染Fn14過表達質(zhì)粒對A2780/DDP細胞凋亡相關(guān)蛋白表達水平的影響Western blotting結(jié)果顯示，未加入DDP時，與vector組細胞相比，F(xiàn)n14過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞中的caspase-3蛋白前體、caspase-3蛋白活化體、Bcl-2無明顯變化。當(dāng)DDP處理（終濃度為25 μg/mL）24 h后，轉(zhuǎn)染Fn14過表達質(zhì)粒的A2780/DDP細胞中的caspase-3蛋白活化體表達上調(diào)（t=3.411，P=0.027），Bcl-2蛋白表達下調(diào)（t=6.645，P=0.003），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖5。

圖3 Fn14過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A2780/DDP細胞后，細胞增殖能力及DDP敏感度的變化

3 討論

圖4 A2780/DDP細胞株過表達Fn14后細胞凋亡的變化

Fn14是由129個氨基酸構(gòu)成的Ⅰ型跨膜蛋白，胞漿區(qū)中包含有腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子（TRAF）的結(jié)合序列，當(dāng)配體與Fn14結(jié)合后，通過TRAF活化激活核因子κB（NF-κB）、胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激酶（ERK）、P38絲裂原活化蛋白激酶（p38MARK）和c-Jun氨基末端激酶（JNK）信號通路，調(diào)控腫瘤細胞凋亡、腫瘤細胞的遷徙和侵襲能力、促進腫瘤血管生成、參與炎癥反應(yīng)等一系列生物學(xué)行為［9］。研究顯示，F(xiàn)n14在不同的腫瘤中發(fā)揮的生物學(xué)效應(yīng)不盡相同，其可通過激活ERK信號通路促進非小細胞肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移［10］；可促進HER2和heregulin β1依賴的乳腺癌細胞的遷徙和侵襲［11］；而在子宮內(nèi)膜癌中，F(xiàn)n14則通過活化caspase通路促進腫瘤細胞凋亡［12］；Fn14·TRAIL融合蛋白可以誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡，抑制腫瘤生長［13］。Fn14在腫瘤耐藥中也發(fā)揮重要作用，Kwon等［7］發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)n14通過激活NF-κB通路介導(dǎo)胃癌對5-氟尿嘧啶耐藥的發(fā)生；Li等［8］同樣發(fā)現(xiàn)Fn14通過激活NF-κB通路導(dǎo)致小細胞肺癌對化療藥物的耐藥。本研究發(fā)現(xiàn)在人EOC細胞株SKOV3、CAOV3、OVCAR3、ES2、3AO、A2780、A2780/DDP中A2780/DDP細胞Fn14蛋白表達水平最低，繼而在A2780/DDP細胞中轉(zhuǎn)染Fn14過表達質(zhì)粒后發(fā)現(xiàn)細胞IC50明顯降低，增加細胞DDP敏感度，這與在胃癌、非小細胞肺癌中Fn14促進腫瘤耐藥不同。因Fn14不影響細胞增殖能力，所以Fn14增強DDP對 EOC細胞株增殖的抑制作用不是細胞增殖能力減弱所致，進一步證明Fn14可以提高A2780/DDP細胞的DDP敏感度，在卵巢癌細胞鉑類耐藥機制中發(fā)揮重要作用。

圖5 A2780/DDP細胞株過表達Fn14后，細胞凋亡相關(guān)蛋白的變化

細胞凋亡是凋亡蛋白和凋亡抑制蛋白（IAP）共同調(diào)控下發(fā)生的一種主動的細胞自殺行為。DDP等經(jīng)典的抗腫瘤藥物通過促進細胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，然而細胞抗凋亡能力增強如抗凋亡基因過表達或促凋亡基因丟失，可能導(dǎo)致腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥性，故細胞凋亡異常與EOC的DDP化療耐藥密切相關(guān)［14-15］。caspase是凋亡蛋白酶家族，通過選擇性地剪切其底物蛋白完成自我活化和相互激活過程，最終通過下游效應(yīng)分子caspase-3活化觸發(fā)細胞凋亡。當(dāng)caspase功能受到抑制時，機體細胞凋亡障礙，進而誘使EOC的發(fā)生和進一步進展［16］。Bcl-2是凋亡抑制因子，主要通過抑制線粒體釋放細胞色素C來抑制細胞通過線粒體途徑發(fā)生凋亡。研究表明，當(dāng)EOC細胞Bcl-2蛋白表達增多，細胞凋亡減少，DDP耐藥性增加［17］。本研究發(fā)現(xiàn)A2780/DDP細胞轉(zhuǎn)染Fn14過表達質(zhì)粒后，可以促進DDP誘導(dǎo)凋亡細胞數(shù)目增多，同時促進凋亡相關(guān)蛋白caspase-3蛋白的活化和抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，進一步提示Fn14可能通過活化凋亡通路促進A2780/DDP細胞凋亡，進而提高A2780/DDP對DDP的敏感度。

綜上所述，本研究探索了Fn14與EOC細胞耐藥的關(guān)系，首次發(fā)現(xiàn)了Fn14可能通過活化凋亡增強人EOC細胞株對DDP的敏感度，為臨床開創(chuàng)有效逆轉(zhuǎn)EOC鉑類耐藥的治療新途徑提供了理論基礎(chǔ)。

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Fn14 Enhances Cisplatin Sensitivity in Human Epithelial Ovarian Cancer Cells by Regulating Apoptosis

WU An-yue，QIU Li-hua.Department of Obstetrics and Gynecology，Shanghai Key Laboratory of Gynecology Oncology，Renji Hospital，School of Medicine，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200127，China

QIU Li-hua，E-mail:lilyqiulh@126.com

Objective:To investigate the effects of Fn14 on regulating cisplatin（DDP）sensitivity in human ovarian cancer cells.Methods:Fn14 protein expression levels in SKOV3，CAOV3，OVCAR3，ES2，3AO，A2780 and A2780/DDP were detected through Western blotting.The expression of Fn14，caspase-3，cleaved caspase-3 and Bcl-2 were accessed by Western blotting in lowest expression of Fn14 cell line when transfected with Fn14 plasmid.The half cell lethal dose（IC50）of DDP and the ability of proliferation in A2780/DDP cells were assayed by CCK-8 kit.The ratio of apoptosis in A2780/DDP cells were determined by flow cytometry.Results:A2780/DDP cells exhibited the lowest expression of Fn14 in these cell lines.Fn14 transfer had no effect on the proliferation of A2780/DDP cells，whereas it could reduce the IC50 of DDP in A2780/DDP cells（P＜0.05）.When Fn14 was transferred，the apoptosis induced by DDP was increased in A2780/DDP cells，meanwhile，the expression of apoptosiscorrelated protein caspase-3 was up-regulated and anti-apoptotic protein Bcl-2 was down-regulated（P＜0.05）.Conclusions: Fn14 may increase chemosensitivity to DDP by apoptosis pathway in human epithelial ovarian cancer cells.

Ovarian neoplasms；Fn14；Cisplatin；Drug resistance，neoplasm；Apoptosis

2015-12-10）

［本文編輯 王昕］

國家自然科學(xué)基金面上項目（81272884）

200127上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海市婦科腫瘤重點實驗室

邱麗華，E-mail：lilyqiulh@126.com