王　芳　呂　紅　賈娟娣　韓　偉　付劍江.解放軍總醫(yī)院腎臟科，北京0085；.江西中醫(yī)藥大學(xué)網(wǎng)絡(luò)與教育技術(shù)中心，江西南昌0004；.江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江西南昌0004

紫草素下調(diào)Runx2轉(zhuǎn)錄活性對(duì)乳腺癌細(xì)胞體外運(yùn)動(dòng)能力的影響

王芳1呂紅2賈娟娣2韓偉2付劍江3
1.解放軍總醫(yī)院腎臟科，北京100853；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)網(wǎng)絡(luò)與教育技術(shù)中心，江西南昌330004；3.江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江西南昌330004

目的探討紫草素（SKN）對(duì)乳腺癌細(xì)胞體外運(yùn)動(dòng)能力的影響。方法利用OrisTM細(xì)胞遷移試劑盒和重組基底膜侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SKN對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231細(xì)胞體外遷移能力和侵襲能力的影響。采用明膠酶譜法觀察SKN對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的影響。通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SKN對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)Runx2轉(zhuǎn)錄活性及表達(dá)的影響。結(jié)果給藥后，20μmol/L SKN可顯著抑制表皮生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移作用；重組基底膜侵襲實(shí)驗(yàn)中，SKN 10μmol/L和20μmol/L劑量組的侵襲細(xì)胞數(shù)分別為（514.3±76.8）、（426.3±87.0）個(gè)，與空白組［（738.5±126.1）個(gè)］比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；明膠酶譜實(shí)驗(yàn)顯示，SKN可下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）的活性；進(jìn)一步Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MDA-MB-231細(xì)胞的MMP-9表達(dá)也顯著降低（P＜0.01）。Ch IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SKN可明顯下調(diào)Runx2與MMP-9基因啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)特定序列的結(jié)合能力，而Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SKN可顯著抑制磷酸化Runx2的表達(dá)（P＜0.01）。結(jié)論SKN對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞體外運(yùn)動(dòng)功能具有顯著抑制作用，這種作用與其抑制Runx2活化、下調(diào)Runx2轉(zhuǎn)錄活性、抑制MMP-9表達(dá)有關(guān)。

紫草素；體外運(yùn)動(dòng)能力；基質(zhì)金屬蛋白酶-9；Runx2；乳腺癌

紫草為紫草科植物紫草（Lithospermum erythrorhizon Sieb.et Zucc.）、新疆紫草［Arnebia euchroma（Royle）Johnst］、內(nèi)蒙紫草（Arebia guttata Bunge）的干燥根的統(tǒng)稱，具有涼血活血、消炎止痛、解毒透疹等功效，主治血熱毒盛、斑疹紫黑、麻疹不透、瘡瘍、濕疹、水火燙傷等［1］。研究表明，紫草的活性成分主要是以紫草素及其衍生物為代表的萘醌類色素，具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗艾滋病毒、抗生育、解熱、止血、降血糖等廣泛的藥理作用［1-3］。本文對(duì)紫草的主要活性成分之一——紫草素的體外抗乳腺癌轉(zhuǎn)移活性及其機(jī)制進(jìn)行初步探索。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)用藥

紫草素（shikonin，SKN）購(gòu)自Sigma-Aldrich公司（貨號(hào)S7576，批號(hào)120117），BB-94購(gòu)自Santa Cruz生物技術(shù)公司（SantaCruzBiotechnology Inc.，Santa Cruz，CA；貨號(hào)：SC-203833；批號(hào)：1309287），本研究中作為陽(yáng)性對(duì)照藥。

1.2細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng)

人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)。MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37℃5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)，3～4 d傳代1次。

1.3試劑

Matrigel（BDbioscience，#354234）；Fibronectin（FN，Sigma-Aldrich，#F1141）；QIAshredder（Qiagen，#79656）；RNeasy ProtectMini試劑盒（Qiagen，#74124）；OneStep RT-PCR試劑盒（Qiagen，#210210）；Multiplex PCR試劑盒（Qiagen，#206143）；ORIS cell migration assay試劑盒（Platypus Technologies，#CMA1.101）；TransAMTM AML-3/Runx2試劑盒（Activemotif，#44496）；Agarose ChIP試劑盒（Thermo Fisher Scientific，#RA232201）；Phusion?High-Fidelity PCR試劑盒；總蛋白抽提試劑盒（碧云天，#P0027）；抗p-Runx2多克隆抗體（Abgent，#AP3559a）；抗MMP-9單克隆抗體（Santa Cruz，#SC-6840）；抗β-Actin單克隆抗體（Santa Cruz，#SC-130301）。

1.4儀器

AP48 chamber（美國(guó)Neuro probe公司）；Mastercycler gradient PCR儀（德國(guó)Eppendorf公司）；EC3凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)UVP公司）；ELx800酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）；BX63正置顯微鏡（日本Olymbus公司）。

1.5腫瘤細(xì)胞體外遷移實(shí)驗(yàn)

采用OrisTM細(xì)胞遷移檢測(cè)試劑盒（Platypus Technology LLC，Madison，WI）進(jìn)行。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞，配制成濃度為5×106/mL的細(xì)胞懸液。將100μL細(xì)胞懸液接種于插入了Stopper的OrisTM細(xì)胞培養(yǎng)板。37℃、5%CO2孵育5 h。小心拔出Stopper，并更換含藥培養(yǎng)液，每個(gè)處理重復(fù)3個(gè)復(fù)孔。上述細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h。處理結(jié)束后，棄去培養(yǎng)液，加入濃度為0.5%結(jié)晶紫染色60min，PBS洗滌3遍，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.6重組基底膜細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)［4］的方法，采用AP48 chamber細(xì)胞趨化試劑盒進(jìn)行。取孔徑為8.0μm的PVPF濾膜，在其粗糙面均勻涂抹50μg纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N），室溫靜置風(fēng)干。隨后在光滑面均勻涂抹0.5mg/mL Matrigel 100μL，室溫靜置、干燥。按照說(shuō)明書(shū)安裝AP48 Chamber：下室加入30μL含0.1%BSA的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基；上室加入50μL含有不同藥物濃度的細(xì)胞懸液，細(xì)胞終濃度為2×106/m L，每個(gè)處理重復(fù)3個(gè)復(fù)孔。37℃，5%CO2培養(yǎng)14 h。培養(yǎng)結(jié)束后，卸下濾膜，甲醇固定10 min，0.5%結(jié)晶紫染色60 min，隨后用棉簽擦掉濾膜上層細(xì)胞，光學(xué)顯微鏡下拍照，并計(jì)數(shù)5個(gè)不同視野內(nèi)的侵襲細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值，上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.7明膠酶譜實(shí)驗(yàn)

各組細(xì)胞經(jīng)含藥無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，4℃，相對(duì)離心力200×g，離心10min，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，細(xì)胞則計(jì)數(shù)。配制8%分離膠和5%濃縮膠，分離膠中含0.1%（W/V）明膠。按細(xì)胞數(shù)折算出相同細(xì)胞數(shù)所對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)上清體積，并按此加樣電泳。電泳完畢后，剝離凝膠，以蒸餾水漂洗后，移入100 m L 2.5%TritonX-100溶液中，在搖床上低速搖動(dòng)30min，洗脫SDS。隨后將凝膠移入100 mL明膠酶緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，10 mmol/L CaCl2，200 mmol/L NaCl，1μmol/L ZnCl2），37℃溫育16 h。凝膠經(jīng)蒸餾水漂洗后，以0.1%考馬斯亮藍(lán)R-250染色4 h。蒸餾水漂洗后，在脫色液（冰醋酸∶甲醇∶水=10∶45∶45）中脫色至對(duì)照組出現(xiàn)明顯、清晰的負(fù)染條帶。凝膠在EC3凝膠成像系統(tǒng)中掃描照相。

1.8Ch IP實(shí)驗(yàn)

采用Thermo Fisher Scientific的Agarose ChIP試劑盒進(jìn)行。在經(jīng)不同濃度SKN處理的細(xì)胞中加入終濃度1%的甲醛，孵育10min。隨后加入含蛋白酶抑制劑的裂解液裂解細(xì)胞，并加入微球菌核酸酶孵育5 min。隨后加入抗Runx2抗體（終濃度1∶50）沉淀蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物，并以抗兔IgG和抗RNA聚合酶Ⅱ抗體作為陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照?；厥?、純化DNA。隨后采用Phusion?High-Fidelity PCR試劑盒擴(kuò)增純化后的DNA，目的片段為MMP-9（GeneBank號(hào)：NM_004994）啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)的Runx2結(jié)合區(qū)域（-1133 bp：ACTCCAG）。上游引物和下游引物分別為：5＇-TGG AGC AGG GCT GGA GA-3＇和5＇-CCT GCC AAA AGA CCA TGA TTC T-3＇。擴(kuò)增條件為：95°C 15min后進(jìn)入30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增：95℃15 s，56℃30 s，72℃30 s。循環(huán)結(jié)束后，RCP產(chǎn)物置于72℃10 min。實(shí)驗(yàn)中，采用未經(jīng)共沉淀處理的DNA作為input對(duì)照，其余處理與共沉淀組相同。

1.9蛋白提取和W estern blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

收集各處理組細(xì)胞，采用總蛋白提取試劑盒（碧云天，P0027）提取總蛋白，并測(cè)定含量。取等量蛋白在10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳，電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗（1∶500）4℃孵育過(guò)夜，TTBS洗膜，將二抗按1∶1000稀釋后與硝酸纖維素膜室溫孵育1 h。經(jīng)過(guò)2次洗滌后，加入顯色劑顯色、拍照。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差分析，方差齊性采用LSD檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1SKN對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞體外遷移能力的影響極顯著差異，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.3SKN對(duì)MMPs活性的影響

圖3所示為SKN對(duì)MMPs活性的影響。SKN可顯著抑制MMP-9對(duì)明膠的分解，而對(duì)于MMP-2的分解作用則沒(méi)有明顯影響（圖3A）。Western blot結(jié)果

圖2　SKN對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞體外侵襲能力的影響

與空白組比較（圖1A），經(jīng)25 ng/mLEGF孵育24 h后，MDA-MB-231細(xì)胞向中央空白區(qū)域遷移的細(xì)胞數(shù)量顯著增加（圖1B）。而陽(yáng)性對(duì)照藥BB-94和SKN均可顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞的這種遷移能力，并呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系（圖1C～E）。

圖1　SKN對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞體外遷移能力的影響

2.2SKN對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞體外侵襲能力的影響

圖2所示為SKN對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞體外侵襲能力的影響。空白組的侵襲細(xì)胞數(shù)為（738.5±126.1）個(gè)，而各SKN劑量組的侵襲細(xì)胞數(shù)分別為（514.3±76.8）、（426.3±87.0）個(gè)，與空白組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中20μmol/L劑量組的抑制作用呈現(xiàn)顯示，SKN可顯著抑制MMP-9的表達(dá)（P＜0.01，圖3B）。提示SKN可能可以通過(guò)抑制MMP-9的表達(dá)，從而抑制MDA-MB-231細(xì)胞的體外遷移和侵襲。

2.4SKN對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞Runx2活性的影響

Ch IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SKN可顯著抑制Runx2與MMP-9基因啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)的靶序列結(jié)合，并呈現(xiàn)劑量依賴性（圖4A）。Western blot結(jié)果顯示，SKN可顯著抑制磷酸化Runx2的表達(dá)，而對(duì)Runx2總蛋白的表達(dá)則無(wú)顯著影響（圖4B），提示SKN可能可以通過(guò)抑制Runx2的活化，下調(diào)其轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性。

圖3　SKN對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞MMPs的影響

圖4　SKN對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞Runx2活性的影響

3　討論

紫草為傳統(tǒng)中藥，其化學(xué)成分復(fù)雜、藥理作用廣泛，抗腫瘤作用是其中之一。作為紫草的主要活性成分，SKN及其衍生物具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［5］、激活促細(xì)胞分裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）［6］、抑制蛋白酪氨酸激酶和DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ的活性［6-7］。鑒于紫草良好的臨床療效和廣泛的民間使用基礎(chǔ)，本文探討了SKN的體外抗轉(zhuǎn)移作用及其可能的作用機(jī)制，為紫草的深度開(kāi)發(fā)和利用提供資料。

本研究發(fā)現(xiàn)，SKN可顯著抑制人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231的體外遷移和侵襲能力。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SKN可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞MMP-9的表達(dá)，從而抑制其活性。另外，SKN還可顯著降低磷酸化Runx2的表達(dá)，并下調(diào)Runx2與MMP-9基因啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)特定序列的結(jié)合能力。

Runx2又稱核心結(jié)合因子a1（core-binding factor a1，CBFA1），屬于runt結(jié)構(gòu)域基因家族的轉(zhuǎn)錄因子，目前已發(fā)現(xiàn)該家族包括三個(gè)成員，即Runx1、Runx2和Runx3，它們的共同特點(diǎn)是在分子結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)由128個(gè)氨基酸組成的高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域——runt結(jié)構(gòu)域［8］。在成骨細(xì)胞分化和骨形態(tài)的形成過(guò)程中，Runx2扮演了非常重要的作用［9-11］。近年來(lái)，研究顯示作為一種DNA結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，Runx2通過(guò)調(diào)控其靶基因的表達(dá)，在乳腺癌的轉(zhuǎn)移過(guò)程中扮演重要角色，是一個(gè)關(guān)鍵性的轉(zhuǎn)移因子，并成為轉(zhuǎn)移性乳腺癌治療藥物設(shè)計(jì)的潛在靶點(diǎn)［12-13］。在轉(zhuǎn)移能力較強(qiáng)的乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231中，Runx2異?；罨藘?nèi)的表達(dá)及活性明顯高于低轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞系MCF-7［13］。研究人員通過(guò)點(diǎn)突變方法，破壞Runx2基因形成轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物的能力，可以使得表達(dá)該突變蛋白的MDA-MB-231細(xì)胞體外侵襲能力以及體內(nèi)形成溶骨性骨損傷的特性下降。另外將這種帶有突變Runx2基因的細(xì)胞接種至免疫缺陷小鼠的脛骨骨髓，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與其親本細(xì)胞比較，其腫瘤大小明顯降低，同時(shí)骨髓內(nèi)腫瘤引起的溶骨性疾病完全消失［14］。此外，Chimge等［15］的研究還表明，Runx2也參與了乳腺癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的調(diào)控。

MMPs是一組結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的鋅離子依賴蛋白酶。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了23種人MMPs，其中17種為可溶性MMPs［16］。這一蛋白酶家族成員通過(guò)水解細(xì)胞外基質(zhì)、調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、遷移等方式廣泛參與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［16］。研究表明，多種MMPs家族成員均為Runx2的靶點(diǎn)。Jiménez等［17］和Selvamurugan等［18］均證實(shí)在MDA-MB-231細(xì)胞的MMP-13啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)存在2個(gè)Runx2結(jié)合位點(diǎn)。Pratap等［19-20］的研究則提示MMP-9是Runx2下游的另一個(gè)調(diào)控靶點(diǎn)。研究人員發(fā)現(xiàn)，在Runx2突變的小鼠內(nèi)，MMP-9的表達(dá)幾乎完全被抑制；ChIP和EMSA實(shí)驗(yàn)顯示，在MMP-9基因啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)有大量Runx2蛋白募集。進(jìn)一步的knock-in和knock-out實(shí)驗(yàn)也提示了MMP-9的表達(dá)可以調(diào)控MMP-9基因的表達(dá)，從而影響腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移特性。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，SKN可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的體外遷移和侵襲能力，其機(jī)制可能與抑制Runx2的活化，進(jìn)而q降低Runx2的轉(zhuǎn)錄活性、抑制MMP-9表達(dá)有關(guān)。

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Influence of shikonin for the motility in vitro of breast cancer cells via down-regulating transcriptional activity of Runx2

WANG Fang1LU Hong2JIA Juandi2HANWei2FU Jianjiang3

1.Department of Nephrology，Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，China；2.Network and Modern Education Technology Center，JiangxiUniversity of Traditional Chinese Medicine，Jiangxi Province，Nanchang 330004，China；3.School of Pharmacy，Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Jiangxi Province，Nanchang 330004，China

Ob jective To investigate the influence of shikonin（SKN）for the motility in vitro of breast cancer cells. M ethods The influence of SKN for themigration and invasion in vitro of MDA-MB-231 cells was detected by OrisTMmigration assay and reconstituted basementmembrane invasion assay.Gelatin zymography was used to observe the effects of SKN on MDA-MB-231 cells in secreting matrix metalloproteinase（MMPs）.Chromatin immunoprecipitation（Ch IP）assay and Western blot test were used to detect the influence of SKN for transcriptional activity and expression of Runx2 in MDA-MB-231 cells.Results After administration，20μmol/L SKN could significantly inhibit the cellmigration induced by epidermal growth factor；in the reconstituted basementmembrane invasion assay，the number of invaded cells of 10，20μmol/L of SKN was（514.3±76.8），（426.3±87.0）respectively，which had statistically significant differences compared with that of blank group（738.5±126.1）（P＜0.05）；Gelatin zymography showed that SKN could down-regulate the activity ofmatrixmetalloproteinase-9（MMP-9）；furtherWestern blot showed that，the expression of MMP-9 was decreased significantly（P＜0.01）.The Ch IP assay showed that SKN could down-regulate the combining capacity of Runx2 with the specific sequences of HTT gene-linked polymorphic region in MMP-9，while the results of Western blot found that SKN could inhibit the expression of phosphorylation Runx2（P＜0.01）.Conclusion SKN has significant inhibitory effect for the motility in vitro of MDA-MB-231 cells，which may be related to inhibiting excitation of Runx2，down-regulating the transcriptional activity of Runx2，inhibiting the expression of MMP-9.

Shikonin；Motility in vitro；Matrix metalloproteinase-9；Runx2；Breast cancer

R737.9

A

1673-7210（2016）06（c）-0004-05

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81160530、81260656、81560639）。

付劍江（1975.9-），博士，副教授，從事中藥抗腫瘤藥理工作。

（2016-02-26本文編輯：張瑜杰）