吳偉軍 彭 敏 韓耀全 施 軍 雷建軍 王大鵬 何安尤

（廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院，廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點實驗室，廣西 南寧 530021）

紅水河鳙線粒體D-loop和Cyt b基因序列分析

吳偉軍 彭 敏 韓耀全 施 軍 雷建軍 王大鵬 何安尤

（廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院，廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點實驗室，廣西 南寧 530021）

研究了紅水河野生鳙Aristichthys nobilis上游、中游和下游3個群體29個個體的線粒體控制區(qū)（D-loop）和細(xì)胞色素b（Cyt b）基因序列，通過PCR擴(kuò)增與測序，分別獲得了長度為823bp和1090 bp的D-loop和Cyt b基因片段。分析表明，D-loop序列共定義了15個單倍型，存在17個多態(tài)位點，發(fā)生轉(zhuǎn)換4次，插入/缺失13次。Cyt b序列共定義了5個單倍型，存在7個多態(tài)性位點，發(fā)生轉(zhuǎn)換2次，插入/缺失5次。兩序列分析結(jié)果表明，群體間和群體內(nèi)遺傳距離較小，遺傳變異的分子變異等級不顯著。上、中、下游均有共享單倍型，3個群體間遺傳分化不大。

鳙；紅水河；D-loop；Cyt b；遺傳變異

鳙（Aristichthys nobilis）屬鯉形目，鯉科，鰱亞科，鳙屬。也稱花鰱、大頭、胖頭。魚體側(cè)扁，頭極肥大，鱗小，腹面僅腹鰭甚至肛門具皮質(zhì)腹棱。胸鰭長，末端遠(yuǎn)超過腹鰭基部。體側(cè)上半部灰黑色，腹部灰白，兩側(cè)雜有許多淺黃色及黑色的不規(guī)則小斑點。鳙魚棲息在水的中上層，具有河湖洄游習(xí)性，性情溫和，不大跳躍，行動較遲緩。鳙以水中的浮游動物，如輪蟲、枝角類、橈足類和原生動物為主要食物，兼食多種浮游藻類。

線粒體 DNA 控制區(qū)（control region，CR），又稱 D-環(huán)區(qū)（displacement loop region，D-loop），是線粒體 DNA 中的一段非編碼區(qū)，位于 tRNA Pro 和 tRNA Phe 基因之間，分為 3 個區(qū)段：終止序列區(qū)、中央保守區(qū)和保守序列區(qū)。可能由于缺乏編碼的壓力，是線粒體 DNA 序列和長度變異最大的區(qū)域，也是線粒體基因中進(jìn)化最快的部分，適用于種群水平差異的檢測，也可用于種間分析［1-3］。細(xì)胞色素 b基因（Cytochrome b gene，Cyt b）是線粒體 DNA 上的蛋白質(zhì)編碼基因，其進(jìn)化速度適中，適合種群水平差異的檢測，也是探討種內(nèi)群體遺傳分化程度的良好標(biāo)記［4-5］。本文對紅水河流域 3個相互分隔的鰱群體進(jìn)行遺傳多樣性狀況和群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，為紅水河流域物種的多樣性保護(hù)提供必要的遺傳背景資料和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

采集 3個鳙群體共27條，分別為上游巖灘水庫群體（shang）、中游百龍灘水庫群體（zhong）和下游來賓市區(qū)江段群體（xia），三個群體采樣區(qū)域有大壩分隔，大壩無過魚設(shè)施，可認(rèn)為群體間無遺傳交流。每尾個體取0.1g背部肌肉新鮮樣品，于無水乙醇中保存。

1.2 測序方法

通過液氮研磨、裂解液裂解、有機(jī)溶劑抽提，使進(jìn)入水相的蛋白質(zhì)與核酸分層，在 RNA 酶的作用下，降解 RNA，得純度較高的 DNA 樣品并進(jìn)行PCR測序。D-loop 引物序列如下：DL1（5′-ACCCCTGGCTCCCAA AGC-3′），DH2（5′- ATCTTAGCATCTTCAGTG-3′）［6］。Cyt b 引物序列如下：L14724（5′--GACTTGAAAAACCACCGTTG-3′），H15915（5′--CTCCGATCTCCGGATTACAAG AC-3′）［5］。反應(yīng)總體積50μL，其中10×Taq Buffer 5μL，Taq Polymer-ase 0.5μL （5 U·μL-1），dNTPs（2.5 mmol·L-1）4μL，Mg2+（25 mmol·L-1）2.5 μL，引物1和2（10 umol·L-1）各μL，模板DNA 50 ng，無離子超純水35.5μL。擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性2min后，再進(jìn)行35個循環(huán)，每一循環(huán)包括：94℃45s，58℃45 s，72℃1 min；最后72℃延伸7 min。每次PCR反應(yīng)均設(shè)不含模板DNA的空白對照。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)W=1.5%TBE瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色，紫外燈光下檢測、拍照。

1.3 分析方法

通過測序獲得的序列經(jīng) SeqMan II（DNASTAR Inc）軟件拼接并人工校對后，用 CLUSTAL-X 程序?qū)λ@得的序列進(jìn)行比對［7］，采用軟件 DAMBE 統(tǒng)計單倍型并作圖，檢測轉(zhuǎn)換、顛換是否達(dá)飽和。群體的遺傳多樣性指標(biāo)單倍型多樣性（Haplotype diversity，H）和核苷酸多樣性（Nucleotide diversity，π）由 ARLEQUIN 統(tǒng)計軟件計算獲得［8］，群體間的分化指數(shù)（F-statistics， FST）［9］的計算在 ARLEQUIN 中完成，群體間的基因流由公式Nm=［（1/F ST ）-1］/2［10］計算得出，群體遺傳變異的分子方差分析（AMOVA）［11］在ARLEQUIN中完成。采用 MEGA4.1軟件統(tǒng)計 DNA 序列的堿基組成［12］，轉(zhuǎn)換/顛換、插入/缺失位點數(shù)，單突變位點，簡約信息位點；利用Kimura雙參數(shù)模型計算個體間、群體內(nèi)和群體間的遺傳變異率；用 NJ法進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建聚類關(guān)系樹。利用Network4610軟件構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。

2 結(jié)果

2.1 D-loop和Cyt b基因序列信息

由表1可見，在29個823bp的D-loop基因序列中共檢測出15個單倍型。檢測到4個單突變位點，13個簡約信息位點數(shù)；在17個突變位點中：轉(zhuǎn)換位點4個，插入/缺失位點13個?；蚱沃?，A+T的含量（67.1%）明顯高于C+G的含量（32.9%）。29個1090bp的Cyt b基因序列中共檢測出5個單倍型，檢測到1個單突變位點，6個簡約信息位點；在7個突變位點中：轉(zhuǎn)換位點2個，插入/缺失位點5個， A+T的含量（56.4%）高于C+G的含量（43.7%）。對比分析可知：Cyt b單突變位點、多態(tài)位點百分比和簡約信息位點百分比均小于D-loop。

表1 鰱線粒體D-loop及cyt b堿基組成及變異分析

2.2 D-loop和Cyt b基因序列的遺傳變異分析

由表2可見，D-loop序列中，3個鳙群體內(nèi)的遺傳距離分別為0.0051、0.0055和0.0058。上游群體與中游群體間遺傳距離為 0.0054，上游群體與下游群體間遺傳距離為 0.0055，中游群體和下游群體間遺傳距離為0.0054。Cytb基因序列中，群體內(nèi)的遺傳距離分別為0.0014、0.0022、0.0027. 上游群體與中游群體間遺傳距離為 0.0019，上游群體與下游群體間遺傳距離為0.0021，中游群體和下游群體間遺傳距離為0.0023。群體內(nèi)和群體間差別不大。3個群體的D-loop和Cyt b序列的單倍型多樣性 H、平均核苷酸變異數(shù) K、和核苷酸多樣性π見表3，群體間的Fst和Nm值見表4，群體間的遺傳變異的分子變異等級分析（AMOVA）見表 5，3個群體間 D-loop和Cyt b序列遺傳差異不顯著（Fst=-0.00147或-0.01188，p＞0.05）。

表2 紅水河鳙D-loop和Cyt b基因序列群體內(nèi)和群體間遺傳距離

表3 3個鳙群體相關(guān)遺傳多樣性指標(biāo)

表4 3個鳙群體間的Fst和Nm

表5 3個鳙群體間的遺傳變異的分子變異等級分析（AMOVA）

2.3 分子系統(tǒng)樹

以鳙的D-loop和Cyt b基因序列為外群，用NJ法構(gòu)建分子系統(tǒng)樹，其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)見圖1?？梢姡?個群體的個體混雜在一起，群體間未表現(xiàn)出聚類關(guān)系。

圖1 紅水河3個鳙群體D-loop（左）和Cyt b（右）基因序列的NJ分子系統(tǒng)樹

3 討論

單倍型多樣性（H）、平均核苷酸差異數(shù)（K）和核苷酸多樣性（π）是反映物種遺傳變異水平的3個重要參數(shù)，3個群體遺傳多樣性差別不大，群體內(nèi)和群體間也基本無差別。遺傳變異的分子變異等級分析結(jié)果為不顯著。24個樣本的D-loop序列分屬15個單倍型，而cyt b序列分屬5個單倍型。上、中、下游均有共享單倍型，NJ系統(tǒng)樹也顯示3個群體并未聚集為獨立的分支。由于線粒體DNA為母系遺傳，一般不發(fā)生重組，表明3個群體間遺傳分化不大。

紅水河綜合利用規(guī)劃實施后，紅水河流域形成了 9個首尾銜接的梯級水庫，流水生境絕大部分已經(jīng)萎縮，天然河道和庫區(qū)流水江段大為縮短，多數(shù)流水性魚類，特別是產(chǎn)漂流性卵的魚類，在庫區(qū)已不具備形成自然種群條件，近十年來，針對產(chǎn)漂流性卵魚類資源下降的問題，各地政府大力開展了增殖放流活動，由于其他土著性魚類人工繁育技術(shù)成熟度相對較低，苗種獲得不易，四大家魚的放流數(shù)量占了各地放流比例的 90%以上。而鳙由于其食性為濾食性，在紅水河流域各水庫普遍具有富營養(yǎng)化趨勢的前提下，不僅在增殖放流中所占比例較大，更是生態(tài)網(wǎng)箱養(yǎng)殖和圍欄養(yǎng)殖的主要品種。鳙的 3個群體間遺傳分化不大，可能是流域開發(fā)時間僅三十年左右，原本連通的群體分隔后尚未產(chǎn)生顯著遺傳分化。也可能是各地增殖放流和生態(tài)養(yǎng)殖的鳙，親本來源較為接近，流域原有的群體因繁殖環(huán)境喪失，已經(jīng)完全被放流群體取代。由于缺乏紅水河流域梯級開發(fā)前，鰱的遺傳多樣性分析數(shù)據(jù)，筆者所在的研究團(tuán)隊擬開展紅水河流域鳙捕撈群體和各地放流群體間的遺傳多樣性對比分析，以明確紅水河鳙遺傳多樣性特征的形成機(jī)理。

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Comparison of mitochondrial D-loop and Cyt b sequences of Aristichthys nobilis

Sequences of mitochondfial D-loop and Cytb gene of29 individuals of Aristichthys nobilis which were sampled from three populations in Hongshui River were determined.Using PCR amplification and sequencing，823 bp of D-loop partial sequences and1090 bp of Cyt b partial sequences were obtained.In D-loop sequences，a total of17 polymorphic sites defined15 distinct haplotypes， 4 transition，and13 insert/lacuna loci were found.In Cyt b sequences， 7polymorphic sites and 5 haplotypes were defined，2 transition and 5 insert/lacuna loci were found. Two sequence analysis showed that， within groups and between groups， the genetic distance is small. the genetic variation of molecular variation level is not significant. Upper， middle and lower reaches are shared haplotypes， among three populations little genetic differentiation.

Aristichthys nobilis； Hongshui River； D-loop； Cyt b； genetic diversity

Q349；Q953

A

1008-1151（2016）01-0026-03

2015-12-10

社會公益研究項目（CXIF-2014-006）。

吳偉軍（1976-），男（侗族），廣西龍勝人，廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院和廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點實驗室工程師，從事生態(tài)學(xué)研究工作。

何安尤（1964-），廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院高級工程師，從事水生動物多樣性保護(hù)研究工作。