張媛媛，張 彬（石家莊學(xué)院，河北 石家莊 050035）

苯酚-硫酸法與蒽酮-硫酸法測定綠茶茶多糖的比較研究

張媛媛，張 彬
（石家莊學(xué)院，河北 石家莊 050035）

對苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法在茶多糖測定中的差異進行比較，并對苯酚-硫酸法的檢測條件進行優(yōu)化，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選定苯酚質(zhì)量分數(shù)、硫酸用量、顯色時間3 個因素，利用響應(yīng)面試驗考察各因素變化對吸光度的影響。通過優(yōu)化得到最佳測定條件為4.8%苯酚溶液1 mL、濃硫酸5 mL、顯色時間29 mi n、檢測波長488 nm。在此條件下的標準曲線在0～0.2 mg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。該方法對3 種樣品的加標回收率均不小于97.55%，重復(fù)性實驗相對標準偏差為1.82%，說明此方法準確可靠、穩(wěn)定性高，適合于茶多糖的測定。

茶多糖；苯酚-硫酸法；蒽酮-硫酸法；響應(yīng)面分析法

茶葉起源于中國，是中國文獻記載最早的醫(yī)用草藥之一。在東亞地區(qū)，特別是在中國和日本，有用綠茶治療糖尿病的傳統(tǒng)。據(jù)報道，茶葉尤其是綠茶，具有廣泛的醫(yī)用和營養(yǎng)價值，如降血糖、降血脂、降血壓、抗血凝、抗腫瘤、增強機體非特異性免疫等[1]。有研究表明，茶多糖是從茶葉中提取出來的具有多種生物活性且結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多糖復(fù)合物，是茶葉生物活性的重要活性成分[2-3]。目前，測定多糖含量的方法主要有蒽酮-硫酸法[4-6]、苯酚-硫酸法[7-10]、高效液相色譜法[11-13]、酶法等[14-15]。高效液相色譜法與酶法由于樣品前處理工序比較繁瑣，測定時間較長，且檢測費用較高等原因，不能廣泛使用。而蒽酮-硫酸法與苯酚-硫酸法由于操作簡單、實用性強，在多糖研究中廣泛使用[16-21]，但采用2 種方法測定茶多糖準確性的比較研究鮮見有文獻報道，本實驗比較苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法在茶多糖測定中的應(yīng)用，確定了較優(yōu)的檢測方法。采用響應(yīng)面分析法[22-25]對苯酚-硫酸法檢測條件進行了優(yōu)化，得到了最佳的檢測條件，使得優(yōu)化后的苯酚-硫酸法測定茶多糖含量的數(shù)據(jù)更準確、穩(wěn)定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

日照綠茶（原產(chǎn)地山東）、婺源綠茶（原產(chǎn)地江西）、信陽毛尖（原產(chǎn)地河南） 市售；無水乙醇、蒽酮、苯酚、濃硫酸、葡萄糖（均為分析純） 國藥集團上海試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2000雙光束紫外-可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司；FA1104電子天平 上海精天電子儀器廠；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海榮生有限公司；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 實驗溶液的配制

1.3.1.1 粗茶多糖溶液的制備

稱取一定量已干燥的茶葉粉末，添加到80%乙醇溶液中浸泡4 h，抽濾，濾渣干燥后加入20 倍體積的蒸餾水，90 ℃水浴回流提取1 h，間歇攪拌，離心分離，取上清液，備用。

1.3.1.2 精制茶多糖的制備

將粗多糖溶液真空濃縮至原體積的1/4，采用Sevag法除蛋白，蒸餾水透析24 h，加入無水乙醇使乙醇體積分數(shù)達到80%進行醇沉，于4 ℃冰箱中靜止12 h，離心分離，所得沉淀依次用丙酮、乙醚各洗滌，然后干燥，即得精制茶多糖，備用。

1.3.1.3 葡萄糖標準溶液的配制

準確稱取葡萄糖標準品0.200 0 g，置于200 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，配成1.0 mg/mL的標準溶液，然后分別移取2.5、5、10、15、20 mL標準溶液，置于100 mL容量瓶中稀釋至刻度，搖勻，配成系列葡萄糖標準溶液。

1.3.1.4 蒽酮-硫酸溶液的配制

稱取0.33 g蒽酮，加100 mL濃硫酸，置于棕色瓶中，混合搖勻置于冰箱中（現(xiàn)配現(xiàn)用） 。

1.3.1.5 苯酚溶液的配制

稱取苯酚100 g，加鋁片0.1 g和碳酸氫鈉0.05 g，常壓蒸餾，收集（180±2）℃餾分。精密稱取該餾分5 g于100 mL容量瓶中，再加入95 g蒸餾水，搖勻后轉(zhuǎn)置于棕色試劑瓶中，即得質(zhì)量分數(shù)為5%的苯酚溶液，將其置于冰箱中備用。

1.3.2 苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法精確度實驗

1.3.2.1 蒽酮-硫酸法反應(yīng)產(chǎn)物的吸收光譜

分別移取茶多糖溶液和葡萄糖標準品溶液1 mL于具塞試管中，以1 mL蒸餾水作空白，室溫條件下加入5 mL蒽酮-硫酸溶液，快速置冰水浴中搖勻，然后置于沸水浴中加熱，觀察其顏色變化，10 min后用自來水冷卻至室溫，在400～900 nm區(qū)域掃描吸收曲線。

1.3.2.2 苯酚-硫酸法反應(yīng)產(chǎn)物的吸收光譜

分別移取上述茶多糖溶液和葡萄糖標準品溶液1 mL于具塞試管中，以1 mL蒸餾水作空白，置冰水浴中加入3%苯酚溶液1 mL，搖勻，分別加入濃硫酸5 mL，搖勻，靜置30 min，自來水冷卻至室溫，在400～900 nm區(qū)域掃描吸收曲線。

1.3.2.3 苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法穩(wěn)定性實驗

分別取茶多糖樣品溶液1 mL于具塞試管中，以1 mL蒸餾水作空白，分別采用蒽酮-硫酸法和苯酚-硫酸法進行顯色反應(yīng)，并對其進行時間-吸光度曲線掃描。

1.3.2.4 苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法2 種檢測方法精密度實驗

分別取茶多糖樣品溶液1 mL于具塞試管中，以1 mL蒸餾水作空白，分別采用蒽酮-硫酸法和苯酚-硫酸法進行顯色反應(yīng)，在120 min內(nèi)，間隔20 min檢測一次，考察其精密度。

1.3.2.5 苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法的回收率實驗

精密量取已知含量的茶多糖樣品溶液6 份，分成2 組置于具塞試管中，分別加入已知含量的葡萄糖標準溶液，采用苯酚-硫酸和蒽酮-硫酸法測定其吸光度，分別計算加標回收率。

1.3.3 單因素試驗設(shè)計

以葡萄糖標準溶液為研究對象，以吸光度為響應(yīng)值，以蒸餾水為空白，在488 nm波長條件下，分別考察苯酚質(zhì)量分數(shù)、苯酚用量、濃硫酸用量、顯色時間對實驗結(jié)果的影響。

1.3.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，結(jié)合用Box-Behnken響應(yīng)面分析軟件提供的模型，選取苯酚質(zhì)量分數(shù)（X1）、硫酸用量（X2）、顯色時間（X3）3 個因素為自變量，以吸光度為響應(yīng)值，設(shè)計三因素三水平的試驗進行優(yōu)化，試驗設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levers used in response surface design

1.3.5 葡萄糖標準曲線的繪制

分別準確移取1 mL系列標準溶液于具塞試管中，以1 mL蒸餾水作空白，置冰水浴中加入3%苯酚溶液1 mL，搖勻，分別加入濃硫酸5 mL，搖勻，靜置30 min，自來水冷卻至室溫，于488 nm波長處測定吸光度，制備標準曲線，并計算回歸方程。

1.3.6 樣品中茶多糖含量的測定

取1 mL茶多糖樣液，加5%苯酚溶液1 mL，混勻后加濃硫酸5 mL，搖勻，室溫放置30 min，靜置30 min，自來水冷卻至室溫后，于488 nm波長處測定吸光度，根據(jù)式（1）計算茶多糖含量：

式中：C為樣品中葡萄糖質(zhì)量濃度/（mg/mL）；D為茶多糖溶液的稀釋因子；f為校正因子；m為樣品茶葉的質(zhì)量/mg。

1.3.7 校正因子的測定[22]

準確稱取精制茶多糖10 mg，定容于50 mL容量瓶中，采用苯酚-硫酸比色法測定其吸光度，由標準曲線求出此精制茶多糖貯備液中葡萄糖質(zhì)量濃度，按式（2）計算校正因子（f）：

式中：m為稱取茶多糖的質(zhì)量/mg；C為精制茶多糖貯備液中葡萄糖質(zhì)量濃度/（mg/mL）；D為茶多糖溶液稀釋因子。

1.3.8 加標回收率實驗

精密量取已知含量的3 種茶多糖樣品溶液各3 份，置于具塞試管中，分別加入已知含量的葡萄糖標準溶液，在最佳檢測條件下測定吸光度，計算加標回收率。

1.3.9 重復(fù)性實驗

采用優(yōu)化后的苯酚-硫酸法間隔2 h對茶多糖進行一次檢測，重復(fù)7 次，考察其重復(fù)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法吸收波長的比較

采用苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法對葡萄糖和茶多糖進行測定，于UV-2000雙光束紫外-可見分光光度計上，掃描其在400～900 nm區(qū)域的最大吸收波長，其波長曲線變化見圖1。

圖1 2 種方法測定葡萄糖（A）和茶多糖（B）吸收波長的比較Fig.1 Comparison of absorption wavelengths for the detection of glucose (A) and tea polysaccharides (B) by phenol-sulfuric acid method and anthrone-sulfuric method

從圖1可見，在苯酚-硫酸法測定葡萄糖和茶多糖的實驗中，葡萄糖在488 nm波長處有明顯的最大吸收峰，茶多糖時在484 nm波長處有最大吸收峰，其余波段無干擾峰的存在，說明茶多糖在苯酚-硫酸作用下生成絡(luò)合衍生物組分較單一，顯色效果更好。采用蒽酮-硫酸法測定葡萄糖和茶多糖時，發(fā)現(xiàn)在400～900 nm波長范圍內(nèi)的吸收波長變化較多，葡萄糖在460 nm和600 nm波長附近出現(xiàn)較高的吸收峰；而茶多糖在460 nm波長處出現(xiàn)最大吸收峰，但與苯酚-硫酸法相比，最大吸收峰不明顯，而且干擾峰較多，測定方法準確性不佳。

2.2 苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法穩(wěn)定性實驗結(jié)果

2.2.1 苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法反應(yīng)產(chǎn)物的時間掃描光譜

對茶多糖溶液分別采用苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法進行測定，用UV-2000雙光束紫外-可見分光光度計進行時間掃描，掃描時間為120 min，其結(jié)果見圖2。

圖2 2 種方法測定茶多糖穩(wěn)定性比較Fig.2 Comparison of the stability of the two methods for determination of tea polysaccharides

由圖2可知，茶多糖與蒽酮-硫酸試劑顯色后，隨著時間的變化，吸收曲線也有變化，在25 min左右出現(xiàn)較大波動，隨后迅速降低，其原因可能是茶多糖在蒽酮-硫酸試劑作用下生成的衍生物不穩(wěn)定，受環(huán)境溫度和時間的影響較大，影響結(jié)果的準確性。而采用苯酚-硫酸法顯色的茶多糖吸收曲線受環(huán)境溫度和時間的影響變化不大，在120 min內(nèi)很穩(wěn)定。

2.2.2 苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法精確度實驗結(jié)果

分別采用苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法與茶多糖樣品溶液進行檢測，得到其反應(yīng)產(chǎn)物。在120 min內(nèi)間隔20 min測定一次吸光度，結(jié)果見表2。

表2 苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法測定茶多糖精確度比較（吸光度）Table 2 Comparison of the accuracy of the two methods for determination of tea polysaccharides

由表2可見，120 min內(nèi)2 種檢測方法的吸光度的變化進行考察，發(fā)現(xiàn)蒽酮-硫酸法吸光度精確度較低，相對標準偏差為6.18%，而苯酚-硫酸法表現(xiàn)較為穩(wěn)定，精確度較高，相對標準偏差為1.99%。

2.2.3 苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法的回收率實驗結(jié)果

表3 2 種方法的回收率實驗結(jié)果Table 3 Results of recovery experiments using the two methods

如表3所示，蒽酮-硫酸法的回收率實驗結(jié)果波動較大，其相對標準偏差為4.82%，而苯酚-硫酸法的回收率實驗結(jié)果更為可靠，其相對標準偏差為1.26%，更為適合茶多糖的檢測。

通過上述實驗結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，苯酚-硫酸法在反應(yīng)產(chǎn)物的穩(wěn)定性、測定精確度以及樣品回收率方面均優(yōu)于蒽酮-硫酸法，本實驗選擇苯酚-硫酸法進行下一步的優(yōu)化實驗。

2.3 最大吸收波長的確定

采用苯酚-硫酸法顯色后，葡萄糖在488 nm波長處有最大吸收峰，而茶多糖在484 nm波長處有最大吸收峰，兩者最大吸收峰的波長非常接近?？紤]到由于產(chǎn)地不同，茶葉中所含茶多糖的單糖組成存在一定差異，其在濃硫酸作用下與苯酚的顯色情況也存在差異，而本方法是以葡萄糖為標準單糖的，所以選擇測定最大吸收波長為488 nm。

2.4 單因素試驗結(jié)果

2.4.1 苯酚質(zhì)量分數(shù)的影響

由圖3可知，吸光度隨著苯酚質(zhì)量分數(shù)的增加而增加，但到達5%以后增勢趨于平緩，所以苯酚試劑的質(zhì)量分數(shù)選擇5%左右。

圖3 苯酚質(zhì)量分數(shù)對吸光度的影響Fig.3 Effect of phenol concentration on the absorbance

2.4.2 苯酚用量的確定

圖4 苯酚用量對吸光度的影響Fig.4 Effect of phenol dosage on the absorbance

由圖4可知，在低用量時，吸光度隨著苯酚用量的增加而增加，在用量為1 mL時吸光度達到最大值。但當(dāng)苯酚試劑的用量超過1 mL時吸光度反而苯酚試劑用量的增加而降低，所以苯酚試劑的適宜用量應(yīng)選擇1 mL。

2.4.3 硫酸用量的確定

圖5 硫酸用量對吸光度的影響Fig.5 Effect of sulfuric acid dosage on the absorbance

由圖5可看出，吸光度隨著硫酸用量的增加不斷提高，但超過5 mL后，再增加硫酸的量，其吸光度迅速下降，其原因可能是過量的硫酸造成顯色物質(zhì)的分解，因此硫酸的適宜用量應(yīng)選擇5 mL左右。

2.4.4 顯色時間的確定

由圖6可看出，顯色時間較短時，反應(yīng)進行不完全，吸光度較低，當(dāng)?shù)竭_30 min后，吸光度接近穩(wěn)定，所以適宜的顯色時間應(yīng)選擇30 min左右。

圖6 顯色時間對吸光度的影響Fig.6 Effect of color development time on the absorbance

2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果及數(shù)據(jù)分析

2.5.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken軟件提供的模型，設(shè)計了三因素三水平隨機共15 個試驗點的響應(yīng)面試驗，結(jié)果見表4。

表4 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 4 Experimental design and results for response surface analysis

2.5.2 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)表4的試驗結(jié)果，用SAS統(tǒng)計分析軟件進行多元回歸分析，得到關(guān)于苯酚質(zhì)量分數(shù)、硫酸用量、顯色時間的數(shù)據(jù)模型，經(jīng)回歸擬合后，試驗因素對響應(yīng)值的影響可用回歸方程如下：

由表5中對回歸方程的分析結(jié)果可知，該模型P＜0.001，表明試驗選擇的模型高度顯著。因變量和自變量之間的作用關(guān)系顯著，各因素之間的交互作用也顯著。其中一次項，二次項以及硫酸用量與顯色時間這一組交互項對試驗結(jié)果的影響表現(xiàn)出極高顯著性，苯酚質(zhì)量分數(shù)與顯色時間這一組交互項對試驗結(jié)果的影響表現(xiàn)為一般顯著，如圖7所示。回歸方程的系數(shù)R2為98.37%，說明回歸方程的擬合程度很好，不存在模型擬合不足的現(xiàn)象，用上述回歸方程描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系能夠真實地反映數(shù)據(jù)結(jié)果。

表5 回歸方程方差和顯著性差異Table 5 Significance test of regression equation coefficients for the regression mooddeell

圖7 各因素交互作用對吸光度影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface plots for the interactive effects of experimental conditions on the absorbance value

2.5.3 尋求最佳測定條件

由響應(yīng)面曲面圖可知，該模型存在最大值，通過SAS軟件分析得到，苯酚質(zhì)量分數(shù)（X1）為4.747%、硫酸用量（X2）為4.820 mL，顯色時間（X3）為28.787 min，考慮到方便實際操作等因素，選苯酚質(zhì)量分數(shù)（X1）為4.8%，硫酸用量（X2）為5 mL，顯色時間（X3）為29 min。

2.6 葡萄糖標準曲線的繪制

取配制好的葡萄糖標準溶液，采用優(yōu)化后的檢測條件，在488 nm波長處測定吸光度，以吸光度（X）對葡萄糖質(zhì)量濃度（Y）作回歸處理，得出標準曲線的回歸方程為Y=5.777 9X－0.015 5，R2=0.999 6，說明該標準曲線在0～0.2 mg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.7 茶多糖測定結(jié)果

2.7.1 茶多糖含量的測定

取茶多糖樣品，采用優(yōu)化后的苯酚-硫酸法對其進行測定，根據(jù)公式計算，得茶多糖含量為6.37%，校正因子為1.72。

2.7.2 加標回收率

表6 加標回收率實驗結(jié)果Table 6 Results of recovery experiments using the optimized phenol-sulfuric acid method

對3 個樣品進行加標回收率實驗，如表6所示，通過計算日照綠茶、婺源綠茶和信陽毛尖的加標回收率分別為98.52%（相對標準偏差為1.42%）、98.82%（相對標準偏差為1.91%）、97.55%（相對標準偏差為1.54%），說明該檢測方法準確可信。

2.7.3 重復(fù)性

表7 重復(fù)性實驗結(jié)果Table 7 Results of reproducibility experiments using the optimized phenol-sulfuric acid method

從表7可看出，苯酚-硫酸法測定結(jié)果重復(fù)性好，其相對標準偏差為1.82%，說明此測定方法穩(wěn)定可靠。

3 結(jié) 論

本實驗分別對苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法2 種檢測對茶多糖的測定進行了比較，通過最大吸收波長掃描、精確度實驗以及樣品回收率實驗發(fā)現(xiàn)苯酚-硫酸法在穩(wěn)定性和準確性上均優(yōu)于蒽酮-硫酸法。對苯酚-硫酸法的檢測條件進行了優(yōu)化，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選定苯酚質(zhì)量分數(shù)、硫酸用量、顯色時間3 個因素，進行響應(yīng)面分析試驗。通過SAS軟件得到的試驗?zāi)Ｐ惋@著性高，擬合程度好，可靠性高，能夠真實地反映數(shù)據(jù)情況。通過優(yōu)化得到苯酚-硫酸法的最佳測定條件為4.8%苯酚溶液1 mL、濃硫酸5 mL、顯色時間29 min、檢測波長488 nm。標準曲線在0～0.2 mg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。該方法3 種樣品的加標回收率不小于97.55%，重復(fù)性實驗相對標準偏差為1.82%，說明此方法準確可靠、穩(wěn)定性高，適合于茶多糖的測定，具有較好的使用價值。

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Comparison of Phenol-Sulfuric Acid and Anthrone-Sulfuric Methods for Determination of Polysaccharide in Green Tea

ZHANG Yuanyuan, ZHANG Bin
(Shijiazhuang University, Shijiazhuang 050035, China)

This study aimed to establish a phenol-sulfuric acid method for the determination of the polysaccharide content in green tea and evaluate its performance in comparison with that of the anthrone-sulfuric method. In the phenol-sulfuric acid method, three experimental conditions including phenol concentration, sulfuric acid dosage and color development time were optimized by single factor experiments and response surface methodology using absorbance value as the dependent variable. A mathematical regression model was established. The optimum experimental conditions were found as followes: 1 mL of 4.8% aqueous phenol solution, 5 mL of concentrated sulfuric acid, and detection at 488 nm after 29 min of color development. There was a good linear relationship between absorbance and concentration in the range from 0 to 0.2 mg/mL. The experimental results showed that the average recovery rate was equal to or higher than 97.55% with good reproducibility (RSD = 1.82%, n = 7). The phenol-sulfuric acid method was rapid, accurate, sensitive and suitable for the determination of polysaccharide in green tea.

tea polysaccharide; phenol-sulfuric acid method; anthrone-sulfuric method; response surface methodology

10.7506/spkx1002-6630-201604028

TS207.3

A

1002-6630（2016）04-0158-06

張媛媛, 張彬. 苯酚-硫酸法與蒽酮-硫酸法測定綠茶茶多糖的比較研究[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(4): 158-163.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604028. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Yuanyuan, ZHANG Bin. Comparison of phenol-sulfuric acid and anthrone-sulfuric methods for determination of polysaccharide in green tea[J]. Food Science, 2016, 37(4): 158-163. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604028. http://www.spkx.net.cn

2015-05-19

張媛媛（1983—），女，講師，博士，研究方向為天然產(chǎn)物開發(fā)與應(yīng)用。E-mail：zhyy701@163.com