王常喜，岳麗麗，許海燕，烏妮爾，黃 燕，張海鵬，高 杰，馬超美（內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021）

超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用法同時測定蒙藥全石榴、中藥石榴皮及新鮮石榴中7 種成分

王常喜，岳麗麗，許海燕，烏妮爾，黃 燕，張海鵬，高 杰，馬超美*
（內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021）

采用超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用法，同時檢測蒙藥全石榴皮及籽、中藥石榴皮、鮮石榴皮及籽中訶子鞣質(zhì)A、訶子鞣質(zhì)B、訶子裂酸、五沒食子酰葡萄糖、鞣料云實素、訶黎勒酸和沒食子酸7 種成分。選用表兒茶素-4-乙酰半胱氨酸作為內(nèi)標(biāo)。石榴樣品經(jīng)粉碎用甲醇（含內(nèi)標(biāo)液）溶液超聲提取，采用ZORBAX Eclipse XDB-C18柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），以甲醇-0.1%甲酸溶液為流動相，梯度洗脫，以電噴霧離子源，采用超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測模式測定。結(jié)果表明，7 種成分檢出限均小于0.013 5 μg/mL，定量限均小于0.054 2 μg/mL，在0.003 4～13.875 0、0.013 5～13.875 0、0.003 4～13.875 0、0.216 8～55.500 0、0.867 2～55.500 0、0.216 8～55.500 0、0.003 4～13.875 0 μg/mL范圍內(nèi)，峰面積與質(zhì)量濃度呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.99；方法回收率為99.44%～105.54%；其日內(nèi)及日間精密度實驗的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.11%～0.95%和0.14%～1.21%。該方法靈敏度高、穩(wěn)定性強(qiáng)、操作簡便、快捷、準(zhǔn)確，可用于蒙藥全石榴、中藥石榴皮、鮮石榴及其相關(guān)食品藥品的質(zhì)量控制。

石榴；全石榴；石榴皮；超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用；同時測定

石榴（Punica granatum L.）為石榴科石榴屬植物，原產(chǎn)于中亞地區(qū)，唐朝時傳入我國，并得以廣泛栽培。石榴果實色澤艷麗，籽粒晶瑩、清香可口，享有“霧殼作房珠作骨，水晶為粒玉為漿”的美譽(yù)，是一種老少咸宜的果品[1]。據(jù)報道[2]，石榴營養(yǎng)豐富，其中含有大量的有機(jī)酸、糖類、蛋白質(zhì)、脂肪、維生素以及鈣、磷、鉀等礦物質(zhì)。不僅可生食，還可以加工成石榴果汁、果醬、果凍、濃縮石榴汁、糖漿、石榴酒和馬丁尼酒；石榴葉片還可以加工成石榴茶。

石榴皮中主要含有鞣質(zhì)、多酚及黃酮類化合物。它們具有抗癌[3]、抗炎、抗氧化[4]和抑菌[5-6]的作用。石榴籽中含有黃酮類化合物、原花色素及脂肪酸等成分，具有抗氧化、降血糖等作用。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為，石榴味甘、酸、澀、性溫、歸肺、腎和大腸經(jīng)，具有生津止渴、收斂止瀉、止血、殺蟲和解酒等功效[7]，多以石榴皮入藥。而在蒙醫(yī)藥臨床應(yīng)用中多以全石榴入藥，用于澀腸、止血、驅(qū)蟲，治療久瀉、久痢等[8]。

目前，用于石榴有效成分定量分析的方法有高效液相色譜-二極管陣列檢測器法、高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器法、氣相色譜-質(zhì)譜法、分光光度法、Folin-Ciocalteu比色法及高效毛細(xì)管電泳法[9-15]等。這些方法對石榴及其衍生產(chǎn)品的質(zhì)量控制有著重要的作用。然而到目前為止，鮮見可以同時快速分析石榴中包括訶子鞣質(zhì)A、訶子鞣質(zhì)B等多種多酚類成分的理想方法。

現(xiàn)代新型分析儀器如超高效液相色譜能顯著提高分辨率并縮短測定時間，質(zhì)譜檢測器特別是其多反應(yīng)監(jiān)測模式能夠大幅提高檢測靈敏度和特異性，優(yōu)化的內(nèi)標(biāo)測定法還能補(bǔ)償回收率不佳等問題，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在食品功能成分及有害物質(zhì)殘留的檢測方面發(fā)揮了越來越重要的作用[16-18]。本實驗采用超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜（ultra-high-performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry，UPLC-QQQMS）聯(lián)用法，對蒙藥全石榴的皮與籽、中藥石榴皮及新鮮石榴的皮與籽中7 種鞣質(zhì)類化合物：訶子鞣質(zhì)A、訶子鞣質(zhì)B、訶子裂酸、五沒食子酰葡萄糖、鞣料云實素、訶黎勒酸和沒食子酸進(jìn)行同時測定，并對各化合物的分布情況進(jìn)行了比較分析，以期為石榴藥材、成藥及相關(guān)食品質(zhì)量控制提供新的方法，并為石榴皮與籽的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮石榴 市購；所有石榴樣品經(jīng)內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院馬超美教授鑒定為石榴科石榴屬石榴（Punica granatum L.）；蒙藥全石榴 安國市祁澳中藥飲片有限公司；中藥石榴皮 呼和浩特市萬福大藥房；所有鞣質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品均由內(nèi)蒙古大學(xué)天然藥物與功能食品研究室分離制備，并用多種光譜法確定其結(jié)構(gòu)[19]（高效液相色譜法檢測純度大于98%）。

甲醇（色譜純） 美國Fisher Scientific公司；甲酸（色譜純） 天津阿法埃莎化學(xué)有限公司；屈臣氏蒸餾水 廣州屈臣氏食品飲料有限公司；二甲基亞砜（分析純） 日本和光公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1290 UPLC-高分辨串聯(lián)6430四極桿-MS聯(lián)用儀（配有電噴霧電離源） 美國安捷倫科技公司；PS-20超聲波清洗儀 潔康超聲波設(shè)備有限公司；CF-10高速離心機(jī) 大韓科學(xué)有限公司；FDU-1200冷凍干燥機(jī) 東京理化器械株式會社；TB-25電子天平 丹佛儀器有限公司；移液槍 大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司；有機(jī)相微孔濾膜 天津富集科技有限公司；Sep-Pak?Plus tC18固相萃取柱 美國沃特世公司。

1.3 方法

1.3.1 LC條件

ZORBAX Eclipse XDB-C18柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；柱溫30 ℃；流速0.4 mL/min；進(jìn)樣量1 μL；流動相：A相為0.1%甲酸溶液，B相為甲醇。流動相A、B的梯度洗脫程序如表1所示。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution program

1.3.2 MS條件

UPLC-QQQMS接有電噴霧離子源，采用負(fù)離子化模式；噴霧電壓4 500 V；干燥氣體氮?dú)?；干燥氣流?2 L/min；干燥氣體溫度350 ℃；毛細(xì)管電壓：負(fù)離子3 500 V；采用選擇離子監(jiān)控模式優(yōu)化待測化合物電壓，子離子掃描模式：優(yōu)化子離子、定性離子及二者碰撞能量，多反應(yīng)監(jiān)測模式優(yōu)化各組分分離洗脫條件，最后采用動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測模式高選擇性地分析測定各組分。8 種分析物MS條件見表2。

表2 MS優(yōu)化條件Table 2 Optimized mass spectrometry conditions

1.3.3 溶液配制

7 種標(biāo)準(zhǔn)品各稱取適量于1.5 mL離心管中，二甲基亞砜溶解過濾，配制成10 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品儲液；表兒茶素-4-乙酰半胱氨酸稱取適量于1.5 mL離心管中，甲醇溶解過濾配制成1 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液儲液。

1.3.4 樣品前處理

將鮮石榴冷凍干燥處理，之后將全石榴皮、全石榴籽、中藥石榴皮、鮮石榴皮、鮮石榴籽樣品敲碎成小米粒大小，各樣品稱取約50 mg，分別置于2 mL離心管中，用1 mL甲醇（含內(nèi)標(biāo)液）溶液超聲提取10 min，離心（轉(zhuǎn)速6 000 r/min）取上清液，重復(fù)3 次，制得提取液。提取液用Sep-Pak?Plus tC18固相萃取柱萃取，再用0.22 μm有機(jī)相微孔濾膜過濾后進(jìn)樣供LC-MS儀檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 UPLC-QQQMS條件優(yōu)化

通過改變流動相A、B兩相比例尋找到最佳分離條件，7 種標(biāo)準(zhǔn)品及內(nèi)標(biāo)用表1中梯度洗脫條件在5 min內(nèi)得到分離。為了得到最靈敏的檢測條件，對MS碰撞電壓和碰撞能量進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后的參數(shù)列于表2。在此條件下用MS動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測模式檢測到8 種化合物的色譜疊加效果見圖1。鞣料云實素與表兒茶素-4-乙酰半胱氨酸難以得到色譜完全分離，一般的紫外檢測將難以得到準(zhǔn)確的定量結(jié)果，動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測模式檢測在這種情況下發(fā)揮了其優(yōu)勢，對這2 個母離子和子離子不同的化合物可分別給出準(zhǔn)確峰面積，進(jìn)而準(zhǔn)確定量。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品混和物的動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測模式掃描圖Fig.1 UPLC-QQQMS profile of a mixture of standard compounds in MRM mode

2.2 線性范圍及檢出限

用含有1 μg/mL表兒茶素-4-乙酰半胱氨酸的內(nèi)標(biāo)液配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液。7 種標(biāo)準(zhǔn)品儲備液先分別用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋為1 mg/mL，然后分別吸取稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液各50 μL，混合均勻，用內(nèi)標(biāo)溶液將混合液按體積比1∶4∶4∶4∶4∶4∶4∶4∶4的比例梯度稀釋，制得9 份混合標(biāo)準(zhǔn)品使用液。采用所優(yōu)化的MS條件與LC條件檢測標(biāo)準(zhǔn)混合溶液（質(zhì)量濃度范圍為0.000 9～55.500 0 μg/mL）。用Agilent Mass Hunter定量分析軟件對UPLC-QQQMS檢測結(jié)果進(jìn)行分析，以待測物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，待測物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。各對照品的線性關(guān)系如表3所示。取3 倍信噪比的待測物質(zhì)量濃度為方法檢出限，取10 倍信噪比的待測物質(zhì)量濃度為方法定量限。由表3可知，7 種標(biāo)準(zhǔn)品在各自的線性范圍內(nèi)具有良好的線性相關(guān)性，定量限均小于0.054 2 μg/mL，檢出限均小于0.013 5 μg/mL，可滿足實際檢測的需要。

表3 各對照品的線性關(guān)系Table 3 Linear relationships of reference substances

2.3 樣品分析

表4 全石榴皮、全石榴籽、中藥石榴皮、鮮石榴皮、鮮石榴籽成分含量分析結(jié)果Table 4 Contents of 7 components in different parts of pomegranateTable 4 Contents μg/mg

采用Agilent Mass Hunter定量分析軟件對樣品UPLCQQQMS檢測結(jié)果進(jìn)行分析，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計算得到待測物的質(zhì)量濃度，從而換算出待測物在樣品中的含量，結(jié)果見表4。

其中訶子裂酸、五沒食子酰葡萄糖、鞣料云實素、訶黎勒酸和沒食子酸在石榴皮部分的含量明顯高于石榴籽中的含量，訶子鞣質(zhì)A和訶子鞣質(zhì)B這2 種化合物在全石榴皮中的含量明顯高于其他部位。訶子裂酸具有細(xì)胞保護(hù)活性和抗氧化活性[20]，五沒食子酰葡萄糖具有抗細(xì)菌活性[21]，鞣料云實素具有抗病毒[22]、抗氧化[23]、抗細(xì)菌與抗真菌活性[24-25]，訶黎勒酸具有抗病毒[22]、抗細(xì)菌[24]、抗真菌[26]活性，沒食子酸具有抗細(xì)菌、抗真菌[27]、抗氧化[28]、抗病毒[29]、抗寄生蟲[30-32]等活性。這些具有保護(hù)性作用的化合物可能對石榴皮在抵抗害蟲、微生物，保護(hù)果實方面有一定的作用。

沒食子酸在鮮石榴皮中的含量明顯低于其在全石榴皮和中藥石榴皮的含量，而且在鮮石榴籽中并未檢測到?jīng)]食子酸，這可能意味著石榴藥材在干制的過程中有部分鞣質(zhì)化合物分解為沒食子酸單體，從而提高了石榴藥材中沒食子酸的含量。而沒食子酸具有抗氧化、抗微生物、抗病毒、抗癌[33]等多種生物活性，這說明石榴在干制的過程中，其藥用價值可能會有所提高。

2.4 回收率和精密度

取3 份已知質(zhì)量濃度的溶液，分別向其加入等體積高、中、低3 種已知質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，充分混勻后進(jìn)樣測定計算加樣回收率。結(jié)果顯示，訶子鞣質(zhì)A、訶子鞣質(zhì)B、訶子裂酸、五沒食子酰葡萄糖、鞣料云實素、訶黎勒酸和沒食子酸回收率分為100.62%、99.44%、103.02%、100.78%、104.04%、105.54%、102.07%。配制質(zhì)量濃度為13.875 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品混合液室溫放置，24 h內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6 次測定日內(nèi)精密度，日間精密度則連續(xù)3 d每天進(jìn)樣測定1 次。結(jié)果表明，在混合標(biāo)準(zhǔn)品儲備液中訶子鞣質(zhì)A、訶子鞣質(zhì)B、訶子裂酸、五沒食子酰葡萄糖、鞣料云實素、訶黎勒酸和沒食子酸具有良好的精密度，其日內(nèi)及日間精密度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍分別為0.11%～0.95%和0.14%～1.21%。

3 結(jié) 論

本實驗建立的UPLC-QQQMS內(nèi)標(biāo)法，不僅可以同時定量測定石榴中訶子鞣質(zhì)A、訶子鞣質(zhì)B、訶子裂酸、五沒食子酰葡萄糖、鞣料云實素、訶黎勒酸和沒食子酸7 種鞣質(zhì)成分，還可以快速比較蒙藥全石榴、中藥石榴皮及新鮮石榴在成分含量上的差異。目前在石榴質(zhì)量控制及有效成分測定研究中[7-14]，鮮見類似報道。本實驗所建立的方法穩(wěn)定性強(qiáng)，靈敏度和分辨率高，快速、簡便、準(zhǔn)確，為石榴藥材、成藥及相關(guān)食品的質(zhì)量控制提供了新的定量方法。

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Simultaneous Quantification of 7 Components in Different Parts of Punica granatum Fruits Using Ultra-High Performance Liquid Chromatography-Triple Quadrupole Mass Spectrometry (UPLC-QQQMS)

WANG Changxi, YUE Lili, XU Haiyan, Uneer, HUANG Yan, ZHANG Haipeng, GAO Jie, MA Chaomei*
(School of Life Sciences, Inner Mongolia University, Hohhot 010021, China)

An ultra-high performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry (UPLC-QQQMS) method was developed and validated to simultaneously determine seven constituents including chebumeinin A, chebumeinin B, chebulic acid, pentagalloyl glucose, corilagin, chebulagic acid and gallic acid in dried whole pomegranate (containing peels and seeds, a traditional Mongolian medicinal material), dried pomegranate peels (a traditional Chinese medicinal material), and fresh pomegranate peels and seeds (Punica granatum L.). 4β-(L-acetylcysteinyl)-epicatechin was used as an internal standard for the quantification. The internal standard was added to methanol before being used to extract samples. The separation was performed on an Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18column (2.1 mm × 50 mm, 1.8 μm) with methanol-0.1% formic acid as the mobile phase at a flow rate of 0.4 mL/min. As a result, the linear ranges of chebumeinin A, chebumeinin B, chebulic acid, pentagalloyl glucose, corilagin, chebulagic acid and gallic acid were 0.003 4–13.875 0, 0.013 5–13.875 0, 0.003 4–13.875 0, 0.216 8–55.500 0, 0.867 2–55.500 0, 0.216 8–55.500 0, and 0.003 4–13.875 0 μg/mL, respectively, with correlation coefficients higher than 0.99. The average recovery rate of the developed method ranged from 99.44% to 105.54% and the intra-day and inter-day relative standard deviations (RSDs) were 0.11%–0.95% and 0.14%–1.21%, respectively. This method is sensitive, simple, fast, and accurate, and can be used for the quality control of pomegranate for medicinal use and related food products or pharmaceuticals.

Punica granatum; whole pomegranate; pomegranate peel; ultra-high-performance liquid chromatography triple quadrupole mass spectrometry (UPLC-QQQMS); simultaneous determination

10.7506/spkx1002-6630-201604025

R284.1

A

1002-6630（2016）04-0139-05

王常喜, 岳麗麗, 許海燕, 等. 超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用法同時測定蒙藥全石榴、中藥石榴皮及新鮮石榴中7 種成分[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(4): 139-143. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604025. http://www.spkx.net.cn

WANG Changxi, YUE Lili, XU Haiyan, et al. Simultaneous quantification of 7 components in different parts of Punica granatum fruits using ultra-high performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry (UPLC-QQQMS)[J]. Food Science, 2016, 37(4): 139-143. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604025. http://www.spkx.net.cn

2015-06-05

內(nèi)蒙古大學(xué)校級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃資助項目（201414199）；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項（#20131501110008）

王常喜（1994—），男，本科生，研究方向為天然藥物與功能食品。E-mail：mowoilo@hotmail.com

*通信作者：馬超美（1962—），女，教授，博士，研究方向為天然藥物與功能食品。E-mail：cmma@imu.edu.cn