孫紅霞，陳建光

北五味子乙素對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

孫紅霞，陳建光*

（北華大學(xué)藥學(xué)院，吉林 吉林 132013）

目的：觀察北五味子乙素（schisandrin B，Sch B）對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia/ reperfusion injury，MI/RI）的保護(hù)作用及其作用機(jī)制，為研發(fā)療效確切、抗心肌缺血作用的保健成分提供理論依據(jù)。方法：60 只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為6 組：假手術(shù)組，MI/RI組，Sch B 20、40、80 mg/（kg?d）劑量組，陽性對(duì)照（美托洛爾（metoprol，MET），2.5 mg/（kg?d））組。各組灌胃給藥3 周后建立大鼠缺血再灌注損傷模型，肉眼觀察大鼠心臟組織變化，采用四氮唑硝基藍(lán)（nitro blue tetrazolium，NBT）染色法測(cè)定大鼠心肌梗死面積，利用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定大鼠血清中雜化型肌酸激酶同工酶（creatine kinase-MB，CK-MB）、乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力以及丙二醛（malonaldehyde，MDA）、一氧化氮（nitric oxide，NO）水平，使用生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)測(cè)定大鼠心臟功能指標(biāo)變化，顯微鏡下觀察大鼠心肌病理學(xué)改變狀況。結(jié)果：Sch B能夠明顯減輕MI/RI造成的大鼠心臟損傷，減小心肌梗死面積，提高大鼠血清中SOD活力和NO水平，降低MDA含量和CK-MB、LDH活力，改善大鼠心肌功能。結(jié)論：Sch B對(duì)大鼠MI/RI有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與減少氧自由基釋放、保護(hù)缺血心肌免受MI/RI有關(guān)。

北五味子乙素；心肌缺血再灌注損傷；氧自由基釋放

1960年Jennings第一次提出心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia/reperfusion injury，MI/RI）的概念，指出再灌注會(huì)引起心肌超微結(jié)構(gòu)不可逆的壞死[1-3]。近年來，隨著溶栓療法、經(jīng)皮冠脈介入療法、冠狀動(dòng)脈旁路搭橋術(shù)（coronary artery bypass graft，CABG）及心臟移植術(shù)等廣泛應(yīng)用于臨床，心臟病的治療進(jìn)入再灌注時(shí)期。研究表明自由基、鈣超載、心肌纖維能量代謝障礙、中性粒細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、細(xì)胞黏附分子與細(xì)胞凋亡等均可能參與MI/RI[4-7]。再灌注期間，大量活化的中性粒細(xì)胞聚集在心肌微血管內(nèi)并浸潤到心肌組織中，通過釋放細(xì)胞炎性物質(zhì)、氧自由基、蛋白酶等物質(zhì)引起心肌損傷。MI/RI的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今尚未被完全闡明。

近幾年的研究表明，五味子具有保護(hù)心肌的作用，其具體藥效成分還不明確。五味子含有揮發(fā)油、有機(jī)酸、維生素、木脂素、三萜、倍半萜及多糖等多種化學(xué)成分[8]，但其保護(hù)心肌的活性成分及作用機(jī)制目前尚未明確。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，北五味子總木脂素通過降低血脂水平、抑制中性粒細(xì)胞浸潤、減輕炎癥反應(yīng)對(duì)高脂血癥大鼠的MI/RI具有一定保護(hù)作用，但木脂素中何種成分發(fā)揮作用尚不清楚，因此本實(shí)驗(yàn)通過觀察北五味子中活性成分北五味子乙素（schisandrin B，Sch B）對(duì)MI/RI的保護(hù)作用及作用機(jī)制，為北五味子深度開發(fā)和利用，以及研發(fā)具有療效確切、高效低毒的抗心肌缺血保健成分提供科學(xué)思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與動(dòng)物

Sch B（采用高效液相色譜法測(cè)得其純度＞97.0%），由中國藥品生物制品檢定所提供。

美托洛爾（metoprolol，MET） 天津天士力集團(tuán)；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、肌酸激酶（creatine kinase，CK）試劑盒、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒、一氧化氮（nitric oxide，NO）試劑盒 南京建成生物工程研究所。

健康雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量180～200 g，購于長春高新醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，許可證號(hào)：SCXK-（吉）20013-0001。于清潔級(jí)飼料室飼養(yǎng)大鼠，定時(shí)喂食，飲水不限。

1.2 大鼠MI/RI模型建立方法

按文獻(xiàn)[6]所述，采用結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支（left anterior descending，LAD）造成大鼠心肌缺血模型。穿線或結(jié)扎后即刻記錄心電圖，以心臟左前壁呈紫紺或Ⅱ?qū)?lián)S-T段弓背向上抬高大于0.1 mV并持續(xù)0.5 h以上為結(jié)扎成功標(biāo)志（S-T段無改變者淘汰），3 h后處死大鼠。

1.3 動(dòng)物分組及處理

雄性Wistar大鼠60 只，隨機(jī)分為6 組。模型組：給予生理鹽水10 mL/（kg?d）灌胃；Sch B高劑量組：給予Sch B 80 mg/（kg?d）灌胃；Sch B中劑量組：給予Sch B 40 mg/（kg?d）灌胃；Sch B低劑量組：給予Sch B 20 mg/（kg?d）灌胃；陽性對(duì)照組：給予MET 2.5 mg/（kg?d）灌胃；假手術(shù)組：給予生理鹽水10 mL/（kg?d）灌胃。各組持續(xù)灌胃3 周，末次給藥后2 h進(jìn)行MI/RI模型手術(shù)，其中假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈。

1.4 大鼠心肌梗死面積測(cè)定

再灌注120 min結(jié)束后，切下大鼠心臟，再次結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈，再灌注結(jié)束后，原位結(jié)扎LAD，從主動(dòng)脈將2%伊文氏藍(lán)液2 mL逆行注入，使左心室的非缺血區(qū)染色而缺血區(qū)不染色。取大鼠心臟用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗，用自制心臟切片槽將心臟切成2 mm厚的切片，去除心房和右心室，把左心室放置于37 ℃、0.2 g/100 mL四氮唑硝基藍(lán)（nitro blue tetrazolium，NBT）中孵育15 min。正常心肌細(xì)胞含有脫氫酶，在煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）存在的條件下，可以將無色氧化型NBT還原成還原型的藍(lán)色NBT。心肌梗死一定時(shí)間后，細(xì)胞中脫氫酶因細(xì)胞膜損傷而釋放丟失，不能再使NBT還原，所以梗死心肌不會(huì)被染色。把大鼠左心室切片置于兩張載玻片中，用數(shù)碼照相機(jī)拍照，其彩色圖片可用作心肌梗死面積的測(cè)定。藍(lán)色的區(qū)域?yàn)榉侨毖獏^(qū)，紅色的區(qū)域?yàn)槿毖獏^(qū)且梗死壞死區(qū)，用圖像分析軟件分析各區(qū)，結(jié)果以梗死區(qū)面積占左心室面積百分比表示。

1.5 大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)觀察

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將大鼠立即處死，取心臟，將心臟組織常規(guī)固定，石蠟包埋，切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明處理，中性樹膠封片，于光學(xué)顯微鏡下（×400）觀察。

1.6 大鼠心臟功能檢測(cè)

用生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)記錄并測(cè)定大鼠心率（heart rate，HR）、左心室收縮壓（left ventricular systolic pressure，LVSP）和左心室舒張末壓（leftventricular end diastolic pressure，LVEDP）、左心室內(nèi)壓最大變化速率（±（dP/dt）max）。

1.7 大鼠血清中相關(guān)酶活力及細(xì)胞因子含量測(cè)定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束前對(duì)大鼠心臟取血2 mL，3 000 r/min離心15 min后取上清液，－20 ℃保存后，用7170A全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清中雜化型肌酸激酶同工酶（CK-MB）、LDH、SOD活力以及MDA、NO水平。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)均以±s表示。首先對(duì)各組數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)；各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way analysis of variance，one-way ANOVA）及最小顯著差異（least significant difference，LSD）-t檢驗(yàn)進(jìn)行組間的兩兩比較；均以P＜0.05和P＜0.01認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 Sch B對(duì)大鼠心肌梗死面積的影響

伊文氏藍(lán)能將非缺血區(qū)染色，而缺血區(qū)（area at risk，AAR）不被染色，所以通過伊文氏藍(lán)染色能區(qū)分缺血區(qū)和非缺血區(qū)；缺血區(qū)又分為壞死區(qū)和非壞死區(qū)，非壞死區(qū)能被NBT染色，而壞死區(qū)（area of necrosis，An）不能被NBT染色。一般缺血區(qū)占左心室面積15%～45%之間為急性心肌缺血構(gòu)建成功的標(biāo)志。用Image Pro Plus 7.0圖像分析軟件分析染色結(jié)果（圖1A～1F），測(cè)定缺血區(qū)面積占左心室（left ventricle，LV）面積百分比（AAR/LV，%），以及壞死區(qū)面積占缺血區(qū)面積百分比（An/AAR，%），結(jié)果如圖1G、1H所示。

圖1 各處理組大鼠的心肌梗死面積Fig.1 Infarct size in rats from various groups subjected to MI/RI

由圖1可知，模型組大鼠AAR/LV與假手術(shù)組相比升高，各給藥組大鼠AAR/LV與模型組相比略有下降，但各組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠An/AAR顯著升高（P＜0.05），與模型組相比，Sch B各劑量組大鼠An/AAR呈劑量依賴性顯著或極顯著下降（P＜0.05及P＜0.01）。

2.2 大鼠心肌組織病理學(xué)改變HE染色結(jié)果

圖2 Sch B對(duì)MI/RI大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)改變的影響（HE，×4000）Fig.2 Myocardial histomorphological observations of rats in different groups (HE, × 400)

如圖2所示，光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組大鼠心肌組織未見異常：心肌細(xì)胞排列整齊，形態(tài)正常，核質(zhì)均勻，肌原纖維平行排列；模型組大鼠經(jīng)過心肌缺血再灌注，心肌細(xì)胞腫脹，呈空泡樣病變，肌膜破壞，胞核固縮，肌原纖維松弛斷裂，有大量心肌細(xì)胞壞死，壞死處由炎性細(xì)胞浸潤填充；而Sch B各劑量組大鼠心肌組織病理性改變顯著減輕。

2.3 Sch B對(duì)大鼠血清中CK-MB、LDH、SOD活力及MDA、NO含量的影響

表1 Sch B對(duì)大鼠血清中CK、LDH、SOD活力及MDA、NO含量的影響（x ±s，n＝10）Table 1 Effect of Sch B on CK, LDH, SOD, MDA and NO contents in serum of rats (x± s,n = 10)

由表1可知，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清中CK-MB、LDH活力及MDA含量極顯著升高，而SOD活力及NO水平明顯下降（P＜0.01）；Sch B中、高劑量組大鼠血清中CK-MB、LDH活力及MDA含量較模型組顯著下降，SOD活力及NO水平較模型組顯著升高（P＜0.05）。

2.4 Sch B對(duì)大鼠心臟功能改變的影響

表2 Sch B對(duì)大鼠心臟功能改變的影響(x± s,n = 10)Table 2 Effect of Sch B on myocardial function of rats(x± s,n = 10)

由表2可知，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心臟HR明顯加快，LVDP、+（dP/dt）max和－（dP/dt）max顯著降低（P＜0.05）。與模型組相比，Sch B高劑量組大鼠HR顯著減慢（P＜0.05）；Sch B中、高劑量組大鼠心臟的LVDP和+（dP/dt）max、－（dP/dt）max顯著升高（P＜0.05）。

3 討 論

隨著人們生活水平的提高、生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變及生存壓力的增大，缺血性心臟?。╥schemic heart disease，IHD）的發(fā)病率逐年上升[8-10]。IHD居全球死亡原因的第1位，已成為21世紀(jì)危害人類健康的頭號(hào)殺手，因此，針對(duì)缺血性心臟病的預(yù)防、治療和藥物研發(fā)成為諸多科研工作者研究的方向。心肌缺血再灌注損傷（MI/RI）是在恢復(fù)阻塞的血流如溶栓療法、經(jīng)皮冠脈介入療法、CABG及心臟移植術(shù)后普遍面臨的共同問題，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚無理想的防治藥物[11-13]。本課題組在前期對(duì)北五味子總木脂素抗心肌缺血研究的基礎(chǔ)上，探討了北五味子木脂素中功能活性成分——北五味子乙素（Sch B）對(duì)缺血心肌保護(hù)作用及其機(jī)制[14]，對(duì)開發(fā)具有抗MI/RI作用的保健成分具有一定的理論價(jià)值。

自由基、鈣超載、心肌纖維能量代謝障礙、中性粒細(xì)胞與細(xì)胞凋亡等因素均可能參與MI/RI[15-20]。研究表明，氧自由基（oxygen free radical，OFR）介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化物過度激活是造成MI/RI的關(guān)鍵因素。MI/RI發(fā)生時(shí)，OFR大量釋放，激活應(yīng)激活化的蛋白激酶SR-MAPK，繼而激活下游的蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子，介導(dǎo)一系列生物學(xué)反應(yīng)[21-22]?？寡趸溉鏢OD、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）和過氧化氫酶（catalase，CAT）等能降低OFR濃度，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。當(dāng)抗氧化酶活性下降，自由基清除系統(tǒng)功能降低、生成系統(tǒng)活性增強(qiáng)，恢復(fù)組織血液供應(yīng)和氧供應(yīng)時(shí)，OFR產(chǎn)生量增加，引發(fā)鏈?zhǔn)街|(zhì)過氧化反應(yīng)，損傷細(xì)胞膜、細(xì)胞器乃至細(xì)胞核酸，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、壞死，從而造成心肌細(xì)胞急性或慢性損傷。大量研究表明，OFR如活性氧家族（reactive oxygen system，ROS）能加重缺血冠脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙，降低左心室功能，其可能的機(jī)制為中性粒細(xì)胞誘發(fā)的超氧陰離子（O2－）抑制內(nèi)皮細(xì)胞NO的產(chǎn)生，NO作為一個(gè)潛在的抗炎因子，可抑制黏附分子表達(dá)，且對(duì)缺血后心肌具有正性肌力作用[23-24]。

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)心肌病理學(xué)研究和NBC染色觀察發(fā)現(xiàn)，結(jié)扎LAD制備大鼠心臟MI/RI模型成功，各劑量的Sch B均能夠減輕大鼠MI/RI，降低心肌梗死面積（An/AAR），與模型組相比具有顯著或極顯著差異（P＜0.05或P＜0.01），而AAR/LV雖然有所降低，但與模型組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；預(yù)先使用Sch B處理能夠明顯提高M(jìn)I/RI模型大鼠血清中SOD活性和NO水平，降低MDA含量，改善心肌線粒體中的氧化應(yīng)激水平，提高對(duì)MI/RI大鼠的保護(hù)作用；心肌缺血時(shí)細(xì)胞膜損傷，CK與LDH大量釋放進(jìn)入血液，且CK的釋放與心肌受損程度成一定正比關(guān)系。Sch B能夠明顯降低大鼠血清中LDH、CK-MB活力，與模型組相比有顯著差異（P＜0.05）；Sch B的預(yù)保護(hù)作用也體現(xiàn)在能夠明顯改善大鼠心臟功能，升高LVDP，提升左心室內(nèi)壓正負(fù)變化速率最大值（+（dP/dt）max、－（dP/dt）max）（P＜0.05），保護(hù)大鼠心肌免受缺血再灌注造成的損害。

木脂素是五味子的主要有效成分，包括五味子素、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素，五味子醇甲、五味子醇乙等20余種成分[8]。五味子對(duì)人體具有“益氣、滋腎、斂肺、澀精、生津、止渴、益智、安神”等功效，是一種多功能、多用途的藥食兼用型經(jīng)濟(jì)植物。中國古代醫(yī)鑒《綱目》中記述：“五味子酸咸入肝而補(bǔ)腎，辛苦入心而補(bǔ)肺，甘入中宮益脾胃，五味子入滋補(bǔ)藥，必用北產(chǎn)者（北五味子）及良”。五味子煎湯或入酒，其味苦香，營養(yǎng)甚佳。近10 a來，隨著世界浪潮的興起，從天然植物中尋找新的藥用成分、開發(fā)新藥已成為全球醫(yī)藥界的熱點(diǎn)。本研究進(jìn)一步明確了五味子中活性成分——Sch B具有抗MI/RI作用[25-28]，下一步將從細(xì)胞水平上探索Sch B治療MI/RI的分子機(jī)制及作用的信號(hào)靶點(diǎn)，為將其開發(fā)為新的功能活性保健成分奠定藥理學(xué)基礎(chǔ)。

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Protective Effect of Schisandrin B on Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury in Rats

SUN Hongxia, CHEN Jianguang*
(Pharmaceutical College, Beihua University, Jilin 132013, China)

Objective: To investigate the protective effect of schisandrin B (Sch B) on myocardial ischemia/reperfusion injury (MI/RI) and its underlying mechanism so as to provide theoretical basis for new drug development of traditional Chinese medicine (TCM) with defined activity and high efficiency against myocardial ischemia. Methods: Totally 60 male Wistar rats were randomly divided into six groups: control group, reperfusion injury (MI/RI) group, Sch B 20, 40 and 80 mg/(kg d) dose groups and positive control drug metoprolol group (MET, 2.5 mg/(kg d)). Drug intragastric (ig) administration was continued for three weeks before ischemia-reperfusion injury. General heart change and myocardial pathological change were observed, Evans blue and NBT staining was conducted to determine infarction area, and changes in serum enzymes and cytokines and cardiac function were measured at the end of the experiment. Results: Sch B could significantly alleviate heart damage induced by MI/RI, reduce the infarction area, elevate SOD and NO levels in serum, reduce MDA, CK-MB and LDH contents, improve myocardial function. Conclusion: Sch B has certain protective effects against myocardial ischemia-reperfusion injury in rats, and its mechanism may be related to reducing oxygen free radical release and protecting ischemic myocardium from MI/RI.

schisandrin B; myocardial ischemia/reperfusion injury; oxygen free radicals release

10.7506/spkx1002-6630-201601036

R965.2

A

1002-6630（2016）01-0203-05

孫紅霞, 陳建光. 北五味子乙素對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(1): 203-207.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601036. http://www.spkx.net.cn

SUN Hongxia, CHEN Jianguang. Protective effect of schisandrin B on myocardial ischemia/reperfusion injury in rats[J]. Food Science, 2016, 37(1): 203-207. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601036. http://www.spkx.net.cn

2015-03-26

吉林省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)項(xiàng)目（20142084）

孫紅霞（1965—），女，教授，博士，研究方向?yàn)樾难芩幚韺W(xué)。E-mail：sunhongxiajl@126.com

*通信作者：陳建光（1962—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樾难芩幚韺W(xué)。E-mail：644257703@qq.com