閆敬娜，羅理勇,2，胡雅瓊,3，曾 亮,2,*

茶提取物和納米表沒食子兒茶素沒食子酸酯對6-羥基多巴胺誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞保護(hù)作用

閆敬娜1，羅理勇1,2，胡雅瓊1,3，曾 亮1,2,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.西南大學(xué)茶葉研究所，重慶 400715；3.中國民生銀行黃巖支行，浙江 臺州 318020）

以6-羥基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞系作為帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）體外細(xì)胞模型，探究茶提取物（L-茶氨酸、咖啡堿、茶多酚、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）、茶黃素、茶色素）和兩種納米EGCG對SH-SY5Y細(xì)胞的毒性和對6-OHDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞保護(hù)作用的差異，綜合評價茶提取物治療PD的潛力。結(jié)果表明：茶提取物毒性作用由弱到強為茶多酚＜L-茶氨酸＜茶色素＜咖啡堿＜茶黃素＜EGCG；保護(hù)作用由強到弱為茶黃素＞EGCG＞茶多酚＞茶色素＞咖啡堿＞L-茶氨酸；茶黃素（0.2 μg/mL）和EGCG（0.9 μg/mL）預(yù)處理6-OHDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞，細(xì)胞存活率分別為（99.59±2.24）%和（95.84±2.50）%，保護(hù)作用明顯強于其他茶提取物；相較于EGCG，納米EGCG具有毒性作用更弱和保護(hù)作用更強的特點。由此可知，茶作為一種日常飲品，具有較好地治療PD的潛力。

帕金森??；茶提取物；6-羥基多巴胺；SH-SY5Y細(xì)胞；納米表沒食子兒茶素沒食子酸酯

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是一種慢性進(jìn)行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，是僅次于阿爾茨海默病之后的第二大神經(jīng)系統(tǒng)疾病，患者多為中老年人，尤其是60 歲以上的老人[1]。PD病程較長，致殘率高，臨床表現(xiàn)以靜止性震顫、運動遲緩、肌強直及姿勢平衡障礙為主要特征，還可能出現(xiàn)認(rèn)知功能下降、情緒障礙等非運動癥狀[2]。目前PD的治療手段包括藥物、手術(shù)、細(xì)胞和基因治療[2-3]，其中細(xì)胞和基因治療尚處于實驗階段。手術(shù)治療主要針對中晚期PD患者，采用腦深部電刺激法進(jìn)行治療，但有報道稱這種方法可能產(chǎn)生認(rèn)知功能減退的副作用[3]。藥物治療具有多靶點作用途徑、毒性相對較小、安全性好等潛在優(yōu)勢，因而受到越來越多的重視[4]。PD的治療藥物分為緩解癥狀和神經(jīng)保護(hù)兩大類[3]，其中天然、高效的神經(jīng)保護(hù)性藥物開發(fā)已經(jīng)成為國際PD治療的研究熱點[2]。

茶作為全球風(fēng)靡的飲品之一，其消費量呈逐年增加的趨勢。聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO）的數(shù)據(jù)顯示，2010年全球茶葉消費量為400 萬t，增長率為5.6%；我國作 為世界最大茶葉消費國，2006、2010、2013年茶葉消費量分別為74.48、106、161.32 萬t[5-6]。茶含有豐富的生理活性物質(zhì)，具有多種保健功能，如清除自由基、抗氧化、抗癌、抗誘變和抑菌等[7]。臨床研究表明，飲茶能降低PD的發(fā)病率，對神經(jīng)系統(tǒng)具有保護(hù)作用[8]；相較于其他神經(jīng)保護(hù)性藥物，茶的神經(jīng)保護(hù)作用具有多途徑、多靶點、低毒副作用和協(xié)同功效等優(yōu)點[9]。

現(xiàn)已證實茶葉中的多種生理活性物質(zhì)具有神經(jīng)保護(hù)作用[10-12]，但其神經(jīng)保護(hù)作用之間的差異性鮮見報道。此外，表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）在生物體內(nèi)穩(wěn)定性差、利用率低[13-14]；本實驗室前期研究表明納米EGCG較EGCG具有穩(wěn)定性高、靶向性強、生物利用率高等優(yōu)點[15]。本實驗以6-羥基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞系作為PD體外細(xì)胞模型[16-17]，比較6 種茶提取物（L-茶氨酸、咖啡堿、茶多酚、EGCG、茶黃素、茶色素）和納米EGCG對SH-SY5Y細(xì)胞毒性作用和對6-OHDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞保護(hù)作用的差異，綜合評價茶提取物治療PD的潛力，篩選出高效、低毒副作用的茶葉功能性物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞系 中國科學(xué)院細(xì)胞庫；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、Hank’s平衡鹽溶液（Hank’s balanced salt solution，HBSS） 美國Gibco公司；胰蛋白酶、杜氏磷酸緩沖鹽（phosphate buffered saline，PBS） 美國HyClone公司；4-羥乙基哌嗪乙磺酸（4-(2-hydroxyerhyl) piperazine-1-erhaesulfonic acid，HEPES）、牛胰島素、亞甲基藍(lán)、戊二醛、L-茶氨酸（純度＞98%）、咖啡堿（純度＞98%） 美國Sigma公司；青鏈霉素混合液（雙抗） 北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司；兒茶素（catechin，C）、表兒茶素（epicatechin，EC）、表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，ECG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（(?)-gallocatechingallate，GCG）、茶黃素（theaflavin，TF1）、茶黃素-3-沒食子酸酯（theaflavin-3-gallate，TF-3G）、茶黃素-3’-沒食子酸酯（theaflavin-3’-gallate，TF-3’G）、茶黃素雙沒食子酸酯（theaflavin-3,3’-digallate，TFDG） 成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；茶多酚（純度＞99.5%）、EGCG（純度＞95%）、茶黃素（純度為54.017%，其中TF1含量為8.248%、TF-3G含量為11.438%、TF-3’G含量為5.062%、TFDG含量為29.269%） 長沙華誠生物科技有限公司；殼聚糖（chitosan，CS） 浙江奧興生物技術(shù)有限公司；葉酸（folic acid，F(xiàn)A）、三聚磷酸鈉（sodium tripolyphosphate，TPP） 上海晶純生化科技股份有限公司；甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亞胺丙酸酸酯（methoxypolyethyleneglycol-succinimidyl-propionic acid ester，mPEG-SPA）、NH2-PEG-COOH 嘉興博美生物技術(shù)有限公司；普洱熟茶經(jīng)典系列7572 大益茶業(yè)集團。

納米EGCG（實驗室自制）[18]：以CS、TPP為載體，并以FA和聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）作靶向性修飾，采用離子凝膠技術(shù)制備兩種納米EGCG，即（FA+PEG）-EGCG-NPs-1和（FA+PEG）-EGCG-NPs-2。

茶色素（實驗室自制）：普洱熟茶7572以茶水比1∶20（m/V）的沸水浸提10 min，趁熱過濾，冷卻至室溫。濾液以水-乙醇為洗脫液，過大孔樹脂進(jìn)行梯度洗脫，收集目標(biāo)產(chǎn)物茶色素，冷凍干燥，－80 ℃條件下儲存?zhèn)溆谩＝?jīng)檢測茶色素主要成分包括C（0.98%）、EC（3.31%）、EGC（6.67%）、ECG（0.56%）、EGCG（0.98%）、沒食子酸（43.48%）、咖啡堿（4.86%）、氨基酸（3.12%）、可溶性糖（10.55%）。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FDA超潔凈細(xì)胞實驗工作臺 美國Airtech公司；3111 CO2恒溫培養(yǎng)箱、LEGEND MACH 1.6R離心機、MULTISKAN GO酶標(biāo)儀 美國Thermo Scientific公司；倒置顯微鏡 日本Nikon公司；MX100-4A微孔板振蕩器 杭州奧盛儀器有限公司；PWC124分析天平（0.1 mg級） 上海京工實業(yè)有限公司；TOMY ES-315高壓蒸汽滅菌鍋 上海艾高德生物科技有限公司；85-2A磁力攪拌器 金壇市精達(dá)儀器制造廠；FD-1A-50真空冷凍干燥機 深圳邁瑞醫(yī)療國際股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)[19]

SH-SY5Y細(xì)胞以高糖DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100 μg/mL鏈霉素、100 μg/mL青霉素）為細(xì)胞生長所需的完全培養(yǎng)基，無菌條件下，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d更換一次培養(yǎng)液，每3～5 d傳代一次。

1.3.2 PD體外細(xì)胞模型的建立[20-21]

取對數(shù)生長期SH-SY5Y細(xì)胞接種到96 孔板中，細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)為1×105個/mL，無菌條件下，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8～16 h，至細(xì)胞完全貼壁后，移除培養(yǎng)基。實驗組分別加入100 μL含不同濃度（10、50、100、150、200、300 μmol/L）6-OHDA的完全培養(yǎng)基，空白組僅添加完全培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，采用亞甲基藍(lán)染色法檢測細(xì)胞存活率，并通過倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。

1.3.3 茶提取物和納米EGCG對SH-SY5Y細(xì)胞的毒性作用[20-21]

具體方法同1.3.2節(jié)。實驗組分別加入100 μL不同質(zhì)量濃度的茶提取物，分別為5、18、90、175、350 μg/mL的L-茶氨酸；2、10、20、40、80、200 μg/mL的咖啡堿；0.2、2、10、25、50、100 μg/mL的茶黃素；10、50、100、200、300、500 μg/mL的茶色素；10、50、100、200、500、1000 μg/mL的茶多酚；0.09、0.9、2.3、14、45、70、140 μg/mL的EGCG；（FA+PEG）-EGCG-NPs-1和（FA+PEG）-EGCG-NPs-2載有的EGCG質(zhì)量濃度為0.09、0.9、2.3、14、45、70、140 μg/mL，空白組僅添加完全培養(yǎng)基。采用亞甲基藍(lán)染色法檢測細(xì)胞存活率。當(dāng)細(xì)胞存活率≥90%時說明樣品對細(xì)胞無毒性作用，反之則對細(xì)胞有毒性作用。

1.3.4 茶提取物和納米EGCG對6-OHDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞保護(hù)作用[20-21]

以1×105個/mL濃度接種對數(shù)生長期的SH-SY5Y細(xì)胞于96 孔板中，無菌條件下，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8～16 h，至細(xì)胞完全貼壁后，移除培養(yǎng)基。分為3 組：空白組、對照組和實驗組。實驗組添加100 μL含不同質(zhì)量濃度茶提取物或納米EGCG的完全培養(yǎng)基，空白組和對照組分別添加100 μL完全培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h。培養(yǎng)結(jié)束后，移除培養(yǎng)基，實驗組和對照組添加100 μL含100 μmol/L 6-OHDA的完全培養(yǎng)基，空白組添加100 μL完全培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 h。培養(yǎng)結(jié)束后，采用亞甲基藍(lán)染色法檢測細(xì)胞存活率。

茶提取物的質(zhì)量濃度分別為：5、18、90、175、 350 μg/mL L-茶氨酸；2、10、20、40、80 μg/mL咖啡堿；0.2、2、10、25、50 μg/mL茶黃素；10、50、100、200、300 μg/mL茶色素；10、50、100、200、500 μg/mL茶多酚；0.09、0.9、2.3、14、45、70、140 μg/mL EGCG；（FA+PEG）-EGCG-NPs-1和（FA+PEG）-EGCG-NPs-2載有的EGCG質(zhì)量濃度為0.09、0.9、2.3、14、45、70、140 μg/mL。

1.3.5 亞甲基藍(lán)染色法檢測細(xì)胞存活率[22]

取經(jīng)樣品處理后的 細(xì)胞懸液，移除培養(yǎng)基，并用PBS漂洗。每孔加入50 μL亞甲基藍(lán)溶液（含有0.6%亞甲基藍(lán)和1.25%戊二醛的HBSS），于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h對細(xì)胞進(jìn)行染色。染色完畢后，去除亞甲基藍(lán)溶液，并用超純水漂洗干凈。每孔加入100 μL洗脫液（含有50%乙醇、49% PBS和1%乙酸），室溫條件下將96 孔板放置在水平搖床上保持20 min，至細(xì)胞完全溶解。采用酶標(biāo)儀（570 nm）檢測每孔光密度（OD570nm）值，按照下式計算不同樣品處理后的細(xì)胞存活率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個樣品均設(shè)3 次重復(fù)。表和圖中數(shù)據(jù)均表示為±s，方差分析和差異性分析（P＜0.05）采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行運算，處理間平均值的比較用最小顯著差異法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度6-OHDA對SH-SY5Y細(xì)胞的影響

采用不同濃度6-OHDA誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞24 h，篩選出建立PD體外細(xì)胞模型的最佳6-OHDA誘導(dǎo)濃度。由圖1可知，隨著6-OHDA濃度的增大，SH-SY5Y細(xì)胞存活率降低，且呈明顯的劑量依賴性；經(jīng)計算分析可知IC50為128.95 μmol/L。由圖2可知，空白組（6-OHDA濃度為0 μmol/L）的SH-SY5Y細(xì)胞生長良好，呈扁平多邊形或梭形，細(xì)胞數(shù)量較多；隨著6-OHDA濃度增大，SH-SY5Y細(xì)胞皺縮，呈圓形或橢圓形，細(xì)胞數(shù)量逐漸減少。有文獻(xiàn)報道6-OHDA誘導(dǎo)的PD體外細(xì)胞模型研究中，SH-SY5Y細(xì)胞存活率一般為30%～66%[16,21,23-24]。Guo Shuhong[20]和Tian[21]等在研究過程中采用100 μmol/L 6-OHDA誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞構(gòu)建PD體外研究模型時，其存活率分別為30%、35%；Lopes[16]和王莉莉[25]等在研究過程中分別采用35、15、100 μmol/L 6-OHDA誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞構(gòu)建PD體外研究模型時，其細(xì)胞存活率為50%；Tiong等[23]在研究過程中采用50 μmol/L 6-OHDA誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞構(gòu)建PD體外研究模型時，其細(xì)胞存活率約為58%。本實驗選取了0、10、50、100、150、200、300 μmol/L 6-OHDA誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞24 h，其中100 μmol/L 6-OHDA誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞24 h后細(xì)胞存活率為（59.75±1.32）%（圖1），且細(xì)胞形態(tài)基本正常，呈扁平多邊形或梭形（圖2C）。因此后續(xù)的實驗采用100 μmol/L 6-OHDA誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞構(gòu)建PD體外研究模型。

圖1 不同濃度6-OHDA對SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effect of different concentrations of 6-OHDA on SH-SY5Y cell viability

圖2 不同濃度6-OHDA對SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.2 Morphology of SH-SY5Y cells treated with 6-OHDA

2.2 茶提取物和納米EGCG對SH-SY5Y細(xì)胞的毒性作用

采用不同質(zhì)量濃度的茶提取物和納米EGCG處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h，確定其對SH-SY5Y細(xì)胞無毒性劑量范圍，以此作為SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷保護(hù)劑量范圍。如圖3所示，茶提取物和納米EGCG對SH-SY5Y細(xì)胞的無毒性劑量范圍分別是：L-茶氨酸，0～350 μg/mL；咖啡堿，0～80 μg/mL；茶黃素，0～50 μg/mL；茶色素，0～300 μg/mL；茶多酚，0～500 μg/mL；EGCG，0～45 μg/mL；（FA+PEG）-EGCG-NPs-1和（FA+PEG）-EGCG-NPs-2，0～140 μg/mL。由此可知，茶提取物對SH-SY5Y細(xì)胞的毒性作用由弱到強為茶多酚＜L-茶氨酸＜茶色素＜咖啡堿＜茶黃素＜EGCG；納米EGCG對SH-SY5Y細(xì)胞的毒性作用較EGCG弱。

圖3 茶提取物和納米EGCG對SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響Fig.3 Effect of different tea extracts on SH-SY5Y cell viability

L-茶氨酸是茶葉中特有的一種氨基酸，占茶葉干質(zhì)量的1%～2%[26]。L-茶氨酸具有多種生理功能，如使人情緒穩(wěn)定和注意力集中、提高學(xué)習(xí)和記憶能力、抗疲勞、降血壓、抑制由谷氨酸引起的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元死亡、促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)的成熟、幫助完善大腦功能等[27]。本實驗結(jié)果表明，L-茶氨酸對SH-SY5Y細(xì)胞的無毒性劑量范圍是0～350 μg/mL。van der Pijl等[28]報道人體飲用含100 mg L-茶氨酸的茶，血漿中L-茶氨酸質(zhì)量濃度將在50 min后達(dá)到最大值，為4.4 μg/mL，由此推測，人體血漿中L-茶氨酸質(zhì)量濃度為350 μg/mL，需飲用含7.95 g L-茶氨酸的茶。已有報道顯示，茶氨酸的半數(shù)致死量（LD50）＞5 g/kg（小鼠，18～20 g）[29]和最大耐受劑量為4 g/kg（大鼠，172～226 g）[30]，根據(jù)人與動物間按體表面積折算的等效劑量比值表可知，人體內(nèi)L-茶氨酸半數(shù)致死量和最大耐受劑量分別為37 g和29.7 g，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于本實驗中最大無毒性劑量所需食用的L-茶氨酸量（7.95 g）。此外，我國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會通過2014年15號公告批準(zhǔn)茶葉氨基酸為新食品原料[31]；日本已經(jīng)確認(rèn)L-茶氨酸為安全物質(zhì)，在使用中不作限制用量規(guī)定[27,29]。茶多酚是一類存在于茶樹中的多元酚混合物，其主要成分是兒茶素（約占70%～80%）[26]；經(jīng)檢測本實驗所用茶多酚的主要成分包括EGCG（47.3%）、EC（1.78%）、ECG（11.75%）、EGC（5.15%）、GCG（3.48%）。Guo Shuhong等[20]在研究中發(fā)現(xiàn)，EGCG、ECG、EC均能提高SH-SY5Y細(xì)胞存活率，其中ECG濃度為400 μmol/L（177 μg/mL）時，細(xì)胞存活率達(dá)到170%；本實驗結(jié)果表明，茶多酚對SH-SY5Y細(xì)胞的最大無毒性劑量為500 μg/mL，其內(nèi)含EGCG、ECG的質(zhì)量濃度分別為236.5、58.75 μg/mL；EGCG單獨作用于SH-SY5Y細(xì)胞時，最大無毒性劑量為45 μg/mL。由此推測，茶多酚對SH-SY5Y細(xì)胞的毒性作用弱，是由于EGCG、ECG或其他物質(zhì)的協(xié)同作用減弱了毒性作用。茶色素是從普洱熟茶7572中提取的一種混合物，其主要成分是沒食子酸（43.48%）。Lu Zhongbing等[32]的研究表明，沒食子酸單獨作用于SH-SY5Y細(xì)胞的無毒性劑量范圍為0～150 μmol/L（即0～25.5 μg/mL）。本實驗結(jié)果表明，茶色素對SH-SY5Y細(xì)胞的最大無毒性劑量為300 μg/mL，其內(nèi)含沒食子酸質(zhì)量濃度為130.44 μg/mL，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于沒食子酸單獨作用的無毒性劑量范圍；咖啡堿、EGCG、ECG的質(zhì)量濃度分別為14.58、2.94、1.68 μg/mL，均處于無毒性劑量范圍內(nèi)，且有增大細(xì)胞存活率的趨勢（圖3）。由此推測，茶色素對SH-SY5Y細(xì)胞的毒性作用弱是由于沒食子酸、咖啡堿、EGCG和ECG的協(xié)同作用減弱了毒性作用。

本實驗中，EGCG質(zhì)量濃度為140 μg/mL時，SH-SY5Y細(xì)胞存活率為（59.93±4.30）%，EGCG表現(xiàn)出了明顯的毒性作用；相同EGCG質(zhì)量濃度下，F(xiàn)A和PEG修飾的納米EGCG（FA約為30 μg/mL）對SH-SY5Y細(xì)胞沒有毒性作用。Budni等[33]研究表明，F(xiàn)A單獨作用于SH-SY5Y細(xì)胞的無毒性劑量范圍為1～300 μmol/L（即0～132 μg/mL），且1 μmol/L FA作用于SH-SY5Y細(xì)胞時，細(xì)胞存活率約為110%。張景燕等[34]也曾報道經(jīng)FA處理的SH-SY5Y細(xì)胞存活率是對照組的1.45 倍。由此推測，納米EGCG對SH-SY5Y細(xì)胞的毒性作用較EGCG弱，是因為FA和EGCG的協(xié)同作用減弱了毒性作用。為了在相同EGCG質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，比較EGCG與納米EGCG對6-OHDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞保護(hù)作用的差異，在后續(xù)實驗中EGCG與納米EGCG的劑量均采用0～140 μg/mL。

2.3 茶提取物和納米EGCG對6-OHDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用

采用不同質(zhì)量濃度的茶提取物和納米EGCG處理SH-SY5Y細(xì)胞3 h，再經(jīng)6-OHDA 誘導(dǎo)3 h，評價茶提取物和納米EGCG對6-OHDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞保護(hù)作用。由圖4可知，經(jīng)茶提取物或納米EGCG預(yù)處理的SH-SY5Y細(xì)胞存活率顯著高于對照組的SH-SY5Y細(xì)胞存活率，表明茶提取物和納米EGCG對6-OHDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用，可顯著抑制6-OHDA對SH-SY5Y細(xì)胞的毒性作用。隨著茶提取物質(zhì)量濃度的增大，SH-SY5Y細(xì)胞存活率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，并未表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。當(dāng)?shù)陀诩?xì)胞存活率最大值對應(yīng)的質(zhì)量濃度時，茶提取物或納米EGCG對SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用隨著質(zhì)量濃度的增大而增強；高于此質(zhì)量濃度時，保護(hù)作用隨著質(zhì)量濃度的增大而減弱。已有的神經(jīng)保護(hù)性藥物研究如鉤藤提取物[35]、黃苓素[36]、槲皮素[37]、側(cè)柏乙醇提取物[24]也有相似的趨勢。由圖4可知，茶黃素 質(zhì)量濃度為50 μg/mL和EGCG質(zhì)量濃度＞70 μg/mL時，SH-SY5Y細(xì)胞存活率等于或者小于對照組的SH-SY 5Y細(xì)胞存活率， 說明高于 一定質(zhì)量濃度，茶提取物或納米EGCG會加重6-OHDA對SH-SY5Y細(xì)胞的毒性作用。王莉莉等[25]在研究中也發(fā)現(xiàn)，高濃度EGCG（20～400 μmol/L）加重了6-OHDA對SH-SY5Y細(xì)胞的損害作用，導(dǎo)致細(xì)胞存活率（對照組15.3%～21.4%）下降。

圖4 茶提取物和納米EGCG對6-OHDA誘導(dǎo)的SH-SYY55YY細(xì)胞存活率的影響Fig.4 Effect of different tea extracts on 6-OHDA-induced SH-SY5Y cell viability

由圖4可知，不同茶提取物和納米EGCG預(yù)處理6-OHDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞，其細(xì)胞存活率最大值不同，分別表現(xiàn)為：L-茶氨酸質(zhì)量濃度為350 μg/mL時，SH-SY5Y細(xì)胞存活率為（86.38±3.17）%；咖啡堿質(zhì)量濃度為40 μg/mL時，SH-SY5Y細(xì)胞存活率為（86.78±2.04）%；茶黃素質(zhì)量濃度為0.2 μg/mL時，SH-SY5Y細(xì)胞存活率為（99.59±2.24）%；茶色素質(zhì)量濃度為200 μg/mL時，SH-SY5Y細(xì)胞存活率為（92.92±2.47）%；茶多酚質(zhì)量濃度為100 μg/mL時，SH-SY5Y細(xì)胞存活率為（94.92±2.76）%；EGCG質(zhì)量濃度為0.9 μg/mL時，SH-SY5Y細(xì)胞存活率為（95.84±2.50）%；（FA+PEG）-EGCG-NPs-1質(zhì)量濃度為0.9 μg/mL時，SH-SY5Y細(xì)胞存活率為（103.40±2.16）%；（FA+PEG）-EGCG-NPs-2質(zhì)量濃度為2.5 μg/mL時，SH-SY5Y細(xì)胞存活率為（104.17±4.30）%。由此可知，茶提取物對6-OHDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞保護(hù)作用由強到弱為：茶黃素＞EGCG＞茶多酚＞茶色素＞咖啡堿＞L-茶氨酸；納米EGCG和EGCG對6-OHDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用由強到弱為（FA+PEG）-EGCG-NPs-2≥（FA+PEG）-EGCG-NPs-1＞EGCG。Owen等[38]的研究表明，L-茶氨酸和咖啡堿的共同作用有利于改善人的認(rèn)知能力；Horie等[39]也曾報道，EC和EGCG的協(xié)同作用能夠誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞株MKN-45細(xì)胞的凋亡。由此推測，茶對SH-SY5Y細(xì)胞以及神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用是多種茶提取物協(xié)同作用的結(jié)果。

已研究的神經(jīng)保護(hù)性藥物如鉤藤提取物[35]、黃芩素[36]、槲皮素[37]和側(cè)柏乙醇提取物[24]預(yù)處理6-OHDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞，細(xì)胞存活率最大值分別為79%、82%、80%、82%，其所對應(yīng)的藥物質(zhì)量濃度分別為200、3.4、15.1、10 μg/mL。本實驗中，茶提取物預(yù)處理6-OHDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞，其細(xì)胞存活率最大值可達(dá)（86.38±3.17）%～（99.59±2.24）%，表明茶提取物對6-OHDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用較強；且達(dá)到細(xì)胞存活率最大值對應(yīng)的茶黃素質(zhì)量濃度（0.2 μg/mL）和EGCG質(zhì)量濃度（0.9 μg/mL）遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他茶提取物和神經(jīng)保護(hù)藥物的質(zhì)量濃度，說明茶黃素和EGCG具有較強的神經(jīng)保護(hù)作用。此外，茶黃素和EGCG是茶葉中常見且量大的功能性成分，可以通過飲茶的方式快速、便捷獲取這些茶葉活性物質(zhì)。

本實驗中，納米EGCG實驗組SH-SY5Y細(xì)胞存活率最大值略高于EGCG實驗組，而且在高質(zhì)量濃度下，納米EGCG實驗組SH-SY5Y細(xì)胞存活率下降速率較EGCG實驗組慢，這可能與FA對SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用有關(guān)[33-34]，F(xiàn)A與EGCG的協(xié)同作用使納米EGCG較EGCG具有更強的保護(hù)作用。本實驗室在研究不同修飾納米EGCG對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的影響中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A的靶向性作用增強了納米EGCG的抗增殖能力，F(xiàn)A和PEG的協(xié)同作用促進(jìn)了納米EGCG的抗腫瘤屬性[18]。由此推測，F(xiàn)A的靶向性作用、FA和PEG的協(xié)同作用也是導(dǎo)致納米EGCG較EGCG具有更強神經(jīng)保護(hù)作用的原因。由圖4可知，兩種納米EGCG對6-OHDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞保護(hù)作用也有差異。SH-SY5Y細(xì)胞存活率達(dá)到最大值時，（FA+PEG）-EGCG-NPs-1和（FA+PEG）-EGCG-NPs-2的質(zhì)量濃度分別為0.9 μg/mL和2.5 μg/mL，這可能是兩種納米EGCG的制備方式不同導(dǎo)致的。（FA+PEG）-EGCG-NPs-1的制備是采用離子交聯(lián)法形成EGCG-NPs，將FA和PEG枝接到EGCG-NPs上；（FA+PEG）-EGCG-NPs-2的制備是將FA和PEG枝接到殼聚糖上形成FA-PEG-CS，再采用離子交聯(lián)法使FA-PEG-CS與TPP、EGCG形成（FA+PEG）-EGCG-NPs-2[18]。

3 結(jié) 論

SH-SY5Y細(xì)胞是一種分化程度較低的腫瘤細(xì)胞，與正常神經(jīng)細(xì)胞具有相似的細(xì)胞形態(tài)和生理生化特征，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)病機制和藥物篩選研究[40]。6-OHDA是神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺的羥基化衍生物，作用于多巴胺能神經(jīng)元導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞變性、死亡，黑質(zhì)-紋狀體多巴胺系統(tǒng)功能減退，產(chǎn)生類似帕金森病的癥狀[40]。6-OHDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞是較成熟的PD體外細(xì)胞模型[16-17]。本實驗中采用100 μmol/L 6-OHDA誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞制備PD體外細(xì)胞模型，細(xì)胞存活率為（59.75±1.32）%，細(xì)胞形態(tài)基本正常，呈扁平多邊形或梭形。

研究表明，低質(zhì)量濃度茶提取物對SH-SY5Y細(xì)胞沒有毒性作用； 高質(zhì)量濃度茶提取物對SH-SY5Y細(xì)胞表現(xiàn)出毒性作用。在茶提取物對SH-SY5Y細(xì)胞無毒性劑量范圍內(nèi)，研究茶提取物對6-OHDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)茶黃素對6-OHDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞保護(hù)作用最強，其次為EGCG、茶多酚、茶色素、咖啡堿、L-茶氨酸。低質(zhì)量濃度EGCG和茶黃素預(yù)處理6-OHDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞，細(xì)胞存活率≥95%，其保護(hù)作用明顯強于其他茶提取物及已研究的神經(jīng)保護(hù)性藥物[24,35-36]，表明EGCG和茶黃素具有較好的治療PD潛力。EGCG是綠茶的主要成分，約占綠茶干質(zhì)量的9%～13%；茶黃素是紅茶的主要成分，約占紅茶干質(zhì)量的1%～3%[26]，由此可推斷常飲綠茶和紅茶對神經(jīng)保護(hù)有一定的功效。茶作為三大無醇飲料之一，在中國產(chǎn)量大、價格較低，且是一種方便快捷、易獲得的飲品，這為以茶為原材料的神經(jīng)保護(hù)功能食品的開發(fā)提供了便利性。

本實驗中經(jīng)FA和PEG修飾的納米EGCG較EGCG具有較低的細(xì)胞毒性和更好的細(xì)胞保護(hù)作用。已有的研究表明，納米EGCG較EGCG具有生物活性高、生物利用率高和細(xì)胞內(nèi)靶向性強等優(yōu)點[15]。納米EGCG為高效低毒副作用的神經(jīng)保護(hù)性藥物開發(fā)提供了新途徑，但將其應(yīng)用于動物實驗或臨床實驗的效果還需要進(jìn)一步探究。茶黃素是一類具有苯并卓酚酮結(jié)構(gòu)的化合物的總稱[26]，但各茶黃素單體對6-OHDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用和協(xié)同作用尚待研究。不同茶提取物對6-OHDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞具有不同程度的保護(hù)作用，且不同的茶類中所富含的這些功能成分（茶提取物）含量不同，因此在后續(xù)實驗中還將研究不同的茶類對6-OHDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞保護(hù)作用，為茶在神經(jīng)保護(hù)作用方面的進(jìn)一步開發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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Protective Effects of Tea Extracts and Nano-EGCG against 6-OHDA-Induced Cell Injury in SH-SY5Y Cells

YAN Jingna1, LUO Liyong1,2, HU Yaqiong1,3, ZENG Liang1,2,*
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. Tea Research Institute, Southwest University, Chongqing 400715, China; 3. Huangyan Branch of China Minsheng Bank, Taizhou 318020, China)

Human neuroblastoma cell line SH-SY5Y challenged with 6-hydroxydopamine (6-OHDA) was used as an in vitro model of Parkinson’s disease (PD), and the cytotoxicity of tea extracts including L-theanine, caffeine, tea polyphenol, epigallocatechin-3-gallate (EGCG), theaflavins, tea pigment, and two kinds of nano-EGCG on SH-SY5Y cells were investigated, and their protective effects on 6-OHDA-induced SH-SY5Y cells were compared to evaluate their potentials for the treatment of PD. The results showed that the cytotoxicity was in the following order: tea polyphenol ＜ L-theanine ＜tea pigment ＜ caffeine ＜ theaflavins ＜ EGCG; the protective effects were in the following order: theaflavins ＞ EGCG ＞ tea polyphenol ＞ tea pigment ＞ caffeine ＞ L-theanine. Theaflavins (0.2 μg/mL) and EGCG (0.9 μg/mL) were more effective than other tea extracts in preventing SH-SY5Y cells from 6-OHDA-induced damage, restoring cell viability to (99.59 ± 2.24)% and (95.84 ± 2.50)%, respectively. Compared to EGCG, nano-EGCG had weaker cytotoxicity and stronger protective effect. Based on our results, tea, as a natural daily drink, has better potential for the treatment of PD.

Parkinson’s disease (PD); tea extracts; 6-hydroxydopamine (6-OHDA); SH-SY5Y cell; nano-epigallocatechin-3-gallate

10.7506/spkx1002-6630-201601029

TS218

A

1002-6630（2016）01-0163-08

閆敬娜, 羅理勇, 胡雅瓊, 等. 茶提取物和納米表沒食子兒茶素沒食子酸酯對6-羥基多巴胺誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞保護(hù)作用[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(1): 163-170. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601029. http:// www.spkx.net.cn

YAN Jingna, LUO Liyong, HU Yaqiong, et al. Protective effects of tea extracts and nano-EGCG against 6-OHDA-induced cell injury in SH-SY5Y cells[J]. Food Science, 2016, 37(1): 163-170. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx10 02-6630-201601029. http://www.spkx.net.cn

2015-05-28

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（31100500）；重慶市科委自然科學(xué)基金計劃項目（CSTC,2013jcyjA80021）；

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金項目（XDJK2013B036）

閆敬娜（1988—），女，碩士研究生，主要從事茶資源綜合利用研究。E-mail：308703119@qq.com

*通信作者：曾亮（1980—），女，副教授，博士，主要從事茶資源綜合利用研究。E-mail：zengliangbaby@126.com