張 輝，齊寶坤，李 楊，隋曉楠，王中江，江連洲,*

酶法制取大豆油脂過程中的蛋白酶解動力學(xué)

張 輝1，齊寶坤2，李 楊2，隋曉楠2，王中江2，江連洲2,*

（1.科技部中國農(nóng)村技術(shù)開發(fā)中心，北京 100045；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

通過數(shù)學(xué)方法推導(dǎo)和對Alcalase堿性蛋白酶酶解大豆中蛋白實驗的系統(tǒng)研究，得到Alcalase堿性蛋白酶酶解大豆中蛋白的動力學(xué)模型為：R＝（18.294 0E0+0.273 4ρ0）exp（－0.256 2DH），式中：E0為初始蛋白酶質(zhì)量濃度，ρ0為初始底物質(zhì)量濃度，DH為水解度。通過數(shù)學(xué)推導(dǎo)和對大豆蛋白酶解反應(yīng)過程中Alcalase堿性蛋白酶失活的系統(tǒng)研究，得到膨化大豆蛋白的酶解反應(yīng)過程中Alcalase堿性蛋白酶失活的動力學(xué)常數(shù)K＝4.920 4 min－1。通過擬合實驗證明，建立的動力學(xué)模型與實驗結(jié)果具有較好的擬合效果，證明所建立的動力學(xué)模型具有較高的實際應(yīng)用價值。

大豆；酶法制油；蛋白酶解；酶解動力學(xué)

酶法提油是在機械破碎的基礎(chǔ)上，采用蛋白酶作用于油料，使油脂易于從油料固體中釋出，利用非油成分（蛋白質(zhì)和碳水化合物）對油和水的親和力差異，同時利用油水比重不同而將油和非油成分分離，主要分為預(yù)處理、酶解蛋白、離心分離幾個步驟，其中蛋白質(zhì)的酶解程度對油脂釋放有顯著影響[1-2]。

蛋白質(zhì)的酶解是一個復(fù)雜的過程[3-4]，蛋白質(zhì)所含的肽鍵種類不同，蛋白酶對不同肽鍵的酶解作用強弱也不一樣，這都會導(dǎo)致有時很難對蛋白質(zhì)酶解過程進行控制。因此，從反應(yīng)機理出發(fā)，推導(dǎo)描述蛋白質(zhì)酶法酶解過程規(guī)律的動力學(xué)關(guān)系式，計算酶動力學(xué)參數(shù)，建立符合實驗數(shù)據(jù)的實驗?zāi)Ｐ?，對于深入理解蛋白質(zhì)酶解過程有著實際意義[5-6]。

一個能夠全面反映酶解過程的高分子底物酶解動力學(xué)模型的建立需要大量數(shù)據(jù)、推導(dǎo)、運算以及反復(fù)的驗證[7-9]。針對這個問題Marquez等[10]認為，對于機理相同的酶解反應(yīng)，前人建立的模型可以被用來與實際數(shù)據(jù)結(jié)合，構(gòu)建酶解過程動力學(xué)曲線，進而獲得酶解過程中的一些信息。近年來，國內(nèi)外已經(jīng)開展了蛋白酶解動力學(xué)研究，如王巖等[11]對Alcalase酶解大豆蛋白工藝與動力學(xué)進行了研究，郭城等[12]對Alcalase酶解棉籽蛋白工藝與動力學(xué)進行了研究，Kilic-apar等[13]建立了Alcalase酶解芝麻餅粕蛋白動力學(xué)模型，吳建中等[14]研究了Protamex蛋白酶酶解大豆蛋白的機理及動力學(xué)，章紹兵等[15]對花生乳化體系中蛋白質(zhì)的酶解動力學(xué)進行研究，確定了模型，此外翟愛華等[16]研究了堿性蛋白酶酶解米糠蛋白動力學(xué)特性。但是現(xiàn)有研究均沒有以大豆酶法制油混合體系為研究對象。

基于前面的研究發(fā)現(xiàn)，利用堿性蛋白酶酶解膨化全脂大豆是一種同時提取大豆油脂、蛋白質(zhì)、多肽以及副產(chǎn)物——水溶性糖的方法。擠壓膨化后的大豆細胞壁受到破壞，更有利于油脂釋放，在高溫、高壓、高剪切作用下使蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生伸展、重組，分子表面的電荷重新分布，分子間氫鍵、二硫鍵部分斷裂，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，蛋白質(zhì)的消化率明顯提高，通過增加表面積和蛋白變性，從而更有利于酶對大豆蛋白酶解[17-20]。本實驗重點對膨化后大豆的酶解動力學(xué)進行研究，目的是建立膨化大豆的酶解動力學(xué)模型，更加準確地控制膨化大豆的酶法提取工藝，獲取蛋白酶失活的動力學(xué)常數(shù)，對蛋白酶的重復(fù)使用有著重要意義，促進了膨化大豆的酶法提取技術(shù)的推廣與應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆，黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)院培植的墾農(nóng)42，其中蛋白質(zhì)含量為41.6%，油脂含量為2 1.3%，含水率為10.6%，灰分含量為4.3%；Alcalase堿性內(nèi)切蛋白酶（酶活力1.2×105U/mL）丹麥諾和諾德公司。

1.2 方法

1.2.1 酶解過程

原料大豆粉碎后，經(jīng)擠壓膨化處理后，粉碎過篩得到膨化大豆粉，放入4 ℃冰箱中備用。準確稱量一定質(zhì)量膨化大豆粉放入四頸瓶中，按照1∶6（m/V）的比例加入水，攪拌混合均勻后，在60 ℃的水浴鍋中保持恒溫，用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)大豆水溶液的pH值至9.0并保持。依據(jù)所用酶的活力，準確量取所需的蛋白酶加入大豆水溶液中，使酶在攪拌條件下酶解大豆粉。酶解后，測定其水解度（degree of hydrolysis，DH）[21]。

1.2.2 酶活力測定

采用Folin-酚法[22]。

1.2.3 DH的測定

采用pH-stat法[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解動力學(xué)模型的推導(dǎo)

蛋白質(zhì)酶法酶解反應(yīng)符合雙底物順序反應(yīng)機理[24]，由以下幾步反應(yīng)過程組成。

式中：ρ0為初始底物質(zhì)量濃度/（g/L）；E0為加酶量/（mL/L）；K2為酶解反應(yīng)速率常數(shù)/min－1；Kd為酶失活反應(yīng)速率常數(shù)/min－1；Km為米氏常數(shù)。

根據(jù)前人研究結(jié)果[7]，蛋白質(zhì)單酶酶解過程的動力學(xué)模型為：

式中：a、b為動力學(xué)方程形式參數(shù)。

由方程（1）和方程（2）可知：

所以最終由方程（2）和（3）、（4）得到蛋白質(zhì)單酶酶解過程的動力學(xué)模型為：

式中：R為酶解速率/（mol/（L·min））。

由方程（3）可知，a的大小與酶解體系初始底物質(zhì)量濃度和加酶量有關(guān)，隨著初始底物質(zhì)量濃度的上升而減小，隨著加酶量的上升而增大；由于K2與酶解溫度有關(guān)，因此，a的大小也隨著酶解溫度的變化而變化。由方程（4）可知，b的大小與初始底物質(zhì)量濃度和加酶量無關(guān)，但與酶解溫度的高低有關(guān)。在恒溫酶解反應(yīng)中，b的大小應(yīng)為一個常數(shù)；a的大小只與酶解體系初始底物質(zhì)量濃度和加酶量有關(guān)。由方程（5）可知，a值越大，反應(yīng)速率越大，當(dāng)a小于0時，R為負，酶解反應(yīng)無法進行。

2.2 酶解動力學(xué)模型的建立

表1 酶解動力學(xué)模型研究的實驗設(shè)計Table 1 Experimental design and arrangement

固定底物質(zhì)量濃度為70 g/L，在不同加酶量條件下，考察酶解過程中DH的變化規(guī)律。固定加酶量為3 mL/L，在不同底物質(zhì)量濃度條件下，考察酶解過程中DH的變化規(guī)律。最終通過實驗建立膨化大豆的酶解動力學(xué)模型，獲得相關(guān)動力學(xué)參數(shù)。具體實驗設(shè)計見表1，DH的計算結(jié)果見表2。

表2 不同加酶量和底物質(zhì)量濃度條件下水解度與酶解時間的關(guān)系Table 2 Relationship of hydrolysis degree and hydrolysis time at different enzyme dosages and substrate concentrations

2.3 Alcalase堿性蛋白酶酶解大豆中蛋白動力學(xué)模型參數(shù)的推導(dǎo)

采用非線性回歸模型對不同底物質(zhì)量濃度以及不同加酶量的14 組數(shù)據(jù)進行擬合，并由此推導(dǎo)Alcalase堿性蛋白酶酶解膨化大豆中蛋白的動力學(xué)模型參數(shù)。根據(jù)可行性實驗數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，采用Logarithm模型擬合效果比較好，酶解過程的擬合結(jié)果見表3。

表3 酶解過程的擬合結(jié)果Table 3 Fitting results of enzymatic hydrolysis curves

Logarithm模型表示為：

微分后可得：

由表3和圖1結(jié)果、方程（8）和（9）可得到Alcalase堿性蛋白酶酶解膨化大豆中蛋白過程中底物不同初始質(zhì)量濃度和蛋白酶初始質(zhì)量濃度所對應(yīng)的動力學(xué)參數(shù)a與b的大小，結(jié)果見表4。

表4 酶解動力學(xué)參數(shù)Table 4 Dynamic parameters of enzymatic hydrolysis

由表4酶解動力學(xué)參數(shù)的結(jié)果可以看出，動力學(xué)參數(shù)a隨著初始底物質(zhì)量濃度的增加而減小，隨著加酶量的增加而增大。動力學(xué)參數(shù)b在不同的初始底物質(zhì)量濃度和加酶量條件下，其數(shù)值相互差異不大，且接近一個常數(shù)，在其平均值0.256 2附近上下波動，因此在一個恒溫酶解反應(yīng)中，b可以近似看作一個常數(shù)，這與相關(guān)文獻[25]所述和模型推導(dǎo)所得結(jié)論一致。

從方程（3）和表4酶解動力學(xué)參數(shù)的結(jié)果可知，在恒溫酶解反應(yīng)中，動力學(xué)參數(shù)a跟加酶量和初始底物質(zhì)量濃度的比值（）成線性關(guān)系。因此，從表4酶解動力0學(xué)參數(shù)的結(jié)果取出相關(guān)數(shù)據(jù)進行線性擬合，得到a值與值的關(guān)系線性方程為：

對比方程（3）與（11），可得到：

將a值與b值代入方程（5），可得到Alcalase堿性蛋白酶酶解膨化大豆中蛋白的動力學(xué)模型為：

由方程（13）可知，Alcalase堿性蛋白酶酶解膨化大豆中蛋白的反應(yīng)速率與底物質(zhì)量濃度和加酶量均有關(guān)，并且隨底物質(zhì)量濃度和加酶量的增加而增加。隨著反應(yīng)的進行，反應(yīng)速率隨水解度的增加而降低。在加酶量3 mL/L和底物質(zhì)量濃度70 g/L條件下測得不同酶解時間的DH數(shù)據(jù)代入方程（11），得到酶解時間t與酶解速率R的擬合曲線見圖1。

圖1 酶解過程中反應(yīng)速率的變化Fig.1 Reaction rate curve of enzymatic hydrolysis

由圖1酶解過程中反應(yīng)速率的變化可以看出，隨著酶解反應(yīng)的進行酶解速率不斷下降，酶解270 min時反應(yīng)速率為0.683 mol/（L·min）左右，反應(yīng)已經(jīng)進行的非常緩慢，所以終止反應(yīng)進行。酶解到210 min時反應(yīng)速率為0.94mol/（L·min）左右，反應(yīng)速率低于1mol/（L·min），而此時的酶法提取油脂、蛋白和多肽得率均已經(jīng)達到極大值，這與前面研究確定的響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果相符。

2.4 Alcalase堿性蛋白酶酶解大豆中蛋白失活常數(shù)的推導(dǎo)

式中：K4為膨化大豆蛋白的酶解反應(yīng)過程中Alcalase堿性蛋白酶失活常數(shù)/min－1。

把方程（3）與（4）相乘，并與方程（14）合并則可得：

經(jīng)擬合，ab值與E0/ρ0的線性關(guān)系方程為：

根據(jù)方程（14）、（15）可得，膨化大豆蛋白的酶解反應(yīng)過程中Alcalase堿性蛋白酶失活的動力學(xué)常數(shù)K4=4.920 4 min－1。

2.5 酶解動力學(xué)模型的驗證

將酶解動力學(xué)模型的計算結(jié)果與實際酶解結(jié)果進行對比，可以驗證動力學(xué)模型的實際應(yīng)用意義。因此在一定酶解條件下，多次測定體系水解度曲線與相對應(yīng)的動力學(xué)模型計算酶解速率R，計算各R值的標準偏差見圖2。模型擬合情況較好，絕大多數(shù)標準誤差小于5%，因此建立的動力學(xué)模型具有較高的實用價值。

圖2 不同酶解時間酶解速率的標準誤差Fig.2 Standard error of hydrolysis rate at different hydrolysis times

3 結(jié)論與討論

通過數(shù)學(xué)方法推導(dǎo)和對Alcalase堿性蛋白酶酶解大豆中蛋白實驗的系統(tǒng)研究，得到Alcalase堿性蛋白酶酶解大豆中蛋白的動力學(xué)模型為：R=（18.294 0E0+ 0.273 4ρ0）exp（－0.256 2DH）。

通過數(shù)學(xué)推導(dǎo)和對膨化大豆蛋白的酶解反應(yīng)過程中Alcalase堿性蛋白酶失活的系統(tǒng)研究，得到大豆蛋白的酶解反應(yīng)過程中Alcalase堿性蛋白酶失活的動力學(xué)常數(shù)K= 4.920 4 min－1。

通過擬合實驗證明，建立的動力學(xué)模型與實驗結(jié)果具有較好的擬合效果，證明所建立的動力學(xué)模型具有較高的實際應(yīng)用價值。在日后工業(yè)化生產(chǎn)中，可以更加準確地控制擠壓膨化后大豆的水酶法提取過程，促進擠壓膨化大豆水酶法提取技術(shù)的推廣與應(yīng)用。

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Kinetics of Protein Hydrolysis during Aqueous Enzymatic Extraction of Soybean Oil

ZHANG Hui1, QI Baokun2, LI Yang2, SUI Xiaonan2, WANG Zhongjiang2, JIANG Lianzhou2,*
(1. China Rural Technology Development Center, Ministry of Science and Technology of China, Beijing 100045, China; 2. College of Food Science, Northeast Agri cultural Uni versity, Harbin 150030, China)

The hydrolysis of extruded full-fat soybean flakes by alkaline protease provides a promising method to extract soybean oil, protein and polypeptide simultaneously. In order to control the enzyme-assisted aqueous extraction of oil from full-fat soybean flakes, it is necessary to model the kinetics of the protein hydrolysis of extruded full-fat soybean flakes and establish the relevant kinetic parameters. In this research, we developed a kinetic mathematical model for the alcalase hydrolysis of full-fat soybean flakes as follows: R =（18.294 0E0+ 0.273 4ρ0) exp(-0.256 2DH), where E0is the initial concentration of alcalase, ρ0is initial substrate concentration, and DH is degree of hydrolysis. The kinetic constant (K) of the inactivation of alcalase during the hydrolysis process was determined to be 4.920 4 min-1. Our experimental data were well fitted to the proposed kinetic model, proving that the mode has a high practical value.

soybean; enzyme-assisted aqueous extraction of soybean oil; protein hydrolysis; enzymatic hydrolysis kinetics

10.7506/spkx1002-6630-201601026

TS221

A

1002-6630（2016）01-0145-05

張輝, 齊寶坤, 李楊, 等. 酶法制取大豆油脂過程中的蛋白酶解動力學(xué)[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(1): 145-149. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201601026. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Hui, QI Baokun, LI Yang, et al. Kinetics of protein hydrolysis during aqueous enzymatic extraction of soybean oil[J]. Food Science, 2016, 37(1): 145-149. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601026. http://www.spkx.net.cn

2015-02-25

張輝（1981—），男，副研究員，博士，研究方向為科技管理和食品戰(zhàn)略。E-mail：zhanghui@yeah.net

*通信作者：江連洲（1960—），男，教授，博士，研究方向為糧食、油脂及植物蛋白工程。E-mail：jlzname@yeah.net