胡玲玲，李春陽*，曾曉雄，吳建蘇

富硒發(fā)芽糙米蛋白的抗氧化活性

胡玲玲1,2，李春陽1,*，曾曉雄2，吳建蘇3

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；3.南京遠(yuǎn)望富硒農(nóng)產(chǎn)品有限責(zé)任公司，江蘇 南京 211500）

采用堿提酸沉法提取了糙米和富硒發(fā)芽糙米中的蛋白，對其抗氧化活性進(jìn)行分析測定，并與對照品蘆丁和VC進(jìn)行了比較。結(jié)果表明：富硒發(fā)芽糙米蛋白的總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率、超氧陰離子自由基（O2－·）清除率和還原力低于蘆丁和VC，氧化自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）顯著低于蘆丁（P＜0.05），但是顯著高于糙米蛋白（P＜0.05）；富硒發(fā)芽糙米蛋白的羥自由基（·OH）清除能力與蘆丁和VC相當(dāng)，但顯著高于糙米蛋白（P＜0.05）。富硒發(fā)芽后的糙米蛋白抗氧化能力顯著提高。

富硒發(fā)芽糙米；蛋白；抗氧化；清除自由基

http://www.spkx.net.cn

人體在利用氧的過程中會產(chǎn)生一些活性氧和自由基，這些活性氧和自由基一旦過剩，就會損傷細(xì)胞，進(jìn)而使器官組織受損，引發(fā)疾病[1]。盡管所有生物體內(nèi)都具有內(nèi)源性的抗氧化防御和修復(fù)系統(tǒng)，能在一定程度上抵抗機體的氧化，但是不足以徹底阻止機體氧化帶來的損害，因此需要依靠攝入外源的抗氧化食品來抵御[2-3]。

硒是人體必需的微量元素[4-5]，目前認(rèn)為生物體內(nèi)發(fā)揮生理功能的硒形態(tài)主要是以硒代半胱氨酸為活性中心的硒蛋白，其具有抗氧化、清除自由基等作用[6-7]。如果機體缺硒，則體內(nèi)硒蛋白的生物活性下降，產(chǎn)生自由基，引發(fā)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜發(fā)生氧化，細(xì)胞受損，誘發(fā)疾病。Molan等[8]比較了富硒綠茶與普通綠茶的抗氧化活性，結(jié)果顯示富硒綠茶的還原力、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的清除能力顯著高于普通綠茶。此外有研究顯示，用富硒大蒜喂養(yǎng)小鼠增強了小鼠的抗疲勞性[9]。研究表明，通過膳食攝入硒（1 mg/d）能顯著提高機體的免疫能力，因此硒對機體生理是重要的也是必需的[10-11]。糙米在生長發(fā)芽過程中，通過自身代謝作用，可以吸收無機硒轉(zhuǎn)化為有機硒，從而顯著提高自身的抗氧化能力。此外發(fā)芽也增加了糙米中的一些營養(yǎng)成分，特別是γ-氨基丁酸、谷胱甘肽、肌醇磷酸等活性物質(zhì)，提高了富硒發(fā)芽糙米的營養(yǎng)活性[12-14]。

本實驗采用堿法提取糙米和富硒發(fā)芽糙米中的蛋白，從總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、DPPH自由基清除率、羥自由基（·OH）清除率等方面比較了富硒發(fā)芽糙米蛋白和糙米蛋白的體外抗氧化活性，以期為富硒發(fā)芽糙米產(chǎn)品的開發(fā)、生產(chǎn)以及市場拓展提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糙米，購于南京遠(yuǎn)望米業(yè)有限公司；富硒發(fā)芽糙米，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所實驗室制備（硒含量0.870 mg/kg）。

硒標(biāo)準(zhǔn)儲備液（100 μg/mL） 核工業(yè)北京化工冶金研究院；DPPH 美國Sigma公司；鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、無水乙醇 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；熒光素鈉、2,2’-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽（2,2’-azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride，AAPH）標(biāo)準(zhǔn)品 阿拉丁試劑有限公司；總抗氧化能力檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品 上海源葉有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TriStar LB 941微孔板式多功能分析儀 德國Berthold Technologies公司；752S紫外-可見分光光度計上海棱光技術(shù)有限公司；PHS-2C數(shù)顯pH計 上海儀器儀表有限公司；Eyela FDU-1200冷凍干燥機 東京理化器械株式會社；PF6-2原子熒光分光光度計 北京普析通用儀器責(zé)任有限公司。

1.3 方法

1.3.1 糙米蛋白的制備

1.3.1.1 蛋白質(zhì)的提取

將富硒發(fā)芽糙米和糙米粉碎，過100 目篩，按照1∶5（m/V）的比例加入正己烷，室溫下攪拌脫脂4 h，通風(fēng)干燥12 h。稱取10 g脫脂富硒發(fā)芽糙米粉[16]和糙米粉，加入200 mL 0.1 mol/L的NaOH溶液在40 ℃條件下恒溫攪拌3 h，提取結(jié)束后在4 000 r/min條件下離心15 min，收集上清液，沉淀中再加200 mL 0.1 mol/L的NaOH溶液按上述條件再提取，合并上清液。用0.01 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至5.4，在4 000 r/min條件下離心15 min，棄上清液，沉淀水洗兩次后冷凍干燥，得到蛋白[5,17]。使用時用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）配成不同的質(zhì)量濃度。

1.3.1.2 蛋白質(zhì)含量的測定

準(zhǔn)確稱取0.1 mg考馬斯亮藍(lán)溶解于50 mL 90%的乙醇，與100 mL 85%的磷酸混合，加水定容至1 000 mL。取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白加蒸餾水至1 mL，再加5 mL考馬斯亮藍(lán)溶液，靜置5 min，在595 nm波長處測定吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為y=0.006x+0.008（R2=0.999），標(biāo)準(zhǔn)曲線在蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度0～100 μg/mL范圍時具有良好的線性。樣品中蛋白質(zhì)含量測定同上[15]。

1.3.2 硒含量的測定

參照GB 5009.93—2010《食品中硒的測定》氫化物原子熒光光譜法。

1.3.3 抗氧化性分析

1.3.3.1 總抗氧化能力的測定

按試劑盒說明書上的方法測定抗氧化能力。取兩支試管，分別標(biāo)記為測試管和對照管。分別 向兩支試管中加1 mL試劑1，在測試管中加入0.2 mL的待測樣本；分別向兩支試管中加入2 mL試劑2和0.5 mL試劑3，然后用漩渦混勻器充分混勻， 37 ℃水浴30 min；分別向兩支試管中加入0.2 mL試劑4，在對照管中加入0.2 mL的待測樣本，然后再向兩支試管中加入0.2 mL試劑5；最后混勻，放置10 min，蒸餾水調(diào)零，在520 nm波長處測定光密度值。

1.3.3.2 DPPH自由基清除率的測定

用95%的乙醇溶液配制0.2 mg/L的DPPH溶液，避光4 ℃保存，現(xiàn)配現(xiàn)用。取3 mL不同質(zhì)量濃度的待測液，空白管加入3 mL 95%乙醇，最后加入2 mL DPPH溶液，在室溫避光靜置30 min，在517 nm波長處測定吸光度的變化。按下式計算DPPH自由基清除率[18]。

1.3.3.3 ·OH清除率的測定

25 mL比色管中依次移取5 mL的1 mmol/L的硫酸亞鐵溶液，空白管和樣品管中各加5 mL的3 mmol/L過氧化氫溶液，本底管用蒸餾水，加入空白和樣品，用3 mmol/L的水楊酸溶液定容至刻度。在37 ℃水浴鍋中反應(yīng)15 min，在510 nm波長處測定吸光度[19]。

取4.5 mL的0.05 mol/L Tris-HCl（pH 8.2）緩沖液置于37 ℃水浴中恒溫30 min，空白管和樣品管中加入0.5 mL的25 mmol/L鄰苯三酚，本底管用蒸餾水代替，在樣品管和本底管中加入不同體積的樣品，混勻后在37 ℃水浴鍋中反應(yīng)5 min，最后加入1 mL的0.2 mol/L鹽酸溶液終止反應(yīng)。在420 nm波長處測定吸光度[19]。

1.3.3.5 還原力的測定

取2 mL的待測液加入pH 6.6的PBS緩沖液2.5 mL和1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL，混合后在50 ℃條件下放置20 min，加入10%的三氯乙酸溶液1 mL，5 000 r/min離心10 min，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液，混勻，靜置10 min，在700 nm波長處測定吸光度。以80%的乙醇溶液作為空白對照。以待測液與空白對照吸光度的差值為樣品的還原力。

1.3.3.6 氧化自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）測定[20-22]

在96 孔微孔板上加入100 μL不同質(zhì)量濃度的富硒發(fā)芽糙米蛋白、糙米蛋白和蘆丁待測液，同時加入不同質(zhì)量濃度Trolox作對照，再用12 道移液器在每孔中加入50 μL 0.4 μmol/L熒光素鈉混合，37 ℃反應(yīng)15 min后，向每孔中加入50 μL 60 mmol/L的AAPH，選擇激發(fā)波長485 nm，吸收波長535 nm，立即微孔板式多功能分析儀中測定熒光強度，連續(xù)測定100 min。實驗所得的各微孔反應(yīng)的熒光強度數(shù)據(jù)采用積分法計算熒光衰退曲線下面積（area under curve，AUC）。ORAC值由樣品梯度質(zhì)量濃度抗氧化保護(hù)面積（AUC樣品－net AUC）曲線與Trolox標(biāo)準(zhǔn)品梯度質(zhì)量濃度抗氧化保護(hù)面積（AUCTrolox－net AUC）曲線的斜率比得出，ORAC值以Trolox當(dāng)量表達(dá)，即μmol Trolox/g[23]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用GraphPad prism6.0軟件和SPSS 20.0處理數(shù)據(jù)[24-25]。

2 結(jié)果與分析

2.1 富硒發(fā)芽糙米蛋白提取率及其硒含量

采用堿法提取富硒發(fā)芽糙米和糙米中的蛋白，糙米蛋白提取率為（52.36±1.37）%，富硒發(fā)芽糙米蛋白提取率為（50.22±2.74）%；糙米蛋白提取物中不含硒，富硒發(fā)芽糙米蛋白提取物中含硒（0.18±0.01）mg/kg。

2.2 總抗氧化能力

圖1 不同質(zhì)量濃度VC、蘆丁、富硒發(fā)芽糙米蛋白和糙米蛋白的總抗氧化能力Fig.1 T-AOC of Se-enriched germinated brown rice protein, ordinary brown rice protein, rutin and VC at various concentrations

由圖1可知，隨著質(zhì)量濃度的升高，富硒發(fā)芽糙米蛋白、糙米蛋白、VC、蘆丁的總抗氧化能力均逐漸增強，4 種物質(zhì)總抗氧化能力的大小順序為：VC＞蘆?。靖晃l(fā)芽糙米蛋白＞糙米蛋白（P＜0.05）。富硒發(fā)芽糙米中蛋白的總抗氧化能力顯著高于糙米蛋白（P＜0.05）是因為在富硒發(fā)芽糙米蛋白中硒以硒代半胱氨酸形式存在，能螯合起催化作用的金屬離子，因此其總抗氧化能力顯著高于糙米蛋白。

2.3 對DPPH自由基的清除能力

圖2 不同質(zhì)量濃度VC、蘆丁、富硒發(fā)芽糙米蛋白和糙米蛋白的DPPH自由基清除率Fig.2 DPPH radical scavenging activity of Se-enriched germinated brown rice protein, ordinary brown rice protein, rutin and VC at various concentrations

由圖2可知，VC、蘆丁、富硒發(fā)芽糙米蛋白、糙米蛋白都具有一定的DPPH自由基清除能力，VC和蘆丁隨著質(zhì)量濃度的增加，其DPPH自由基清除能力先快速增強，之后基本不變；富硒發(fā)芽糙米蛋白、糙米蛋白隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，DPPH自由基清除能力也隨之增加。在相同質(zhì)量濃度下富硒發(fā)芽糙米蛋白的D PPH自由基清除率明顯高于糙米蛋白，這是因為硒以硒代半胱氨酸存在于酶的活性中心，特別是谷胱甘肽過氧化物酶，具有很強的抗氧化性，能清除DPPH自由基。VC、蘆丁、富硒發(fā)芽糙米蛋白和糙米蛋白清除DPPH自由基的IC50值分別為15.30、18.12、445.2、902.8 μg/mL，因此清除DPPH自由基能力大小順序為：VC＞蘆?。靖晃l(fā)芽糙米蛋白＞糙米蛋白（P＜0.05）。

2.4 對·OH的清除能力

圖3 不同質(zhì)量濃度VC、蘆丁、富硒發(fā)芽糙米蛋白和糙米蛋白的·OOHH清除率Fig.3 Hydroxyl radical scavenging activity of Se-enriched germinated brown rice protein, ordinary brown rice protein, rutin and VC at various concentrations

由圖3可知，VC、蘆丁、富硒發(fā)芽糙米蛋白、糙米蛋白都有一定的·OH清除能力，且隨著質(zhì)量濃度的增加，VC、蘆丁、富硒發(fā)芽糙米蛋白清除·OH能力明顯增強，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到100 μg/mL時，清除能力基本保持不變；而糙米蛋白隨著質(zhì)量濃度的增加，其·OH清除能力逐漸增強。在相同質(zhì)量濃度下，VC、蘆丁和富硒發(fā)芽糙米蛋白的·OH清除能力差異很小，但均高于糙米蛋白。VC、蘆丁、富硒發(fā)芽糙米蛋白、糙米蛋白清除·OH的IC50值分別為75.38、106.9、97.61、609.2 μg/mL；富硒發(fā)芽糙米蛋白·OH清除率顯著大于糙米蛋白清除率（P＜0.05），這是因為硒蛋白以及含硒的酶類物質(zhì)能夠有效清除·OH。

2.5 對O2－·的清除能力

圖4 不同質(zhì)量濃度VC、蘆丁、富硒發(fā)芽糙米蛋白和糙米蛋白的·清除率Fig.4 Superoxide anion radical scavenging activity of Se-enriched germinated brown rice protein, ordinary brown rice protein, rutin and VC at various concentrations

由圖4可知，隨著質(zhì)量濃度的增加，VC、蘆丁、富硒發(fā)芽糙米蛋白、糙米蛋白·清除能力逐漸增強，VC、蘆丁、富硒發(fā)芽糙米蛋白、糙米蛋白清除·的IC50值分別為350.7、618.7、483.4、918.1 μg/mL，其·清除能力大小順序為VC＞蘆?。靖晃l(fā)芽糙米蛋白＞糙米蛋白。這是由于以硒為活性中心的蛋白能有效清除·，因此富硒發(fā)芽糙米蛋白·清除率顯著大于糙米蛋白（P＜0.05）。

2.6 還原力

圖5 不同質(zhì)量濃度VC、蘆丁、富硒發(fā)芽糙米蛋白和糙米蛋白的還原力Fig.5 Reducing power of Se-enriched germinated brown rice protein, ordinary brown rice protein, rutin and VC at various concentrations

由圖5可知，隨著質(zhì)量濃度的升高，VC、蘆丁、富硒發(fā)芽糙米蛋白、糙米蛋白還原力也明顯升高，在相同質(zhì)量濃度下，VC的還原力顯著高于蘆丁、富硒發(fā)芽糙米蛋白和糙米蛋白。根據(jù)量效方程，對VC、蘆丁、富硒發(fā)芽糙米蛋白、糙米蛋白還原力進(jìn)行非線性擬合，擬合曲線相關(guān)系數(shù)R2分別為0.993、0.991、0.990、0.992，擬合結(jié)果顯著，IC50值分別為101.333、169.333、381.392、1 200.670 μg/mL，及還原力大小為VC＞蘆丁＞富硒發(fā)芽糙米蛋白＞糙米蛋白（P＜0.05）。這是因為在富硒發(fā)芽糙米蛋白中硒以硒代半胱氨酸形式存在，能有效除去起催化作用的金屬離子。

2.7 氧化自由基吸收能力

圖6a為不同梯度質(zhì)量濃度Trolox、陽性對照（－AAPH）以及陰性對照（+AAPH）的熒光衰變曲線，圖6b～c分別為3 種樣品（蘆丁、富硒發(fā)芽糙米蛋白、糙米蛋白）不同質(zhì)量濃度梯度的熒光衰變曲線，隨質(zhì)量濃度的增加，樣品抗氧化保護(hù)面積（AUC樣品－net AUC）增加。根據(jù)方法1.3.3.6節(jié)計算Trolox與3 種待測樣品的抗氧化保護(hù)面積曲線斜率，計算得到蘆丁的ORAC值為758.91 μmol Trolox/g，富硒發(fā)芽糙米蛋白的ORAC值為673.52 μmol Trolox/g，糙米蛋白的ORAC值為5.52 μmol Trolox/g。富硒發(fā)芽糙米蛋白和糙米蛋白ORAC值均低于蘆丁，但富硒發(fā)芽糙米蛋白ORAC值顯著高于糙米蛋白（P＜0.05），說明富硒發(fā)芽糙米蛋白氧自由基吸收能力明顯強于糙米蛋白。

圖6 Trolox、蘆丁、富硒發(fā)芽糙米蛋白和糙米蛋白的熒光衰變曲線Fig.6 Fluorescence decay curves of Trolox, rutin, Se-enriched germinated brown rice protein and ordinary brown rice protein at various concentrations

3 結(jié) 論

本實驗通過堿法提取糙米和富硒發(fā)芽糙米蛋白，采用6 種抗氧化活性測定方法，對富硒發(fā)芽糙米蛋白和糙米蛋白抗氧化清除自由基能力進(jìn)行了分析和研究，結(jié)果表明，富硒發(fā)芽糙米蛋白與VC和蘆丁的·OH清除率無顯著差異，均顯著高于糙米蛋白；富硒發(fā)芽糙米蛋白的T-AOC、DPPH自由基清除能力、O2－·清除率、還原力均低于蘆丁和VC，ORAC值低于蘆丁，但是均顯著高于糙米蛋白。研究結(jié)果表明，由于富硒發(fā)芽糙米蛋白中結(jié)合了硒，形成了以硒代半胱氨酸為中心得硒蛋白，抗氧化性和清除自由基能力顯著增強[6]，因此富硒發(fā)芽糙米蛋白相對于糙米蛋白的抗氧化能力顯著提高。

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Antioxidant Activity of Selenium-Enriched Germinated Brown Rice Protein

HU Lingling1,2, LI Chunyang1,*, ZENG Xiaoxiong2, WU Jiansu3
(1. Institute of Agro-Food Science and Technology, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China; 2. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 3. Jiangsu Yuanwang Selenium-rich Agricultural Produce Co. Ltd., Nanjing 211500, China)

In this study, selenium-enriched germinated brown rice protein was extracted using alkali extraction and acid precipitation, and its antioxidant activity was compared with that of the

ubstances of rutin and VC. The results demonstrated that total antioxidant capacity (T-AOC), DPPH free radical scavenging activity, superoxide anion free radical scavenging activity, and reducing power of the protein were lower than those of rutin and VC, and its oxygen radical absorbance capacity (ORAC) was significantly lower than that of rutin (P ＜ 0.05), but significantly higher than that of the protein extracted from the ungerminated ordinary brown rice protein (P ＜ 0.05). Hydroxyl radical scavenging activity of Se-enriched germinated brown rice protein was similar to that of rutin, but significantly higher than that of ordinary brown rice protein (P ＜ 0.05). Therefore, antioxidant activity of the protein from se-enriched germinated brown rice was significantly improved.

Se-enriched germinated brown rice; protein; antioxidant activity; free radical scavenging

10.7506/spkx1002-6630-201601018

TS201.2

A

1002-6630（2016）01-0099-05

胡玲玲, 李春陽, 曾曉雄, 等. 富硒發(fā)芽糙米蛋白的抗氧化活性[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(1): 99-103. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201601018. http://www.spkx.net.cn

HU Lingling, LI Chunyang, ZENG Xiaoxiong, et al. Antioxidant activity of selenium-enriched germinated brown rice protein[J]. Food Science, 2016, 37(1): 99-103. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601018.

2015-07-11

江蘇省產(chǎn)學(xué)研前瞻性聯(lián)合研究項目（BY2012037）；江蘇省農(nóng)業(yè)自主創(chuàng)新基金項目（CX（12）3986）

胡玲玲（1990—），女，碩士研究生，研究方向為食品科學(xué)與工程。E-mail：1214708667@qq.com

*通信作者：李春陽（1966—），男，研究員，博士，研究方向為營養(yǎng)與活性物質(zhì)，農(nóng)產(chǎn)品精深加工。E-mail：lichunyang968@163.com