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        水溶性大豆多糖的分子表征和溶液流變學(xué)性質(zhì)

        2016-11-11 08:24:18楊慧嬌蔡志祥張洪斌常忠義
        食品科學(xué) 2016年1期
        關(guān)鍵詞:本征構(gòu)象酯化

        楊慧嬌,蔡志祥,張洪斌,*,常忠義*

        水溶性大豆多糖的分子表征和溶液流變學(xué)性質(zhì)

        楊慧嬌1,2,蔡志祥1,張洪斌1,*,常忠義2,*

        (1.上海交通大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院高分子科學(xué)與工程系,流變學(xué)研究所,上海 200240;2.華東師范大學(xué)生命科學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系,上海 200241)

        采用核磁共振方法和凝膠滲透色譜(gel permeation chromatography,GPC)技術(shù)測(cè)定了水溶性大豆多糖(soluble soybean polysaccharides,SSPS)的酯化度和分子質(zhì)量,并研究了SSPS在水溶液中的分子構(gòu)象和流變學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明,核磁共振方法可以快速準(zhǔn)確地測(cè)定SSPS的酯化度,水溶液中SSPS呈緊密的無(wú)規(guī)線團(tuán)構(gòu)象,具有很低的本征黏度,SSPS水溶液表現(xiàn)出很強(qiáng)的剪切變稀行為,并具有明顯的觸變性。

        水溶性大豆多糖;酯化度;分子參數(shù);構(gòu)象;流變特性

        水溶性大豆多糖(soluble soybean polysaccharides,SSPS)是從已經(jīng)提取過(guò)大豆油和大豆蛋白的剩余物中,分離提取出來(lái)的一種高度支化的天然聚陰離子多糖,其結(jié)構(gòu)類似果膠,均含有部分甲酯化的半乳糖醛酸[1-4]。SSPS除具有膳食纖維所具有的功能特性[5]以外,還具有諸如乳化性、酸性條件下對(duì)蛋白顆粒的穩(wěn)定作用、抗黏結(jié)性、抗氧化性、成膜性能及泡沫穩(wěn)定性等特性[6-12],是一種應(yīng)用廣泛的功能性食品添加劑。

        SSPS的性質(zhì)和多重功能性在很大程度上依賴于其分子質(zhì)量、支化度和酯化度[13-15]。其中酯化度(degreeof esterification,DE)是指分子鏈上甲酯化的半乳糖醛酸殘基占總半乳糖醛酸殘基數(shù)量的百分比值[16]。有研究表明,酯化度的不同對(duì)SSPS的性質(zhì)和功能有重要的影響[17]。就多糖酯化度的測(cè)定而言,最早被應(yīng)用和公認(rèn)的測(cè)定方法是酸堿滴定法,如《美國(guó)食品化學(xué)法典》和《美國(guó)藥典》所述的方法[18-19]。該方法的優(yōu)點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)條件簡(jiǎn)單,不需要使用復(fù)雜的儀器,但測(cè)試繁瑣耗時(shí)、樣品量需求也較大,特別是由滴定終點(diǎn)的判斷引起的誤差大,結(jié)果的重復(fù)性差。目前核磁共振技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)確定,如通過(guò)該方法可確定SSPS的分子骨架組成[20]。但采用核磁共振法(nuelear magnetic resonance,NMR)確定SSPS的酯化度尚未見(jiàn)報(bào)道。核磁共振方法則能很好地解決滴定法存在的問(wèn)題,所需的樣品量少,且快速、精度高。

        除酯化度外,分子質(zhì)量、本征黏度、溶液流變學(xué)性質(zhì)也是SSPS重要的功能性指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合SSPS分子具有支化結(jié)構(gòu)的特點(diǎn),對(duì)不同酯化度的SSPS進(jìn)行了分子參數(shù)表征,并討論了SSPS在水溶液中的分子構(gòu)象和流變學(xué)性質(zhì),以期對(duì)SSPS的生產(chǎn)以及功能性應(yīng)用提供基礎(chǔ)理論數(shù)據(jù)和指導(dǎo)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        豆渣 金晶生物科技有限公司提供;SSPS 上海交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)室和華東師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)室自制。

        氘代水(D2O)、氘代硫酸(D2SO4) 美國(guó)Sigma公司;硝酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸、蒸餾水等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

        1.2 儀器與設(shè)備

        Avance Ⅲ 400 MHz核磁共振波譜儀 瑞典Bruker公司;凝膠滲透色譜(Viscotek 270 GPC) 英國(guó)Malvern儀器有限公司;A6000M凝膠色譜柱 Pharmacia生物科技有限公司;AR-G2旋轉(zhuǎn)流變儀 美國(guó)TA儀器有限公司;Avanti J-25超速離心機(jī) 美國(guó)Beckman Coulter公司;FE20KPlus酸度計(jì) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;DZKW-S-4電熱恒溫水浴鍋 北京光明醫(yī)療儀器廠;FA1004精密電子天平 上海天平儀器公司。

        1.3 方法

        1.3.1 SSPS提取的基本流程

        將脫除蛋白和脂肪后粉碎干燥的豆渣進(jìn)行酸解提取,然后離心過(guò)濾后進(jìn)行脫酯化處理,隨后將料液中和,取離心后上清液進(jìn)行濃縮,所得濃縮液用乙醇沉淀,最后將沉淀物真空干燥即得產(chǎn)物。

        1.3.2 不同脫酯化程度SSPS的制備

        按照1.3.1節(jié)的方法進(jìn)行,在脫酯化處理的反應(yīng)階段,針對(duì)脫酯化反應(yīng)的3 個(gè)影響因素,pH值、反應(yīng)溫度和脫酯化時(shí)間分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)。將酸解提取,離心過(guò)濾后的上清液用NaOH調(diào)至一定pH值,待升溫至一定溫度后,將上清液置于水浴鍋或高壓滅菌鍋中進(jìn)行脫酯化反應(yīng),即得脫酯化程度不同的產(chǎn)物。

        1.3.3 酯化度的測(cè)定

        酯化度測(cè)定分別采用核磁共振法[21-22]和酸堿滴定法[23]。核磁共振法中,待測(cè)多糖樣品以質(zhì)量比為3∶1的D2O和D2SO4混合溶液作為溶劑,配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.5%的溶液。測(cè)試溫度為80 ℃,以四甲基硅烷(tetramethylsilane,TMS)作為內(nèi)標(biāo),掃描64 次。

        1.3.4 分子質(zhì)量和本征黏度的測(cè)定

        多糖樣品分子質(zhì)量和本征黏度的測(cè)定采用Viscotek TDAmax多檢測(cè)器凝膠色譜系統(tǒng),所用檢測(cè)器分別為光散射檢測(cè)器、濃度檢測(cè)器和黏度檢測(cè)器,色譜柱為2 根A6000M柱子串聯(lián)使用。測(cè)試樣品的質(zhì)量濃度為2 mg/mL,進(jìn)樣體積為150 μL,流動(dòng)相為0.1 mol/L的NaNO3溶液,流速為0.8 mL/min,柱溫40 ℃。

        1.3.5 溶液流變學(xué)性質(zhì)的測(cè)定

        取適量SSPS粉末溶于蒸餾水中,攪拌使其充分水合溶解,配制成一定質(zhì)量濃度(5、10、15、20 g/100 mL)的多糖溶液,采用AR-G2流變儀進(jìn)行流變性質(zhì)的測(cè)定。實(shí)驗(yàn)夾具為直徑60 mm的錐板,錐角2°1′8″,間距58 μm。測(cè)試溫度為25 ℃。穩(wěn)態(tài)剪切黏度曲線測(cè)試中,剪切速率由0.01 s-1升至1 000 s-1再回掃降至0.01 s-1。以扭矩值變化在3 個(gè)連續(xù)取樣周期(20 s)小于5%為達(dá)到穩(wěn)態(tài)。為了解預(yù)剪切對(duì)樣品流變學(xué)性質(zhì)的影響,將樣品在100 s-1的剪切速率下預(yù)剪切5 min,然后進(jìn)行動(dòng)態(tài)時(shí)間掃描測(cè)試,測(cè)定其隨時(shí)間變化的儲(chǔ)能模量(G’)。測(cè)試頻率為1 Hz,應(yīng)力為0.01 Pa。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 脫酯化程度的主要影響因素和脫酯化條件

        未脫酯化處理樣品的酯化度為60.5%。由圖1可知,脫酯化pH值處理后,樣品的酯化度值與未作處理的對(duì)照組發(fā)生了顯著的降低,并隨著脫酯化pH值的升高,可溶性大豆多糖的酯化度大幅度降低。由于反應(yīng)溶液中的糖類和所含少量的蛋白類物質(zhì)會(huì)發(fā)生美拉德反應(yīng),使產(chǎn)物顏色加深變黑,因此,脫酯化pH值的變化會(huì)影響可溶性大豆多糖的外觀色澤。當(dāng)pH≥11時(shí),美拉德反應(yīng)加速進(jìn)行,提取干燥后的可溶性大豆多糖的顏色已接近深褐色。因此,在實(shí)際脫酯化過(guò)程中一般選定的pH值介于9~10之間。

        圖1 不同脫酯化pH值對(duì)酯化度的影響(100 ℃,90 min)Fig.1 Influence of pH on the degree of esterification of SSPS at 100 ℃for 90 min

        圖2 不同脫酯化時(shí)間對(duì)酯化度的影響(pH 10,100 ℃)Fig.2 Influence of de-esterification time (at 100 ℃ and pH 10) on degree of esterification of SSPS

        由圖2可知,隨著脫酯化處理時(shí)間的增加,可溶性大豆多糖的酯化度都有不同程度的降低,當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過(guò)90 min后,酯化度的下降趨緩,反應(yīng)時(shí)間達(dá)到120 min時(shí),酯化度可達(dá)10%或以下。但是,處理時(shí)間超過(guò)100 min,同樣會(huì)由于美拉德反應(yīng),使所得可溶性大豆多糖顏色加深而影響使用。因此,脫酯化時(shí)間以不大于90 min為佳。

        表1 脫酯化程度不同樣品的制備條件Table 1 Preparation conditions for SSPS samples with different degrees of de-esterification

        2.2 核磁共振法測(cè)得的酯化度及其與酸堿滴定法的比較

        水溶性多糖在氘代試劑D2O中得到的氫峰?;ハ嘀丿B在一起,而采用D2O-D2SO4混合液作為溶劑可使糖單元之間的糖苷鍵斷裂以提高峰形分辨率[22]。研究表明,選擇質(zhì)量比為3∶1的D2O-D2SO4混合液作為氘代試劑可以有效地提高峰形分辨率,進(jìn)而計(jì)算SSPS的酯化度。將SSPS在氘代試劑中80 ℃條件下溶解15 min,常溫下測(cè)試可獲得SSPS的氫譜(見(jiàn)圖4,樣品2)。結(jié)合圖5中SSPS骨架結(jié)構(gòu)式可知,圖4中,化學(xué)位移δ=4.68~4.70處為羧基旁的H-5峰(相應(yīng)的峰面積ICOO-),δ=4.99~5.01處為酯基旁邊的H-5峰(峰面積ICOOMe),δ=5.01~5.02處為半乳糖醛酸頭碳?xì)銱-1峰(峰面積IH-1)。通過(guò)δ=4.68~4.70(峰面積ICOO-)和δ=4.99~5.01(峰面積ICOOMe)處2 個(gè)峰面積可以計(jì)算SSPS的酯化度,計(jì)算公式為:

        但由于化學(xué)位移δ=4.99~5.02處酯基旁邊的H-5峰(ICOOMe)和H-1峰(IH-1)相重疊,難以分開(kāi),因此可以把H-1和酯基旁的H-5峰結(jié)合在一起,通過(guò)方程變換[22],采用下式計(jì)算SSPS酯化度:

        圖3 脫酯化溫度對(duì)酯化度的影響(pH 10,90 min)Fig.3 Influence of de-esterification temperature (at pH 10 for 90 min) on degree of esterification of SSPS

        圖4 SSPS的氫譜圖Fig.41H-NMR spectrum of SSPS in D2O-D2SO4

        由圖3可知,隨著脫酯化處理溫度的提高,脫酯化反應(yīng)速率加快,酯化度也逐漸降低。

        綜上,SSPS脫酯化程度隨pH值和反應(yīng)溫度的升高以及脫酯化時(shí)間的延長(zhǎng)而下降。本研究根據(jù)不同pH值、反應(yīng)溫度和脫酯化時(shí)間分別得到了4 種脫酯化程度不同的樣品,其制備條件見(jiàn)表1。

        由核磁氫譜所得不同脫酯化SSPS樣品的酯化度與參考果膠酯化度酸堿滴定測(cè)定法[23]測(cè)得的酯化度比較見(jiàn)圖6。圖中每個(gè)酯化度值為3 個(gè)平行樣品的平均值??梢钥吹?,兩類方法所得酯化度值非常吻合,反映出核磁共振法能快捷、準(zhǔn)確地測(cè)得SSPS酯化度。

        圖5 SSPS骨架結(jié)構(gòu)式Fig.5 Structure of SSPS

        圖6 SSPS核磁共振氫譜法與酸堿滴定法測(cè)得酯化度的相關(guān)性Fig.6 Linear relationship between degrees of esterification determined using1H-NMR spect roscopy and D2O-D2SO4for SSPS

        2.3 分子質(zhì)量測(cè)定和分子構(gòu)象

        Mark-Houwink方程給出了聚合物溶液的本征黏度([η]/(dL/g))和聚合物分子質(zhì)量(M)之間的關(guān)系:

        式中:K和α為Mark-Houwink參數(shù),與聚合物和溶劑的種類以及測(cè)試溫度有關(guān)。

        對(duì)于給定溫度下的某種聚合物溶液,在一定分子質(zhì)量范圍內(nèi),K和α是與分子質(zhì)量無(wú)關(guān)的常數(shù)。參數(shù)α被認(rèn)為是一個(gè)有關(guān)高分子鏈形狀的系數(shù)[24],它與聚合物在溶劑中所呈的構(gòu)象有關(guān)。當(dāng)α值在0~0.1之間時(shí),聚合物在溶劑中為球狀構(gòu)象,當(dāng)α在0.35~0.8之間時(shí),聚合物在溶劑中呈現(xiàn)無(wú)規(guī)線團(tuán)構(gòu)象,并且α值越接近0.8,其聚合物線團(tuán)越為伸展,而當(dāng)α≥1,此時(shí)聚合物在溶劑中呈剛性線團(tuán)狀。

        圖7所示為在25 ℃條件下SSPS分子質(zhì)量(Mw)和本征黏度([η])的測(cè)定結(jié)果。結(jié)合Mark-Houwink方程可以得出如下關(guān)系式:

        式中:α值為0.42,與文獻(xiàn)[20]報(bào)道值(0.47)較為一致。該值表明,SSPS在水溶液中呈不太伸展的無(wú)規(guī)線團(tuán)構(gòu)象。這種構(gòu)象與其具有高度支化的結(jié)構(gòu)有關(guān),不同于能伸展的線型高分子,而與另一高支化多糖玉米纖維膠(α=0.471)類似[25]。這兩種高度支化多糖的α值均小于呈伸展構(gòu)象的線型高分子透明質(zhì)酸多糖的α值(約為0.6)[25]。

        SSPS的這種構(gòu)象也與其具有低的本征黏度相吻合。SSPS的本征黏度很低,即使是高分子質(zhì)量(5.65×105D)的樣品4,也僅為0.417 dL/g,該值遠(yuǎn)低于分子質(zhì)量?jī)H為3.33×105D的玉米纖維膠的本征黏度(1.482 dL/g),而分子質(zhì)量為3.56×105D的透明質(zhì)酸,其本征黏度高達(dá)8.784 dL/g[25]。這表明SSPS較玉米纖維膠具有更加緊密的構(gòu)象結(jié)構(gòu)。

        圖7 SSPS的本征黏度隨分子質(zhì)量的變化曲線Fig.7 Plot of [η] versus Mwfor SSPS in aqueous solution

        2.4 流變學(xué)性質(zhì)

        圖8 剪切速率升降過(guò)程中不同質(zhì)量濃度SSPS溶液黏度與剪切速率的關(guān)系Fig.8 Steady shear viscosity SSPS solutions as a function of shear rate upon increasing shear rate

        SSPS這種緊密的構(gòu)象結(jié)構(gòu)和低本征黏度還與其流變學(xué)性質(zhì)完全相符。圖8為不同質(zhì)量濃度的SSPS(樣品4)溶液的流動(dòng)曲線??梢钥吹剑c阿拉伯膠溶液[25]和玉米纖維膠溶液[25]類似,盡管分子質(zhì)量很高、水溶性很好,但SSPS溶液在質(zhì)量濃度很高的情況下,仍具有低黏度的特性(20 g/100 mL的溶液在剪切速率為1 s-1時(shí),黏度僅約為1 Pa·s)。SSPS溶液黏度與剪切速率的關(guān)系,也與阿拉伯膠溶液非常類似,在低剪切速率區(qū)不能觀測(cè)到牛頓區(qū),且剪切變稀現(xiàn)象非常明顯。此外,在剪切速率由低到高,再由高到低回掃過(guò)程中,兩條黏度曲線并不重合,特別是較高質(zhì)量濃度的大豆多糖水溶液在低剪切速率區(qū)。圖9為預(yù)剪切后該溶液彈性模量G’隨時(shí)間的變化。可觀察到預(yù)剪切后溶液彈性模量隨時(shí)間延長(zhǎng)快速上升直至達(dá)某一平衡值。這些流變學(xué)性質(zhì)反映出,SSPS溶液如同阿拉伯膠溶液[26]一樣,由于大分子間存在相互作用,在溶液中形成微結(jié)構(gòu),使體系具有明顯的觸變性。

        圖9 預(yù)剪切(1000 ss-1,5 min)后5 g/100 mL SSPS溶液彈性模量G’隨時(shí)間的變化Fig.9 G’ as a function of time for 5 g/10000 mmLL SSPS solution after per-shearing at 100 s-1for 5 min

        3 結(jié) 論

        采用核磁共振法,利用1H-NMR譜,可以準(zhǔn)確、快捷測(cè)定SSPS的酯化度;25 ℃水溶劑中,SSPS溶液的Mark-Houwink方程為[η]=1.51×10-3Mw0.42;SSPS在水溶液中呈緊密的無(wú)規(guī)線團(tuán)構(gòu)象,盡管分子質(zhì)量較高,但本征黏度遠(yuǎn)低于其他水溶性多糖;SSPS水溶液具有高質(zhì)量濃度時(shí)黏度低的流變學(xué)特性,并具有明顯的觸變性。

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        Molecular Characterization of Soluble Soybean Polysaccharide and Rheological Properties of Its Aqueous Solution

        YANG Huijiao1,2, CAI Zhixiang1, ZHANG Hongbin1,*, CHANG Zhongyi2,*
        (1. Advanced Rheology Institute, Department of Polymer Science and Engineering, School of Chemistry and Chemical Engineering, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China; 2. Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Life Science, East China Normal University, Shanghai 200241, China)

        The degree of esterifi cation and molecular weight of soluble soybean polysaccharide (SSPS) were measured by1H-NMR spectroscopy and gel permeation chromatography (GPC), respectively, and the conformation of SSPS in water and the rheological properties of aqueous SSPS solution were investigated. It was found that the degree of esterifi cation of SSPS could be determined by using1H-NMR accurately and rapidly. The experimental results also showed that SSPS chains exhibited random coils with compact conformation in water, and that SSPS aqueous solutions possessed a very low intrinsic viscosity, signifi cant shear thinning behavior and thixotropy.

        soluble soybean polysaccharides (SSPS); degree of esterifi cation (DE); molecular parameter; conformation; rheological property

        10.7506/spkx1002-6630-201601001

        TS201.7

        A

        1002-6630(2016)01-0001-05

        楊慧嬌, 蔡志祥, 張洪斌, 等. 水溶性大豆多糖的分子表征和溶液流變學(xué)性質(zhì)[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(1): 1-5.

        DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601001. http://www.spkx.net.cn

        YANG Huijiao, CAI Zhixiang, ZHANG Hongbin, et al. Molecular characterization of soluble soybean polysaccharide and rheological properties of its aqueous solution[J]. Food Science, 2016, 37(1): 1-5. (in Chinese with English abstract)

        DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601001. http://www.spkx.net.cn

        2015-02-13

        國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(21274090);上海市重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(B202)

        楊慧嬌(1989—),女,碩士研究生,研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物提取。E-mail:yhj_890330@126.com

        *通信作者:張洪斌(1965—),男,研究員,博士,研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物和食品親水膠體功能化及其應(yīng)用。

        E-mail:hbzhang@sjtu.edu.cn

        常忠義(1968—),男,副教授,博士,研究方向?yàn)槲⑸锱c食品生物化學(xué)。E-mail:zychang@bio.ecnu.edu.cn

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