張 杰，葛武鵬,*，陳 瑛，張 悅，劉李婷

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局，陜 西 西安 710068；3.陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西 西安 710068）

納豆激酶高產(chǎn)菌株的選育及固態(tài)發(fā)酵技術(shù)

張 杰1，葛武鵬1,*，陳 瑛2，張 悅3，劉李婷3

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局，陜 西 西安 710068；3.陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西 西安 710068）

以枯草芽孢桿菌為出發(fā)菌株，選用超聲波和紫外線進(jìn)行誘變處理，根據(jù)致死率、突變率與誘變劑量的關(guān)系選擇合適的誘變劑量，以篩選高產(chǎn)納豆激酶的優(yōu)勢(shì)菌株。實(shí)驗(yàn)表明：最佳誘變條件為：超聲波45 kHz、2 80 W，時(shí)間60 min，紫外線照射距離30 cm，時(shí)間120 s。經(jīng)多次初篩、復(fù)篩，選育出一株命名為BSCZ-4 的優(yōu)勢(shì)菌株，其納豆激酶酶活力為原始菌株的1.96 倍。對(duì)該菌種進(jìn)行連續(xù)20 代培養(yǎng)，測(cè)得其溶解圈直徑穩(wěn)定在18～19 mm之間，表明該突變株遺傳特性穩(wěn)定。并采用Box-Behnken響應(yīng)曲面法優(yōu)化其固態(tài)發(fā)酵工藝條件，結(jié)果為：魔芋精粉添加量5%、接種量8%，34 ℃發(fā)酵24 h，納豆激酶活力可達(dá)（4 087.83±93.75） U/g。

誘變；枯草芽孢桿菌；響應(yīng)面；工藝

納豆是一種有著幾千年歷史的傳統(tǒng)發(fā)酵食品，具有很多保健功能，如抗腫瘤、溶血栓、抗氧化、抗菌、防治骨質(zhì)疏松、降血壓、美容等[1]。納豆枯草芽孢桿菌是納豆的生產(chǎn)菌種，屬于細(xì)菌科、芽孢桿菌屬[2]，是革蘭氏陽(yáng)性菌[3]，具有分解蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪等大分子物質(zhì)的能力[4]，其代謝產(chǎn)物納豆激酶（nattokinase，NK）是一種絲氨酸蛋白酶[5]，由275 個(gè)氨基酸殘基組成，分子質(zhì)量約為28 kD。納豆激酶較穩(wěn)定，50 ℃處理或經(jīng)5 次反復(fù)凍融仍能保持活性。在pH 6～12條件下穩(wěn)定存在，在酸性條件下無(wú)活性[6]。經(jīng)大量文獻(xiàn)證實(shí)納豆激酶具有多種功能[7-10]，其溶栓及抑制血栓形成效果較為突出[11-14]。

近幾年，世界很多國(guó)家也都加入到納豆的研究工作中，而國(guó)內(nèi)的研究重點(diǎn)主要集中在通過(guò)對(duì)發(fā)酵條件的優(yōu)化，從而提高納豆激酶的活力值[15-17]。然而在此基礎(chǔ)上得到的酶活力值并不理想，整體水平上仍有待提高。傳統(tǒng)的誘變技術(shù)是大多數(shù)微生物育種的重要手段[18]，誘變育種通常使用兩種或兩種以上的手段進(jìn)行復(fù)合處理，根據(jù)其復(fù)合處理的協(xié)調(diào)作用以提高誘變效應(yīng)。本研究從生產(chǎn)菌種出發(fā)，通過(guò)對(duì)納豆枯草芽孢桿菌菌體進(jìn)行超聲波和紫外線復(fù)合誘變處理，篩選出納豆激酶產(chǎn)量明顯提高的突變株，并經(jīng)傳代20 次證明其遺傳穩(wěn)定性，可作為發(fā)酵的優(yōu)良菌種。并采用Box-Behnken響應(yīng)曲面法優(yōu)化其固態(tài)發(fā)酵工藝條件，得到高產(chǎn)納豆激酶的工藝參數(shù)，以期為納豆菌高產(chǎn)納豆激酶提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

枯草芽孢桿菌枯草亞種BS21076 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

尿激酶 北京雅安達(dá)生物技術(shù)有限公司；凝血酶（1 000 U/支）、牛纖維蛋白原 美國(guó)Sigma公司。

1.2 培養(yǎng)基

牛奶初篩培養(yǎng)基：脫脂奶粉60 g、牛肉膏5 g、蛋白胨5 g、NaCl 5 g、瓊脂15 g，蒸餾水1 L，pH 7.0。

液體種子培養(yǎng)基：牛肉膏5 g、蛋白胨5 g、NaCl 5 g，蒸餾水1 L，pH 7.0。

發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基[19]：葡萄糖15 g、蛋白胨15 g、Na2HPO42 g、NaH2PO42 g、MgSO40.5 g、CaCl20.2 g，蒸餾水1 L，pH 7.2～7.4。

1.3 儀器與設(shè)備

DRP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SW-CJ-2D型（實(shí)用垂直新穎）雙人凈化工作臺(tái)蘇州凈化設(shè)備有限公司；ES-315高壓蒸汽殺菌鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；精密pH儀 德國(guó)賽多利斯公司；SPH-200B搖床 西安禾普生物科技有限公司；HC-3018高速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；SB-5200DT超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.4 方法

1.4.1 菌懸液的制備[20]

用接種環(huán)挑取斜面菌種兩環(huán)，接種于裝有100 mL液體種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)15 h。將制備好的種子液裝入離心管5 000 r/min離心20 min，倒去上清液，將菌泥用滅菌的生理鹽水洗2～3 次，然后調(diào)整菌懸液濃度為106～107個(gè)/mL。

1.4.2 超聲波處理

將20 mL的菌懸液置于50 mL三角瓶中，放入超聲波清洗機(jī)。超聲波工作條件為 45 kHz、280 W、220 V，對(duì)菌懸液依次誘變處理0、10、20、30、40、50、60、70、80 min，取誘變后的菌懸液將其稀釋涂布于固體培養(yǎng)基平板上，每組2 個(gè)平行，培養(yǎng)24 h，統(tǒng)計(jì)菌落，計(jì)算致死率。

1.4.3 紫外誘變處理

將菌懸液稀釋后均勻地涂布在固體培養(yǎng)基上，紫外燈（照射距離為30 cm）預(yù)熱30 min后，照射涂布了枯草芽孢桿菌懸液的固體培養(yǎng)基[21]。照射時(shí)間分別為0、30、60、90、120、150、180、210、240 s。照射結(jié)束后用黑布包裹，37 ℃培養(yǎng)24 h，統(tǒng)計(jì)菌落總數(shù)，計(jì)算致死率。

1.4.4 致死率的計(jì)算

致死率的計(jì)算見(jiàn)式（1）[22]。

式中：A為未經(jīng)處理的平板菌落數(shù)/（CFU/mL）；B為與A平行經(jīng)誘變處理后的再生菌落數(shù)/（CFU/mL）。1.5 菌種誘變流程

出發(fā)菌→超聲波處理→初篩→復(fù)篩→紫外照射→初篩→復(fù)篩→高產(chǎn)納豆激酶菌株

1.6 篩選方法

1.6.1 初篩

將誘變菌株和原始菌株分別培養(yǎng)后，用接種環(huán)點(diǎn)樣于脫脂牛奶初篩培養(yǎng)基上，于37 ℃培養(yǎng)18 h后，以原始菌株作為對(duì)照組，測(cè)定并計(jì)算溶解圈直徑與菌落直徑的比值，選取正突變株（即牛奶初篩平板溶解圈直徑與菌落直徑比值比對(duì)照菌株溶解圈直徑與菌落直徑比值增大10%的菌株），計(jì)算正突變率。正突變率的計(jì)算見(jiàn)式（2）[23]。

式中：A為點(diǎn)樣菌落數(shù)/（CFU/mL）；B為突變株菌落數(shù)/（CFU/mL）。

1.6.2 復(fù)篩

將通過(guò)初篩方法所得到的突變菌株經(jīng)種子液培養(yǎng)（37 ℃、150 r/min、15 h）后，按4%的接種量轉(zhuǎn)入10 mL的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37 ℃、150 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)72 h后，分別經(jīng)瓊脂糖-纖維蛋白平板測(cè)量溶解圈直徑并計(jì)算納豆激酶活力。

1.7 遺傳穩(wěn)定性測(cè)定

經(jīng)過(guò)初篩、復(fù)篩實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將篩選得到的最優(yōu)突變菌株進(jìn)行傳代實(shí)驗(yàn)，傳20 代并每隔2代進(jìn)行搖床發(fā)酵實(shí)驗(yàn)（37 ℃、150 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)72 h），然后采用瓊脂糖-纖維蛋白平板法測(cè)定納豆激酶酶活力以考察突變菌種的遺傳穩(wěn)定性。

1.8 納豆激酶活性測(cè)定

納豆激酶活性測(cè)定參照Astrup等[24]的方法，制備纖維蛋白平板并進(jìn)行改進(jìn)。取3 mL配制好的纖維蛋白原溶液放入長(zhǎng)試管中于37 ℃保存?zhèn)溆?。在直? cm培養(yǎng)皿中，用1 000 μL的移液槍加入1 mL 20 U/mL凝血酶，再加入2 mL工作液，搖勻。將配制好的瓊脂糖溶液取10 mL加入放有纖維蛋白原溶液的試管中，搖晃幾下倒入培養(yǎng)皿中，按逆時(shí)針?lè)较騽蛩俎D(zhuǎn)圈搖晃培養(yǎng)皿，以確保溶液充分混合均勻，并保持無(wú)氣泡。將尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品用生理鹽水配制成200、400、600、800、1 000 U/mL 5 個(gè)濃度梯度，分別取5 μL加入已制備好的瓊脂糖-纖維蛋白原平板中，放入恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃孵育18 h，測(cè)量溶解圈垂直直徑，計(jì)算溶解圈面積。以溶解圈面積為縱坐標(biāo)，酶活力為橫坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。取樣品5 μL加入纖維蛋白平板中，37 ℃孵育18 h，測(cè)量溶解圈垂直直徑，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定樣品酶活力。

1.9 固態(tài)發(fā)酵最佳條件確定

1.9.1 產(chǎn)酶條件單因素試驗(yàn)

以篩選出高產(chǎn)納豆激酶的突變株為生產(chǎn)菌株，采用固態(tài)發(fā)酵方式進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，包括發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、接種量、魔芋精粉添加量。

1.9.2 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選擇發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、魔芋精粉添加量作為3 個(gè)顯著影響因素，采用Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，以納豆激酶酶活力為響應(yīng)值對(duì)顯著因素進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波誘變

任何誘變劑都具有致死和誘變的雙重效應(yīng)[25]，因此測(cè)定枯草芽孢桿菌經(jīng)超聲波處理后的致死率曲線，以確定最佳誘變時(shí)間，根據(jù)超聲波處理后菌落生長(zhǎng)狀況測(cè)得菌體的致死率見(jiàn)圖1。隨著超聲波時(shí)間的延長(zhǎng)，枯草芽孢桿菌的致死率相應(yīng)提高，當(dāng)誘變時(shí)間80 min時(shí)，致死率達(dá)到91.00%，同時(shí)計(jì)算不同誘變處理下的正突變率。由圖1可知，當(dāng)超聲波誘變時(shí)間在60 min時(shí)，正突變率明顯高于其他值，達(dá)到44.66%，這可能是由于誘變時(shí)間延長(zhǎng)，超聲波對(duì)細(xì)胞的作用增加，使得突變率提高。根據(jù)致死率和突變率兩個(gè)指標(biāo)，確定超聲波誘變時(shí)間為60 min。

圖1 BS21076超聲波誘變致死曲線Fig.1 Death and mutation rates of BS21076 subjected to ultrasonic treatment

2.2 超聲波誘變下突變株的篩選

2.2.1 初篩

將103 株突變菌株與原始菌株點(diǎn)樣于牛奶初篩平板上，37 ℃培養(yǎng)18 h，測(cè)定并計(jì)算其溶解圈直徑與菌落直徑的比值，經(jīng)過(guò)與原始菌株的比較選取正突變株，最終得到46 株。為了確保正突變株能生產(chǎn)高活力的納豆激酶，對(duì)46 株突變株進(jìn)行復(fù)篩。

2.2.2 復(fù)篩

采用搖床發(fā)酵法并結(jié)合瓊脂糖-纖維蛋白平板法測(cè)定，將初篩得到的46 株菌株經(jīng)37 ℃、150 r/min的搖瓶發(fā)酵72 h后，采用瓊脂糖-纖維蛋白平板法測(cè)定納豆激酶活力，以原始菌株的發(fā)酵液中酶活力為對(duì)照，篩選出酶活力最高的菌株，最終確定編號(hào)BSC-2菌株活力最高。

2.3 紫外誘變

圖2 BSC-2紫外誘變致死曲線Fig.2 Death and mutation rates of BSC-2 subjected to UV treatment

將篩選的突變株BSC-2進(jìn)行紫外線誘變處理，結(jié)果見(jiàn)圖2。隨著紫外照射時(shí)間延長(zhǎng)，致死率逐漸增大，較超聲波致死曲線相比，增加速率較為平緩。當(dāng)照射時(shí)間為150 s時(shí)，致死率達(dá)到了90.31%。計(jì)算不同紫外線處理時(shí)間下正突變率，結(jié)果見(jiàn)圖2。120 s時(shí)正突變率為49.33%，明顯高于其他誘變劑量，故采用120 s作為紫外誘變最佳處理時(shí)間。

2.4 紫外誘變下突變株的篩選

將BSC-2經(jīng)紫外誘變處理后的突變株，用接種環(huán)點(diǎn)樣于牛奶初篩平板上，通過(guò)與原始菌株BSC-2對(duì)比，最終從75 株突變株中篩選出37 株，然后對(duì)其進(jìn)行搖瓶復(fù)篩。通過(guò)比較溶解圈直徑計(jì)算出納豆激酶酶活力，最終確定1 株產(chǎn)酶活力較高的菌株，編號(hào)為BSCZ-4。

2.5 遺傳穩(wěn)定性

經(jīng)過(guò)初篩、復(fù)篩實(shí)驗(yàn)最終得到一株產(chǎn)酶活性較高的菌株，為了驗(yàn)證突變株的遺傳穩(wěn)定性，將產(chǎn)酶活力較高的1 株突變株BSCZ-4連續(xù)傳代20 次，采用瓊脂糖-纖維蛋白平板法每隔2 代測(cè)定其產(chǎn)酶活力。由圖3可知，突變株的每代產(chǎn)生的溶解圈直徑比較穩(wěn)定，基本維持在18～19 mm之間，說(shuō)明突變株BSCZ-4具有良好的遺傳穩(wěn)定性，可作為優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行后續(xù)發(fā)酵。

圖3 突變株遺傳穩(wěn)定性Fig.3 Genetic stability of mutant strain BSCZ-4

2.6 固態(tài)發(fā)酵最佳工藝條件優(yōu)化

2.6.1 不同發(fā)酵溫度對(duì)納豆激酶酶活性的影響

微生物在發(fā)酵過(guò)程中適宜的溫度也是保證酶活力的一個(gè)主要因素，因此研究不同發(fā)酵溫度對(duì)納豆激酶酶活力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。發(fā)酵溫度對(duì)其產(chǎn)酶活力影響顯著，隨著發(fā)酵溫度的升高，所產(chǎn)生的納豆激酶酶活力呈現(xiàn)先升高后減小的趨勢(shì)。當(dāng)溫度達(dá)到37 ℃時(shí)，所得到的納豆激酶酶活力達(dá)到最大，為（3 414.97±16.25） U/g。由多重比較分析結(jié)果可知，各因素間存在顯著性差異。

圖4 不同發(fā)酵溫度對(duì)納豆激酶酶活力的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on the activity of nattokinase

2.6.2 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)納豆激酶酶活力的影響

由圖5可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)生的納豆激酶酶活力呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為24 h時(shí)，納豆激酶酶活力明顯高于其他值，為（3 413.71±45.53） U/g。這是由于在發(fā)酵過(guò)程中，首先微生物數(shù)量不斷增長(zhǎng)，隨后代謝產(chǎn)物將不斷積累。但隨著菌體的不斷衰老，其代謝產(chǎn)物相對(duì)比較復(fù)雜，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)，代謝產(chǎn)物酶活力有下降趨勢(shì)。

圖5 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)納豆激酶酶活力的影響Fig.5 Effect of fermentation time on the activity of nattokinase

2.6.3 不同接種量對(duì)納豆激酶酶活力的影響

圖6 不同接種量對(duì)納豆激酶酶活力的影響Fig.6 Effect of inoculums amount on the activity of nattokinase

由圖6可知，當(dāng)接種量過(guò)低時(shí)（≤4%），納豆激酶酶活力相對(duì)較小；而當(dāng)接種量過(guò)大時(shí)（10%），納豆激酶酶活力也呈現(xiàn)較低的趨勢(shì)。這可能是由于當(dāng)接種量過(guò)低時(shí)，菌種生長(zhǎng)繁殖相對(duì)較慢，代謝產(chǎn)物積累較少；而當(dāng)接種量過(guò)大時(shí)，菌種繁殖快，密度過(guò)大，同時(shí)由于納豆發(fā)酵表面產(chǎn)生黏狀物質(zhì)影響氧氣供應(yīng)，使得代謝產(chǎn)物較少。由多重比較分析結(jié)果可知，接種量4%、6%、8%、10%各因素?zé)o顯著性差異，因此在響應(yīng)面試驗(yàn)中，確定接種量為4%。

2.6.4 不同魔芋精粉添加量對(duì)納豆激酶酶活力的影響

為了確保菌體生長(zhǎng)以及積累更多的所需要的代謝產(chǎn)物，需要向納豆固態(tài)發(fā)酵中添加碳源。由圖7可知，當(dāng)魔芋精粉添加量為4%時(shí)，納豆激酶酶活力達(dá)到最大為（3 748.43±99.28） U/g。這是由于當(dāng)碳源少時(shí)，影響菌體的生長(zhǎng)及其代謝；當(dāng)碳源過(guò)量時(shí)，整個(gè)發(fā)酵體系呈現(xiàn)低pH值的狀態(tài)，影響代謝產(chǎn)物的積累。由多重比較分析結(jié)果可知，因素間存在顯著性差異。

2.6.5 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表1 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table1 Experimental design and results for Box-Behnken response surface analysis

對(duì)上述試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次回歸擬合，建立的回歸方程如下：

表2 二次響應(yīng)面模型方差分析Table2 Analysis of variance (ANOVA) for response surface quadratic mooddeell

由表2方差分析結(jié)果可看出，模型極顯著（P＝0.000 7＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P＝0.405 6＞0.05），說(shuō)明該模型擬合程度良好，可用于納豆激酶發(fā)酵工藝條件的分析和預(yù)測(cè)。對(duì)回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知，一次項(xiàng)X3、二次項(xiàng)之間的交互作用對(duì)納豆激酶酶活力的影響極顯著，X1、X2對(duì)納豆激酶酶活力的影響顯著，而X1X2、X32、X2X3之間的交互作用對(duì)納豆激 酶酶活力的影響均不顯著。

圖8 發(fā)酵溫度與魔芋精粉添加量的交互作用對(duì)納豆激酶酶活力的影響Fig.8 Interactive effects of fermentation temperature and kjonjac powder concentration on the activity of nattokinase

圖9 發(fā)酵時(shí)間與魔芋精粉添加量的交互作用對(duì)納豆激酶酶活力的影響Fig.9 Interactive effect of fermentation time and konjac powder concentration on the activity of nattokinase

圖10 發(fā)酵溫度與發(fā)酵時(shí)間的交互作用對(duì)納豆激酶酶活力的影響Fig.10 Interactive effects of fermentation temperature and time on the activity of nattokinase

根據(jù)回歸方程得出不同因素的響應(yīng)面分析圖及等高線圖結(jié)果見(jiàn)圖8～10。各參數(shù)間的等高線呈橢圓形，響應(yīng)值存在最大值。利用Design-Expert 8.0.5.0軟件求解方程最大值，當(dāng)發(fā)酵溫度為34 ℃、發(fā)酵時(shí)間為24 h、魔芋精粉添加量為5%時(shí)，納豆激酶酶活力最高為4 066.0 U/g。為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臏?zhǔn)確性，在最佳發(fā)酵條件下進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，兩次實(shí)驗(yàn)得納豆激酶酶活力平均值為（4 087.83±93.75） U/g，表明所得的模型具有一定的實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)意義。

3 結(jié) 論

采用超聲波與紫外線對(duì)枯草芽孢桿菌進(jìn)行誘變處理，超聲波處理?xiàng)l件為45 kHz、280 W，處理時(shí)間60 min，紫外線處理?xiàng)l件為照射距離為30 cm，照射時(shí)間120 s。經(jīng)平板初篩和搖床復(fù)篩，并進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，最終選育出一株產(chǎn)納豆激酶活力較高的菌株BSCZ-4。

利用響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化了納豆固態(tài)發(fā)酵工藝條件，建立了固態(tài)發(fā)酵工藝數(shù)學(xué)模型，得到了較合適的工藝條件為發(fā)酵溫度為34 ℃、發(fā)酵時(shí)間為24 h、魔芋粉添加量為5%時(shí)，納豆激酶酶活力最高為（4 087.83±93.75） U/g。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)發(fā)酵得到的納豆激酶酶活力與模型預(yù)測(cè)值4 066.0 U/g基本一致，證明該模型的可靠性良好。

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Strain Improvement of Bacillus subtilis for Enhanced Production of Nattokinase and Optimization of Solid-State Fermentation Conditions

ZHANG Jie1, GE Wupeng1,*, CHEN Ying2, ZHANG Yue3, LIU Liting3
(1. College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 2. Shaanxi Bureau of Quality and Technical Supervision, Xi’an 710068, China; 3. Shaanxi Product Quality Supervision and Inspection Research Institute, Xi’an 710068, China)

In this study, the nattokinase-producing capacity of Bacillus subtilis subsp. subtilis BS21076 was improved by sequential mutagenization with ultrasonic followed by UV light at the appropriate doses determined according to death and mutation rates. The optimal mutation conditions of strain BS21076 were established as 60 min ultrasonic treatment at 45 kHz and 280 W followed by 120 s UV irradiation at a distance of 30 cm. A high nattokinase-producing mutant strain named BSCZ-4, producing 1.96 times higher nattokinase than BS21076, was obtained after several rounds of primary and secondary screening. After 20 consecutive passages, the diameter of the zone of dissolution produced by BSCZ-4 remained stable in the range of 18–19 mm, suggesting good genetic stability. Using Box-Behnken response surface methodology, the optimal culture conditions for the enhanced production of nattokinase by BSCZ-4 in solid-state fermentation were determined as addition of 5% konjac power to the culture medium, an inoculum size of 8%, and 24 h culture at 34 ℃, resulting in a nattokinase activity of (4 087.83 ± 93.75) U/g.

mutation; Bacillus subtilis; response surface methodology; process

10.7506/spkx1002-6630-201603028

TS201.3

A

1002-6630（2016）03-0151-06

張杰, 葛武鵬, 陳瑛, 等. 納豆激酶高產(chǎn)菌株的選育及固態(tài)發(fā)酵技術(shù)[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(3): 151-156. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201603028. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Jie, GE Wupeng, CHEN Ying, et al. Strain improvement of Bacillus subtilis for enhanced production of nattokinase and optimization of solid-state fermentation conditions[J]. Food Science, 2016, 37(3): 151-156. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603028. http://www.spkx.net.cn

2015-03-19

國(guó)家重點(diǎn)星火計(jì)劃項(xiàng)目（2013GA850003）

張杰（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锛夹g(shù)。E-mail：zjzj89zjzj@163.com

*通信作者：葛武鵬（1965—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槿槠房茖W(xué)及生物技術(shù)。E-mail：josephge@sina.com