劉婷婷，喬立新，龐廣昌*

（天津商業(yè)大學生物技術與食品科學學院，天津市食品生物技術重點實驗室，天津 30013 4）

固定化大鼠小腸組織制備生物傳感器對白藜蘆醇的檢測

劉婷婷，喬立新，龐廣昌*

（天津商業(yè)大學生物技術與食品科學學院，天津市食品生物技術重點實驗室，天津 30013 4）

以海藻酸鈉-淀粉凝膠作固定劑，將Sprague-Dawley（SD）大鼠的小腸回腸組織固定到兩片核微孔膜中間制成“三明治”式傳感膜，然后將其固定到玻碳電極上制成生物傳感電極，通過電化學工作站測定出不同濃度白藜蘆醇刺激其相應受體后的響應電流。結果表明：該傳感器對白藜蘆醇的最低檢測限為1×10－13mol/L，在其濃度為8.5×10－12mol/L時電流變化率達到最大值，說明此時白藜蘆醇的受體已經被飽和。用Origin軟件對白藜蘆醇與其受體的作用曲線進行雙曲線擬合（R2＝0.988 7），然后用雙倒數(shù)法作圖求出白藜蘆醇與其受體的結合常數(shù)和解離常數(shù)分別為1.207×10－11和1.118×10－12。由此可以估測出，平均每個細胞的受體數(shù)約為85 個。通過將白藜蘆醇固定化小腸上皮組織所制成的生物傳感器的響應值和白藜蘆醇與裸電極作用的響應值比較可知，小腸組織細胞對白藜蘆醇的響應值顯然得到了細胞內信號傳遞系統(tǒng)的放大作用，其放大倍數(shù)為100 倍。與此同時，細胞受體明顯賦予該生物傳感器的可飽和性特征，表現(xiàn)為類似于酶促反應動力學-米氏方程的典型特征。通過該傳感器第一次定量化測定了白藜蘆醇與受體互作并向機體內傳遞信號的動力學規(guī)律，這將為白藜蘆醇受體分析、分離與純化、信號傳遞及其生物功能評價與研究提供新的方法。

生物傳感器；白藜蘆醇；固定化；小腸

白藜蘆醇（resveratrol）是含有芪類結構的非黃酮類多酚化合物，最早在1940年由日本人從一種植物白藜蘆（Veratrum grandiflorum）的根部分離得到。后來發(fā)現(xiàn)其廣泛存在于葡萄、虎杖、決明子和花生等天然植物或果實當中[1-3]，并且是植物遭受脅迫時產生的一種能提高植物抵抗病原性攻擊和環(huán)境惡化的植物抗毒素[4]。近些年來，國內外很多學者對白藜蘆醇的生物學功能進行了深層研究，結果表明白藜蘆醇具有抗癌、抗心血管疾病、抗突變、抗菌、抗炎、抗氧化、誘導細胞凋亡及雌激素調節(jié)等多方面有益人類健康的生物藥理活性[5-9]，因此它受到生物醫(yī)學界的廣泛重視。白藜蘆醇作為一種植物雌性激素添加劑添加到藥物或食品中，可防止女性在絕經期后體內雌性激素分泌不足而引起的一系列疾病[10]。此外，白藜蘆醇可以被用作添加劑加到酒類或化妝品中，作為一種新型美容保健品以延緩衰老、保持肌膚水分、祛除瘡類、黃褐斑等[11]。雖然現(xiàn)在白藜蘆醇作為保健品已被人們所使用，但是有關白藜蘆醇受體的研究未見報道。研究白藜蘆醇和其受體的相關規(guī)律，有助于白藜蘆醇對于機體的作用機理的研究并且能更好地發(fā)揮白藜蘆醇的保健作用，造福人類。

小腸上皮組織作為腸道內外環(huán)境的媒介及機體免疫屏障的重要組成部分，具有消化、吸收、分泌等多種生物學功能。此外，腸上皮細胞還可作為抗原提呈細胞表達多種與抗原提呈相關的分子[12]。因此本課題組推測白藜蘆醇可能正是通過和小腸上皮組織上的受體相互作用，向機體內傳遞調節(jié)信號發(fā)揮健康功能。本研究首先研制出以大鼠的小腸回腸組織為敏感元件，亦即：將小腸組織固定到兩片核微孔膜之間，然后與玻碳電極相連接（玻碳電極與電腦連接）制成生物傳感電極，當白藜蘆醇溶液與小腸組織接觸后，會引起小腸細胞超極化產生電化學變化，所以可以通過電化學工作站表征其性能和定量化測定其信號變化[13]。

傳統(tǒng)對配體受體作用規(guī)律的研究方法大多是將受體單獨純化出來進行研究，但是純化受體的過程不僅困難，而且當受體離開細胞膜之后往往失去了膜的錨定作用和一些胞內輔助因子的作用，不能真正反映受體在細胞膜上實際構象及其與配體的作用規(guī)律[14-16]，而以小腸組織作為感受器的生物傳感器，能夠很好地保持白藜蘆醇中固有受體細胞及其生物微環(huán)境，并能通過與其配基-白藜蘆醇互作，激活并傳遞生理與電化學信號。該傳感器不僅能夠真實地反映大鼠小腸感受白藜蘆醇的過程，而且充分利用了小腸上皮細胞通過受體所激活的細胞內的信號放大作用，更準確地模擬了白藜蘆醇發(fā)揮生理作用過程和規(guī)律。除此之外，通過電流變化率可以獲得白藜蘆醇的濃度與受體作用曲線，間接求出配體-受體的結合常數(shù)和解離常數(shù)，進而對其動力學進行研究[17-18]，這將為以后對配體受體的研究提供一種新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

可溶性淀粉 天津市贏達稀貴化學試劑廠；海藻酸鈉 天津市光復精細化工研究所；CaCl2、白藜蘆醇 美國Sigma公司；戊二醛 天津博迪化工股份有限公司；核微孔膜 英國Whatman公司；水為超純水。

1.2 儀器與設備

分析天平 上海精密科學儀器有限公司；Millipore Milli-Q純水 上海雅榮生化設備儀器有限公司；KQ 3200B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；LRH-70生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；CHI600E電化學工作站、三電極系統(tǒng)（玻碳電極（GCE Φ＝3 mm）、參比電極-Ag/AgCl電極、對電極-鉑絲電極） 上海辰華儀器有限公司。

1.3 動物

8～10 周齡的Sprague Dawley（SD）大鼠，體質量240～270 g，由天津市翔天科技有限公司提供。

1.4 方法

1.4.1 小腸組織的制備

取大鼠小腸中間1 cm的回腸段，洗凈內容物，用刀片將小腸段剖開為平面，取0.25 cm2的小腸平面置于生理鹽水中待用。

1.4.2 電化學生物傳感器的制備

將可溶性淀粉溶解于含1%戊二醛的水溶液中，80 ℃水浴加熱并攪拌30 min，配成一定質量濃度的淀粉溶液室溫下放置過夜，使淀粉與戊二醛得到充分的交聯(lián)獲到醛基化淀粉膠溶液。醛基化淀粉膠溶液再與一定質量濃度的海藻酸鈉溶液以1∶1體積比混合[19-21]。取上述溶液10 μL均勻涂抹于2 張直徑為25 mm、孔徑為0.22 μm的聚碳酸酯微孔膜上，將準備好的0.25 cm2的小腸組織放置于一張微孔膜的圓心上，然后將另一張覆蓋上制成三明治結構的味覺測定膜。

將制成的小腸組織膜浸入質量分數(shù)5%的CaCl2溶液中10 s后取出，使海藻酸鈉與CaCl2發(fā)生離子交換反應形成穩(wěn)定的螯合物，使海藻酸鈉溶液凝膠化成良好的固定劑[22-23]。然后用生理鹽水沖洗（去除膜上存留的Cl－、Ca2＋等）味覺測定膜。最后，用皮套將膜固定在玻碳電極頭的表面使得小腸組織與表征完的電極芯重合，則此生物傳感器便已制成。該傳感器的制作原理如圖1所示，就是當白藜蘆醇與其受體結合之后，會引發(fā)小腸細胞去極化和Ca2＋釋放并產生動作電位，該生物傳感器則是模擬生物體通過電極將電信號傳到電腦中，來顯示白藜蘆醇配體與受體的作用規(guī)律。

1.4.3 電化學生物傳感器對大鼠小腸的測定方法

采用三電極系統(tǒng)，以固定好大鼠小腸測定膜的玻碳電極為工作電極，Ag/AgCl電極作為參比電極，鉑絲電極作為對電極，以生理鹽水為測試底液，在一定的電壓下通過電流-時間測定法測定10－13～10－3mol/L白藜蘆醇的響應電流，以響應電流的變化率作為檢測指標，當測試底液的響應電流值與被測溶液的響應電流值之差接近于零時，此時的被測物質濃度為它的最低檢測限，每一濃度下平行測定3 次。計算響應電流的變化率的公式為：

式中：I1及I2分別表示白藜蘆醇被測定前后同一時間點的穩(wěn)態(tài)電流值/A。

2 結果與分析

2.1 電流-時間測定法的電位優(yōu)化

制備好的傳感器在不同電位下（測試底液為生理鹽水）用電流-時間法進行測定，以加入10－5mol/L的白藜蘆醇前后穩(wěn)態(tài)電流差來衡量不同電位對傳感器電化學響應效果的影響，以電位的相反數(shù)（－E）為橫坐標、電流差值為縱坐標作圖。如圖2所示，結果表明在－0.38 V條件下電流的變化值最大，故選定－0.38 V為恒電位進行生物傳感器對白藜蘆醇響應特性的研究。

圖2 電位對微生物傳感器響應效果的影響Fig.2 Effect of response potential on response efficiency of microorganism sensors

2.2 白藜蘆醇與其受體的作用曲線

將固定小腸組織的生物傳感器置于不同濃度的白藜蘆醇溶液中，從低濃度到高濃度做時間-電流法掃描，掃描電位選擇－0.38 V，靜置時間10 s，使受體和配基充分結合后，選擇第60秒電流值作為穩(wěn)態(tài)電流，以電流在受體-配基結合前后電流的變化率ΔI與配基的濃度作圖。因為白藜蘆醇的檢測濃度范圍很寬，不易作圖，所以將其濃度重新定義。

式中：pCa為重新定義后的白藜蘆醇的濃度；c為定義前的濃度。此式表示當pCa＝1時，白藜蘆醇的檢測濃度最小為1×10－13mol/L。以白藜蘆醇濃度的對數(shù)值為橫坐標，其響應電流的電流變化率為縱坐標作圖，如圖3曲線a所示。

圖3 白藜蘆醇的檢測濃度范圍Fig.3 Detection range of resveratrol

由于電化學生物傳感器的特性，裸電極在不同濃度的白藜蘆醇溶液中也會產生電流的變化，裸電極在白藜蘆醇溶液中的檢測濃度最小為1×10－15mol/L。為了更準確地說明白藜蘆醇與其受體的作用規(guī)律需要排除電極對不同濃度白藜蘆醇溶液的影響。因此需要用裸電極測定10－13～10－3mol/L白藜蘆醇的電流變化率。以白藜蘆醇濃度的對數(shù)值為橫坐標，其響應電流的電流變化率為縱坐標作圖如圖3曲線c所示。裸電極測定不同濃度白藜蘆醇的電流變化率呈現(xiàn)出良好的線性關系。

為了明確白藜蘆醇與受體的作用規(guī)律，如圖3曲線b（圖3曲線a與圖3曲線c相同濃度白藜蘆醇的電流變化率相減所得）所示，曲線具有可飽和性，說明回腸組織上具有白藜蘆醇的受體。比較圖3中的曲線a和c可知，白藜蘆醇通過和腸上皮組織細胞上相應受體的相互作用，通過細胞信號傳遞與放大作用，使其響應電流大大提高，并呈現(xiàn)明顯的雙曲線性質，其信號被放大了100 倍。當其濃度為1×10－11mol/L時電流變化率達到最大值，說明此時受體已經被配體飽和，當濃度再增大時電流變化率明顯下降，說明小腸組織受到反饋抑制。

2.3 白藜蘆醇受體的飽和濃度

由圖3可知，白藜蘆醇在10－13～10－11mol/L的濃度范圍內，電流的變化率呈現(xiàn)良好的線性關系。因此，在白藜蘆醇濃度為10－13～10－11mol/L的濃度范圍內，將白藜蘆醇的檢測濃度進一步細分為20 個梯度即0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0 pmol/L，以白藜蘆醇的濃度指數(shù)為橫坐標、電流的變化率為縱坐標作圖，由圖4可知，白藜蘆醇的濃度在8.5 pmol/L電流變化率達到最大值，說明受體已經被配基飽和。

圖4 白藜蘆醇在其濃度為1×1100－1133～11×1100－1111mol/L的線性關系Fig.4 Linear relationship for resveratrol and its receptor in the concentration range from 1 × 10-13mol/L to 1 × 10-11mol/L

用Origin軟件對圖4的曲線進行雙曲線擬合所得曲線如圖5，在0.1～8.5 pmol/L白藜蘆醇濃度下，響應電流值差值逐漸遞增，雙曲線擬合R2＝0.988 7，可知相關性很高，和酶與底物催化作用動力學（米氏方程）規(guī)律相似。在低濃度范圍0.1～1 pmol/L，電流變化值呈線性增長，說明配基的分子數(shù)遠遠小于相應的受體數(shù)，后一部分呈曲線說明受體被逐漸飽和。其飽和濃度為：8.5 pmol/L。由白藜蘆醇最低檢測限和最大飽和濃度可以推測平均細胞上的受體數(shù)的估測值為85 個。擬合公式為：

式中：0.571 0是最大電流變化率；0.108 9是反應達到最大電流變化率（ΔI）一半時的白藜蘆醇的濃度。

圖5 白藜蘆醇與其受體的作用規(guī)律Fig.5 Law of interaction between resveratrol and its receptor

2.4 白藜蘆醇與其受體的結合常數(shù)和解離常數(shù)

通過1.3.3節(jié)的方法組裝電極，然后將白藜蘆醇的測試濃度在1.0×10－13～8.5×10－12mol/L范圍內以遞增的趨勢設置濃度梯度，每增加一個濃度測定一次相應的穩(wěn)態(tài)電流值，根據(jù)公式（1）計算每一個濃度下響應電流的電流變化率，然后以白藜蘆醇濃度的倒數(shù)為x軸、以固定小腸測定白藜蘆醇的電流變化率減去裸電極的電流變化率的數(shù)值的倒數(shù)為y軸作圖（雙倒數(shù)法作圖），即圖6，此直線的線性回歸方程為：

根據(jù)此方程可求出白藜蘆醇與其受體相互作用的結合常數(shù)Ka＝1.207×10－11。

圖6 白藜蘆醇與其受體結合常數(shù)的測量曲線Fig.6 Curve for the measurement of binding constant between resveratrol and its receptor

然后設置相同的濃度，按照從高到底的順序依次測定此濃度下響應電流的穩(wěn)態(tài)電流值，求出電流變化率，用相同的方法作圖，即圖7，此直線的線性回歸方程為：

根據(jù)此方程可求出白藜蘆醇與其受體相互作用的解離常數(shù)Kd＝1.118×10－12。

圖7 白藜蘆醇與其受體解離常數(shù)的測量曲線Fig.7 Curve for the measurement of dissociation constant between resveratrol and its receptor

2.5 固定化大鼠小腸組織生物傳感器的穩(wěn)定性及重現(xiàn)性

將制成的生物傳感器在同一濃度的白藜蘆醇溶液中連續(xù)測定10 次，結果相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為7.34%，表明該電化學生物傳感器穩(wěn)定性能良好[24]，將該傳感器保存在4 ℃生理鹽水中。

在4 ℃生理鹽水中保存該組織傳感器，每天對同一濃度的白藜蘆醇溶液進行測定，前3 d該傳感器響應電流變化率基本恒定，第4天其電流變化率是初始電流變化率的95.1%，第5天其電流變化率僅為初始電流變化率的75.62%。表明該組織傳感器至少可穩(wěn)定保存3 d。

取不同批次制備的電化學型組織傳感器5 支，對同一濃度的白藜蘆醇溶液進行檢測，電流響應結果如表1所示，響應電流的RSD為7.966%，表明該白藜蘆醇生物傳感器重現(xiàn)性能良好。

表1 傳感器重現(xiàn)性實驗結果Table1 Reproducibility of response current measurements using the sensors

3 結 論

通過固定化大鼠小腸組織制備的生物傳感器，第一次定量化測定了白藜蘆醇與其受體的作用規(guī)律，檢測限為1×10－13mol/L，白藜蘆醇與裸電極的作用檢測限為1×10－15mol/L，擬合的雙曲線模型說明回腸組織上有白藜蘆醇的受體。通過對不同濃度白藜蘆醇的測定，可知在8.5×10－12mol/L的濃度時白藜蘆醇的電流變化率達到最大值，說明此時白藜蘆醇的受體已經被飽和，通過雙倒數(shù)作圖法求出白藜蘆醇的 結合常數(shù)和解離常數(shù)分別為1.207×10－11和1.118×10－12。白藜蘆醇與其受體的作用規(guī)律和酶與底物催化作用動力學（米氏方程）規(guī)律相似，由此可以估測出，平均每個細胞的受體數(shù)約為：85 個。通過將白藜蘆醇固定化小腸上皮組織所制成的生物傳感器的響應值和白藜蘆醇與裸電極作用的響應值比較可知，小腸組織細胞對白藜蘆醇的響應值顯然得到了細胞內信號傳遞系統(tǒng)的放大作用，其放大倍數(shù)為100 倍。與此同時細胞受體明顯賦予該生物傳感器的可飽和性特征，表現(xiàn)為類似于酶促反應動力學-米氏方程的典型特征。

該傳感器通過固定化大鼠回腸組織，模擬小腸組織的信號傳導過程，成功地實現(xiàn)了白藜蘆醇的定量化測定，探討了它與相應受體的相互作用規(guī)律，為研究受體與配體（配基）的作用規(guī)律提供了一條新的思路。與此同時該生物傳感器的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性良好，增加了實驗的準確性和可信度。但是，小腸組織的固定化是否依然對其受體和配體（配基）相互作用有影響？小腸組織經過固定化以后的信號傳導過程是否仍能真實反映小腸生理過程尚需進一步深入研究。

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Development of Biosensor Based on Immobilized Rat Small Intestine Tissues for Detecting Resveratrol

LIU Tingting, QIAO Lixin, PANG Guangchang*
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

Using sodium alginate-starch gel as a fixing agent, small intestine tissues of Sprague-Dawley rats were fixed between two nuclear micro porous membranes, forming a sandwich-type membrane, and then fixed to a glassy carbon electrode to make a biosensor electrode. By using electrochemical workstation for the detection of the response current from receptor stimulation by different resveratrol concentrations, the results showed that the lowest limit of detection of this biosensor for resveratrol was 1 × 10-13mol/L and the highest rate of change in response current w as found at the concentration of 8.5 × 10-12mol/L, indicating that the resveratrol receptor was saturated at this point. The role of resveratrol and its receptor was fitted to a hyperbolic curve with Origin software (R2= 0.988 7). It showed that the correlation is high. The binding constant and dissociation constant of resveratrol and its receptor evaluated by the double-reciprocal plot method were 1.207 × 10-11and 1.118 × 10-12, respectively. Thus the number of receptors to every cell is estimated to be about 85. By comparing response values of resveratrol biosensor immobilized on rat intestinal epithelial tissue to the interaction of resveratrol with the bare electrode, the response value of the small intestine tissue to resveratrol clearly gained amplified function of intracellular signaling system with a magnification rate of up to 100. Meanwhile, the cell receptors obviously rendered the biosensor saturabile and the typical characteristic was similar to the enzymatic reaction kinetic equation. This study for the fi rst time accomplished the quantitative determination of the interactions between resveratrol and receptors and the dynamic law of signal transmission in the body through biosensors. This will provide new methods for resveratrol receptor analysis, separation and purifi cation, signal transmission and biological function evaluation.

biosensor; resveratrol; immobilization; small intestine

10.7506/spkx1002-6630-201603022

TS202.3

A

1002-6630（2016）03-0114-06

劉婷婷, 喬立新, 龐廣昌. 固定化大鼠小腸組織制備生物傳感器對白藜蘆醇的檢測[J]. 食品科學, 2016, 37(3): 114-119. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603022. http://www.spkx.net.cn

LIU Tingting, QIAO Lixin, PANG Guangchang. Development of biosensor based on immobilized rat small intestine tissues for detecting resveratrol[J]. Food Science, 2016, 37(3): 114-119. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603022. http://www.spkx.net.cn

2015-06-05

國家自然科學基金面上項目（31371773）

劉婷婷（1990—），女，碩士研究生，研究方向為發(fā)酵工程。E-mail：1215934682@qq.com

*通信作者：龐廣昌（1956—），男，教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：pgc@tjcu.edu.cn