劉 賀，庚 平，萬(wàn) 嬌，朱丹實(shí)，何余堂，馬 濤

（1.渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 錦州 121013；2.遼寧省食品貯藏加工及質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心，遼寧 錦州 121013）

蛋白酶對(duì)豆?jié){凝膠過(guò)程微流變性質(zhì)的影響

劉 賀1,2，庚 平1，萬(wàn) 嬌1，朱丹實(shí)1,2，何余堂1,2，馬 濤1,2

（1.渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 錦州 121013；2.遼寧省食品貯藏加工及質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心，遼寧 錦州 121013）

通過(guò)微流變學(xué)方法研究了3 種蛋白酶對(duì)豆?jié){凝膠微流變性質(zhì)的影響。結(jié)果表明：3 種蛋白酶均對(duì)豆?jié){有凝膠能力，固液平衡點(diǎn)（solid liquid balance，S LB）均低于0.5，堿性蛋白酶對(duì)豆?jié){的凝膠能力相對(duì)較弱；在反應(yīng)前期，菠蘿蛋白酶的宏觀黏度指數(shù)（macroscopic viscosity index，MVI）較高，反應(yīng)后期則不同體系的MVI相接近。溫度對(duì)不同蛋白酶凝漿體系彈性因子（elasticity index，EI）的影響也有所差異，菠 蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶的EI均隨溫度的升高而提高，在70 ℃時(shí)EI值可達(dá)到最高分別為0.002 34 nm－2和0.002 75 nm－2，而溫度對(duì)堿性蛋白酶體系EI影響不明顯；菠蘿蛋白酶對(duì)豆?jié){的凝膠能力隨酶含量增加呈先增大后下降趨勢(shì)，在800 U/mL時(shí)EI最大，木瓜蛋白酶對(duì)豆?jié){的凝膠能力隨酶添加量的增加呈增大趨勢(shì)，而堿性蛋白酶對(duì)豆?jié){的凝膠能力則隨酶添加量的增加呈下降趨勢(shì)。

蛋白酶；豆?jié){；凝膠；微流變；彈性因子

近些年來(lái)，微流變技術(shù)已經(jīng)在復(fù)雜流體的微觀層面上取得了一些重大的發(fā)展，具有克服宏觀流變局限性的可能，它可以以非侵入式的方式來(lái)研究微米級(jí)的空間力學(xué)性能[12-13]，研究樣品中的黏性、彈性等性質(zhì)的變化，而且微流變數(shù)據(jù)與宏觀流變的結(jié)果具有相一致性[14-17]，此外，微流變測(cè)量實(shí)驗(yàn)中最少只需要10 μL樣品，這使得珍貴生物樣品的流變學(xué)測(cè)試和快速篩選實(shí)驗(yàn)成為可能[8]。

一些蛋白酶具有促進(jìn)大豆蛋白形成凝膠的現(xiàn)象很早就被發(fā)現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用微流變學(xué)方法來(lái)研究菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶對(duì)豆?jié){凝膠過(guò)程微流變性質(zhì)的影響，明晰不同蛋白酶對(duì)豆?jié){凝膠過(guò)程的影響。本研究比較3 種蛋白酶與豆?jié){溶液共存靜置反應(yīng)過(guò)程中體系微流變性質(zhì)的變化，并比較不同蛋白酶之間酶促大豆蛋白形成凝乳過(guò)程的差異，以期為我國(guó)利用豆?jié){凝固酶開(kāi)發(fā)新型的乳制品研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆 黑龍江產(chǎn)地優(yōu)質(zhì)大豆。

菠蘿蛋白酶（酶活力為500 000 U/g）、木瓜蛋白酶（酶活力為650 000 U/g） 南寧龐博生物工程有限公司；堿性蛋白酶（酶活力為200 000 U/g） 北京鴻潤(rùn)寶順科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

微流變儀 法國(guó)Formulaction公司；MS105UD電子分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司；DK-98-ⅡA電熱恒溫水槽 天津市泰斯特儀器有限公司。

從表4和圖8～圖9中可以看出，基于WV-CNN的語(yǔ)義相似度計(jì)算模型明顯優(yōu)于基于字面匹配的語(yǔ)義相似度計(jì)算模型LCS和TF-IDF，在Accuracy、F1、AUC、KS值的評(píng)價(jià)指標(biāo)上均有較大幅度的提高。LCS與TF-IDF在Accuracy、F1兩個(gè)指標(biāo)上相同，而TF-IDF的AUC值低于LCS的AUC值并且差距較大；在WV-CNN模型中，SGD優(yōu)化器的效果優(yōu)于RMSProp優(yōu)化器，準(zhǔn)確率隨著訓(xùn)練集數(shù)據(jù)量的增加而增加。

1.3 方法

1.3.1 豆?jié){的制備

挑選優(yōu)質(zhì)大豆，稱取一定量大豆，清洗后加3 倍蒸餾水于室溫下浸泡12 h，然后用干豆總質(zhì)量6 倍的水磨漿（磨漿所用的水量扣除干豆所吸收的水分），得到的生漿經(jīng)200 目濾布雙層過(guò)濾2 次，之后加熱到95 ℃保持10 min，然后迅速放入冰水中冷卻，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 蛋白酶促使豆?jié){產(chǎn)凝膠能力的比較

向預(yù)熱好的豆?jié){中分別加入400 U/mL的蛋白酶，攪拌均勻，然后將豆?jié){加入到樣品池中，進(jìn)行微流變性質(zhì)測(cè)定。微流變分析參數(shù)設(shè)定：樣品體積：20 mL；溫度：60 ℃；分析時(shí)長(zhǎng)：200 min，通過(guò)Rheolaser直接測(cè)定彈性因子（elasticity index，EI）、固液平衡點(diǎn)（solid liquid balance，SLB）、宏觀黏度指數(shù)（macroscopic viscosity index，MVI）。

1.3.3 溫度對(duì)豆?jié){凝膠體系EI的影響

向預(yù)熱好的豆?jié){中分別加入400 U/mL的蛋白酶，攪拌均勻，然后將20 mL豆?jié){加入到樣品池中，樣品池溫度分別設(shè)定30、40、50、60、70 ℃，跟蹤時(shí)長(zhǎng)200 min，通過(guò)Rheolaser直接測(cè)定EI值。

1.3.4 酶添加量對(duì)豆?jié){凝膠體系EI的影響

向預(yù)熱好的豆?jié){中分別加入200、400、600、800、 1 000、1 200 U/mL的蛋白酶，攪拌均勻，然后將20 mL豆?jié){加入到樣品池中，樣品池溫度設(shè)定60 ℃，分析時(shí)長(zhǎng)200 min，通過(guò)Rheolaser直接測(cè)定EI值。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶促使豆?jié){產(chǎn)凝膠能力的比較

凝膠過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的反應(yīng)體系[18]，EI的計(jì)算是一種快速、簡(jiǎn)便地表征一個(gè)樣品的彈性性能的方法。由圖1a可知，初始階段，豆?jié){蛋白酶體系中的EI在裝樣后有明顯的增加，這是它對(duì)裝樣過(guò)程中所施加剪切的敏感反應(yīng)，隨后在蛋白酶的作用下，體系的EI呈緩慢下降趨勢(shì)，木瓜蛋白酶豆?jié){體系在45 min左右最先達(dá)到平衡體系，菠蘿蛋白酶豆?jié){體系在30 min左右開(kāi)始呈上升趨勢(shì)，在200 min時(shí)達(dá)到EI最大值為0.001 62 nm－2，堿性蛋白酶豆?jié){體系在25 min時(shí)開(kāi)始呈緩慢上升趨勢(shì)，200 min時(shí)EI值為0.001 28 nm－2，從圖1a還可看出，在70 min內(nèi)，木瓜蛋白酶豆?jié){體系EI值較大，菠蘿蛋白酶豆?jié){體系和堿性蛋白酶豆?jié){體系EI值下降明顯且較小，這可能是因?yàn)樵诜磻?yīng)期間木瓜蛋白酶凝固豆?jié){的能力相對(duì)要大于其對(duì)蛋白的水解能力，所以EI值下降緩慢，相對(duì)其他體系較高。由于蛋白質(zhì)肽鏈的水解是豆?jié){凝固的前提[19]，蛋白酶作用使肽鏈斷裂，蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，隨后斷裂的肽鏈在酶的作用下重新結(jié)合[20]，并相互以疏水作用結(jié)合形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，而堿性蛋白酶和菠蘿蛋白酶在相同反應(yīng)條件下，初期水解能力有限，大豆蛋白水解程度較低，未能達(dá)到使豆?jié){形成凝膠的最佳展開(kāi)程度，所形成凝膠強(qiáng)度不夠高[21]，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，體系能夠形成一定強(qiáng)度的凝膠，EI值增加明顯，尤其菠蘿蛋白酶豆?jié){體系EI值明顯增加，說(shuō)明在后期菠蘿蛋白酶對(duì)豆?jié){的凝膠能力要高于木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶對(duì)豆?jié){的凝膠能力。

圖1b是3 種蛋白酶凝豆?jié){過(guò)程中SLB的變化，前面實(shí)驗(yàn)主要討論豆?jié){凝膠的彈性，即樣品所具有的固態(tài)特征隨時(shí)間的變化，固液平衡點(diǎn)所給出的是豆?jié){凝膠在固化過(guò)程中的每個(gè)時(shí)間所具有固態(tài)和液體特征的比值，當(dāng)SLB＜0.5時(shí)，表明樣品偏向固態(tài)。從圖1b可以看到，這個(gè)比值一直在降低，在25 min時(shí)，3 種體系均達(dá)到固態(tài)特性，表明3 種蛋白酶均有凝固豆?jié){的能力，但是菠蘿蛋白酶豆?jié){體系其最終SLB值很低，在200 min時(shí)SLB為0.157 36，說(shuō)明樣品的凝膠強(qiáng)度較大，堿性蛋白酶豆?jié){體系SLB值相對(duì)較高，在200 min時(shí)為0.298 14，則體系凝膠強(qiáng)度較弱。

由圖1c可知，菠蘿蛋白酶豆?jié){體系和木瓜蛋白酶豆?jié){體系在初期均有較高的宏觀黏度指數(shù)，不同的是，菠蘿蛋白酶豆?jié){體系在100 min內(nèi)，宏觀黏度指數(shù)有稍微下降的趨勢(shì)，在120 min時(shí)突然下降，而后又呈輕微的上升趨勢(shì)，在200 min時(shí)MVI為0.003 11 s/nm2，分析原因可能是前期豆?jié){在蛋白酶的作用下形成弱凝膠，在100 min之后，蛋白被過(guò)度水解，使MVI下降。而木瓜蛋白酶豆?jié){體系在25 min時(shí)突然下降，后期體系的宏觀黏度指數(shù)基本保持不變?yōu)?.002 19 s/nm2，說(shuō)明木瓜蛋白酶在作用25 min時(shí)酶解能力已經(jīng)超過(guò)自身的凝膠能力，堿性蛋白酶豆?jié){體系MVI值整體隨著時(shí)間的變化有輕微的上升趨勢(shì)，但不明顯，在200 min時(shí)取得最大值為0.002 98 s/nm2，表明堿性蛋白酶對(duì)豆?jié){的酶解能力與凝膠能力基本保持平衡。

圖1 3種蛋白酶對(duì)豆?jié){體系EI（a）、SLB（b）、MVI（c）的影響Fig.1 Effects of three proteases on EI (a), SLB (b), MVI (c) of soybean milk system

2.2 溫度對(duì)豆?jié){凝膠體系EI的影響

圖2 溫度對(duì)豆?jié){凝膠體系EI的影響Fig.2 Effect of temperature on EI of soybean milk system

由圖2可知，菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶對(duì)溫度比較敏感，而溫度對(duì)堿性蛋白酶凝膠效果影響不明顯。圖2a表明在凝膠溫度為30、40 ℃和50 ℃時(shí)，菠蘿蛋白酶豆?jié){體系的EI值變化不明顯，呈現(xiàn)較為平穩(wěn)的狀態(tài)，在凝膠溫度為60 ℃和70 ℃時(shí)，EI值上升較快，且70 ℃最明顯，EI值最大。同樣，木瓜蛋白酶豆?jié){體系（圖2b）在30～60 ℃時(shí)，體系EI值并沒(méi)有明顯的增加趨勢(shì)，且在50 ℃時(shí)，EI值有輕微的下降趨勢(shì)，在70 ℃時(shí)，EI值增加明顯。這主要是因?yàn)椴ぬ}蛋白酶適宜酶解溫度范圍為40～60 ℃，適宜凝豆?jié){溫度范圍在70～80 ℃，而木瓜蛋白酶最適凝膠溫度較其他蛋白酶高（一般為70～90 ℃），當(dāng)溫度較高時(shí)，大豆蛋白暴露出更多的疏水基團(tuán)，有利于豆?jié){膠凝作用，其凝固機(jī)理與菠蘿蛋白酶相似[22]，但在70 ℃，200 min時(shí)木瓜蛋白酶凝膠的體系EI值（0.002 75 nm－2）要高于菠蘿蛋白酶凝膠體系的EI值（0.002 34 nm－2）。如圖2c所示，在初始階段，由于EI對(duì)裝樣過(guò)程中所施加剪切的敏感，EI值急劇上升，在溫度較低時(shí)（30～50 ℃）更為明顯，隨后又下降呈平穩(wěn)的趨勢(shì)，溫度對(duì)堿性蛋白酶凝膠的效果相對(duì)影響很小[23]，且凝膠效果整體較弱。

2.3 酶添加量對(duì)豆?jié){凝膠體系EI的影響

圖3 酶添加量對(duì)豆?jié){凝膠體系EI的影響Fig.3 Effect of protease dosage on EI of soybean milk system

由圖3a可知，體系隨著菠蘿蛋白酶酶添加量的增加EI值逐漸增加，其中在200 U/mL時(shí)體系EI最小且無(wú)明顯增長(zhǎng)趨勢(shì)，在800 U/mL時(shí)，體系EI值增加量最大，在200 min時(shí)EI值為0.002 53 nm－2，隨著酶添加量的增加，體系EI值又顯著下降，在1 200 U/mL時(shí)最為明顯，這是因?yàn)楫?dāng)?shù)鞍酌讣尤肓枯^小時(shí)，未能達(dá)到形成凝膠的最佳展開(kāi)程度，所形成凝膠強(qiáng)度較弱，當(dāng)酶添加量過(guò)大時(shí)，大豆蛋白降解成短肽速率過(guò)快，不能形成很好的凝膠，而在酶加入量適中時(shí)，大豆蛋白酶解和展開(kāi)并形成凝膠同時(shí)進(jìn)行，形成凝膠較好[24]。圖3b表明體系EI值隨著木瓜蛋白酶添加量的增加有所增大，在200 U/mL時(shí)EI值在0.001 0 nm－2左右，在1 200 U/mL時(shí)EI值在0.002 5 nm－2左右，且鐘芳等[25]研究表明，木瓜蛋白酶誘發(fā)大豆蛋白形成凝膠的強(qiáng)度相對(duì)較強(qiáng)。從圖3c中可以看出，體系EI值隨著堿性蛋白酶添加量的增加呈下降趨勢(shì)，200 U/mL體系的EI值較大，在0.002 0 nm－2左右，1 200 U/mL體系EI值最低，在0.000 7 nm－2左右，說(shuō)明隨著堿性蛋白酶添加量的增加，體系的酶解能力將遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)凝膠能力，則凝膠強(qiáng)度越來(lái)越小。從圖3還可以看出，3 種蛋白酶豆乳體系的EI值之間也有所差別，這主要是因?yàn)樵谙嗤磻?yīng)條件下，不同蛋白酶有不同的酶解程度，且酶解程度跟體系的反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間及酶添加量的不同而不同。

3 結(jié) 論

酶法凝固豆乳能夠獲得較好的凝塊，口感細(xì)膩，條件較鹽類凝固溫和，容易控制，目前國(guó)內(nèi)利用微流變技術(shù)考察菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶對(duì)豆?jié){凝膠過(guò)程的影響相關(guān)研究較少，本研究表明，3 種蛋白酶均有凝固豆乳的能力，但木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶對(duì)豆?jié){有較好的凝膠能力，通過(guò)升高溫度可以提高豆?jié){體系的凝膠強(qiáng)度，而最終豆?jié){體系的黏度指數(shù)則相近，可以考慮利用木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶作為豆?jié){的凝固劑，開(kāi)發(fā)具有一定強(qiáng)度、黏度及持水性的新型豆乳凝膠產(chǎn)品。

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Effects of Proteases on Microrheological Characteristics of Soymilk Gel

LIU He1,2, GENG Ping1, WAN Jiao1, ZHU Danshi1,2, HE Yut ang1,2, MA Tao1,2
(1. Food Safety Key Laboratory of Liaoning Province, College of Chemistry, Chemical Engineering and Food Safety, Bohai University, Jinzhou 121013, China; 2. Engineering and Technology Research Center of Food Preservation, Processing and Safety Control of Liaoning Province, Jinzhou 121013, China)

In this research, effects of proteases (bromelain, papain and alcalase) on microrheological characteristics of soymilk gel were explored. The results showed that all three proteases had the capacity to coagulate soybean milk, while the curding capacity of alacase was weak. At the early stage of curding, the MVI (macro viscosity index) of bromelainsoybean milk system was higher, while the MVI values of different s ystems became similar with prolonging reaction time. Temperature in the range of 30–70 ℃ played an important role in EI (elasticity index) of soymilk gel systems containing different proteases. The EI of gel systems induced by bormelain or papain addition showed an enhancing trend with increasing temperature to reach the maximum level of 0.002 34 and 0.002 75 nm-2, respectively, but temperature did not obviously affect the EI of soymilk system added with alaclase. The curding capacity of bromelain increased to the maximum level of EI at 800 U/mL followed by a decrease with increasing protease dosage in the range of 200–1 200 U/mL. Papain showed an increased curding capacity as its dosage increased, while alcalase showed a downward trend.

protease; soybean milk; gel; microrheological characteristics; elasticity index

10.7506/spkx1002-6630-201603001

TS201.7

A

1002-6630（2016）03-0001-05

劉賀, 庚平, 萬(wàn)嬌, 等. 蛋白酶對(duì)豆?jié){凝膠過(guò)程微流變性質(zhì)的影響[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(3): 1-5. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603001. http://www.spkx.net.cn

LIU He, GENG Ping, WAN Jiao, et al. Effects of proteases on microrheological characteristics of soymilk gel[J]. Food Science, 2016, 37(3): 1-5. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603001. http://www.spkx.net. cn

2015-03-31

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31471621）；國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31201385）；遼寧省高等學(xué)校優(yōu)秀人才支持計(jì)劃項(xiàng)目（LR2014034）

劉賀（1979—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称反蠓肿拥慕Y(jié)構(gòu)與功能及其修飾。E-mail：liuhe2069@163.com