蔣燕鋒，潘心禾，朱 虹，劉躍鈞

(麗水市林業(yè)科學研究院，浙江麗水 323000)

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基于AFLP標記的不同群體厚樸遺傳多樣性分析

蔣燕鋒，潘心禾，朱 虹，劉躍鈞

(麗水市林業(yè)科學研究院，浙江麗水 323000)

[目的]探討厚樸種源間、種源內(nèi)家系及家系內(nèi)個體間的遺傳多樣性，為厚樸良種選育提供理論依據(jù)。[方法]采用AFLP分子標記技術(shù)，分析來自湖北、廣西和浙江的厚樸種源間、半同胞家系間及家系內(nèi)單株間的遺傳多樣性。[結(jié)果]3個種源材料遺傳距離為0.048 2～0.128 4，廣西資源和浙江景寧2個群體相似性較高。種群遺傳多樣性平均水平、總種群基因多樣度、基因流分別為0.203 5、0.254 1、3.421 7。觀測等位基因數(shù)和有效等位基因數(shù)平均數(shù)分別為1.658 3和1.341 4；Nei’s基因多樣性和Shannon多樣性指數(shù)均值分別為0.203 5和0.308 7，其中湖北五峰的遺傳多樣性水平最高(為0.225 8)，浙江景寧遺傳多樣性水平最低(為0.173 9)。湖北五峰、廣西資源、浙江景寧家系內(nèi)遺傳多樣性分別為0.264 4、0.181 9、0.173 8，Shannon多樣性指數(shù)為0.415 4。[結(jié)論]湖北五峰種源遺傳多樣性水平最高，湖北五峰家系內(nèi)的遺傳多樣性最豐富，存在較大的遺傳分化。不同種源內(nèi)家系之間的多樣性指數(shù)及信息指數(shù)相差不多，說明在各自的生態(tài)環(huán)境中的變異水平相近。在厚樸良種選育過程中應充分重視優(yōu)良種源、優(yōu)良家系與優(yōu)良單株的配合選擇。

AFLP；厚樸；群體；遺傳多樣性

厚樸為木蘭科植物厚樸(Magnoliaofficinalis)或凹葉厚樸(Magnoliaficinalisvar.biloba)的干燥干皮、枝皮和根皮[1]，是我國特有的珍貴傳統(tǒng)中藥材，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，歷代本草均有收載，味苦辛，性溫，具有溫中理氣、散滿消脹、燥濕消積等功效。前者主要分布于四川、湖北等省，稱為“川樸”，其葉型為小凸尖葉；后者主產(chǎn)于廣西、福建等省，稱為“溫樸”，其葉型為凹葉。兩者之間還有許多在葉形上呈中間狀態(tài)的過渡類型。AFLP 分子標記技術(shù)具有分辨率高、穩(wěn)定性好、效率高等優(yōu)點[2-3]，在樹木的種質(zhì)資源鑒定、群體遺傳多樣性研究、親緣關系研究等方面得到了廣泛的應用[4-7]，在厚樸種質(zhì)遺傳多樣性研究方面有較多應用[8]，分子標記輔助選擇為育種工作提供了極大方便，可顯著提高育種選擇的效率與育種預見[9-10]。劉文生等[11]采用RAPD分子標記技術(shù)獲得厚樸指紋圖譜用于中藥材厚樸及其偽品、混淆品等的鑒別。楊紅兵等[12]采用ISSR分子標記技術(shù)對厚樸基因組DNA進行PCR擴增，構(gòu)建了湖北恩施產(chǎn)厚樸的ISSR指紋圖譜。余盛賢等[13]對厚樸與凹葉厚樸15個居群應用2個葉綠體基因間序列psbA-trnH和trnL-trnF進行PCR擴增及群體遺傳學研究，得出厚樸與凹葉厚樸在遺傳上已出現(xiàn)遺傳分化的趨勢，但尚未完全分化成彼此獨立的單系。目前，利用AFLP分子標記研究厚樸種質(zhì)資源群體層次變異規(guī)律的研究未見相關報道，為此，筆者運用AFLP分子標記探討厚樸種源間、種源內(nèi)家系及家系內(nèi)個體間的多層次遺傳多樣性，以期為厚樸良種選育提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1供試材料于2014年9月下旬至10月上旬(厚樸種子成熟期)，分別收集湖北省五峰縣灣譚鎮(zhèn)、廣西省資源縣銅座鄉(xiāng)、浙江省景寧縣外舍鄉(xiāng)3個分別代表小尖葉型、中間型及凹葉型厚樸的半同胞家系種子，其中浙江景寧種源12個，其余為15個。種子去掉外種皮后濕沙混藏。次年初春，于前作為水稻的試驗圃地育苗成苗，現(xiàn)采嫩葉用于分子試驗。種源間、家系間AFLP分析的材料為每個家系隨機選擇5個樣本做混合樣，家系內(nèi)單株間AFLP分析的材料隨機選擇H8、G8、Z12，每個家系隨機抽取30株植株。

1.2方法以建立及優(yōu)化的厚樸AFLP分子標記體系為試驗方法[14]，擴增條帶的有無分別用1和0來表示，建立0/1基本數(shù)據(jù)矩。用NTSYS軟件按平均數(shù)聚類法最后用UPGMA法進行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)樹狀圖；應用POPGENE32軟件，計算厚樸不同群體Nei’s基因多樣性指數(shù)(h)、Shannon多樣性指數(shù)(I)、種群內(nèi)基因多樣度(Hs)、總種群基因多樣度(Ht)、遺傳分化系數(shù)(Gst)以及基因流指數(shù)[Nm=0.5(1-Gst)/Gst]等。

2　結(jié)果與分析

2.1厚樸種源間、家系間的分子遺傳多樣性從64個選擇性擴增引物組合中篩選出多態(tài)性較明顯、條帶清晰的10個引物組合用于AFLP分析，共擴增出577個位點，平均每個引物組合擴增出57.7個位點，DNA片斷大小分布在0.2～1.0 kb，其中178個位點具有多態(tài)性，約占總數(shù)的30.84%，每個引物檢測到的多態(tài)性位點為17.8個(表2)。

表1　參試厚樸種質(zhì)基本情況

表2　AFLP引物的擴增結(jié)果

采用軟件POPGENE32對178個多態(tài)性位點進行分析，得到3個種源材料的聚類圖(圖1)。在相似性系數(shù)為0.953時廣西資源和浙江景寧2個群體能聚于一類，相似性較高，而湖北獨自一類。廣西資源種群與浙江景寧種群遺傳距離僅為0.048 2，廣西資源種群與湖北五峰種群遺傳距離最遠，為0.128 4。

注：pop1為湖北五峰；pop2為廣西資源；pop3為浙江景寧。Note：pop1.Wufeng，Hubei；pop2.Ziyuan，Guangxi；pop3.Jinning，Zhejiang.圖1　不同群體厚樸聚類分析圖Fig.1　Cluster analysis of different populationsof Magnolia officinalis

表3所示為3個種源厚樸的遺傳多樣性參數(shù)。觀測等位基因數(shù)和有效等位基因數(shù)平均數(shù)分別為1.658 3(1.512 5～ 1.187 5)和1.341 4(1.298 3～1.375 4)；Nei’s基因多樣性(h)和Shannon多樣性指數(shù)(I)均值分別為0.203 5(0.173 9～ 0.225 8)和0.308 7(0.260 9～0.348 3)，其中湖北五峰的遺傳多樣性水平最高(h=0.225 8)，浙江景寧遺傳多樣性水平最低(h=0.173 9)。此外從總體上來看，觀測等位基因數(shù)和有效等位基因數(shù)分別為1.975 0和1.420 8，Nei’s基因多樣性和Shannon多樣性指數(shù)分別為0.254 1和0.393 5。

表3　不同群體厚樸遺傳多樣性參數(shù)

根據(jù)種群遺傳多樣性平均水平Hs(0.203 5)和總種群基因多樣度HT(0.254 1)，計算種群間遺傳變異在總遺傳變異中所占比例，即Gst=1-Hs/HT=0.199 1，可知，種群間的遺傳分化小于種群內(nèi)家系間的遺傳分化，即在總遺傳變異中，有19.91%的遺傳變異存在于種群間，80.09%的變異存在于種群內(nèi)。種群間的基因流動較大，基因流Nm=3.421 7，結(jié)果表明種群間可能存在連續(xù)分布區(qū)域，群體間存在一定程度上的基因交流，如近些年由于厚樸人工林的營造，不同種質(zhì)的引入在一定程度上也影響著當?shù)胤N質(zhì)的遺傳變異。可見，基于AFLP分子標記的研究，屬小凸尖型的湖北種源獨自歸類，中間型的浙江景寧種源與凹葉型的廣西資源種源歸一類。說明不同種源的厚樸具有一定的遺傳穩(wěn)定性，但也存在遺傳分化，特定的遺傳基礎決定了相應的表型性狀。

運用NTsys軟件按類平均數(shù)聚類法(UPGMA)對湖北五峰(15個)、廣西資源(15個)和浙江景寧(12個)的42個家系進行聚類，得到UPGMA系統(tǒng)樹(圖2)。其中16號、9號以及7號和19號家系相對于其他材料遺傳距離較遠，在遺傳基礎方面有較大差異；而剩下的，在相似系數(shù)0.77處，可聚為2類，1號和6號歸為一類后，其余形成一類。

圖2　42個家系的聚類圖Fig.2　Dendrogram of 42 families

注：1～15：湖北鶴峰；16～30：廣西資源；31～42：浙江景寧。Note：1-15.Hefeng，Hubei；16-20.Ziyuan，Guangxi；31-42.Jinning，Zhejiang.圖3　各樣品的三維坐標散點圖Fig.3　Three-dimensional coordinates of each sample plot

對供試樣品的原始矩陣進行主坐標分析，3個坐標的貢獻值分別為18.24%、7.67%和6.26%，再對各樣品分別做三維圖排序，結(jié)果見圖3。圖3表明，1～13號比較緊湊地分布于最右側(cè)，14～42號相對分散分布，但總體上還是按種源即16～30號、31～42號集合分布，除了14號、15號位于16～30號及31～42號群體中間，14號靠近廣西資源群體(16～30號)，15號接近浙江景寧群體(31～42號)，而總體上來看，由左到右分別為廣西與浙江，然后是湖北種源，基本與NTSYS獲得的遺傳聚類樹相對應。湖北種源內(nèi)家系間遺傳多樣性為h=0.225 8，Shannon信息指數(shù)I=0.348 3，說明湖北五峰種源內(nèi)家系間的遺傳多樣性豐富，遺傳多樣性比較高；廣西資源種源內(nèi)家系間的遺傳多樣性為h=0.207 4，Shannon信息指數(shù)I=0.317 0；浙江景寧種源內(nèi)家系間遺傳多樣性為h=0.173 8，Shannon信息指數(shù)I=0.260 9，表明浙江景寧種源內(nèi)遺傳變異程度較低。

2.2家系內(nèi)單株間的遺傳差異從64個選擇性擴增引物組合中篩選出多態(tài)性較明顯、條帶清晰的12個引物組合用于AFLP分析，共擴增出608個位點，平均每個引物組合擴增出50.7個位點，DNA片斷大小分布在0.2～1.0 kb，其中225個位點具有多態(tài)性，約占總數(shù)的37.00%，每個引物檢測到的多態(tài)性位點為18.8個(表4)。

運用NTsys軟件按類平均數(shù)聚類法對湖北資源H8家系、廣西資源G8家系及浙江景寧Z12家系30個單株進行聚類分析，通過軟件計算得到H8家系內(nèi)遺傳多樣性為h=0.264 4，Shannon信息指數(shù)I=0.415 4，說明湖北五峰種源家系內(nèi)的遺傳多樣性豐富，遺傳多樣性比較高；廣西資源種源家系內(nèi)個體間的遺傳多樣性為h=0.181 9，Shannon信息指數(shù)I=0.317 0；浙江景寧種源內(nèi)家系個體間遺傳多樣性為h=0.173 8，Shannon信息指數(shù)I=0.308 9，表明浙江景寧種源內(nèi)遺傳變異程度較低，湖北五峰遺傳多樣性水平最高，家系內(nèi)都存在著較大的遺傳分化，具有較豐富的遺傳多樣性。

表4　AFLP引物的擴增結(jié)果

3　結(jié)論與討論

生物群體遺傳多樣性的存在一定程度上代表了種群的適應策略，可以說某物種的多樣性水平高，適應環(huán)境變化的能力就強。同時對厚樸種源間，種源內(nèi)家系間及家系內(nèi)個體間的遺傳多樣性分析表明，湖北五峰種源遺傳多樣性水平最高，在分子水平證實了質(zhì)量好的種源厚樸遺傳變異更為豐富，對某些類型的異質(zhì)環(huán)境適應能力較強；不同種源內(nèi)家系之間的多樣性指數(shù)及信息指數(shù)相差不多，說明在各自的生態(tài)環(huán)境中的變異水平相近；湖北五峰家系內(nèi)的遺傳多樣性最豐富，存在著較大的遺傳分化。

形態(tài)特征上，一定程度上可以說浙江種源是類似于其他2個種源的中間類型，而浙江種源厚樸與廣西種質(zhì)相似性更高。試驗采用主坐標分析和系統(tǒng)聚類分析所獲得的結(jié)果基本一致，都體現(xiàn)出與形態(tài)分類上相一致的結(jié)果，且在聚類分析提供豐富的數(shù)量信息、清楚地體現(xiàn)不同種源厚樸差異的基礎上，主坐標分析又從多個不同層面提供更多的關于不同群體之間關系的信息，更加直觀地揭示種源間的差異及遺傳變異，表明總體上遺傳聚類與群體形態(tài)類型相符合，驗證了遺傳基礎決定性狀表型。厚樸種源間遺傳多樣性豐富，種源內(nèi)個體間的遺傳差異更大。在分子水平證實厚樸優(yōu)良種源內(nèi)優(yōu)良單株的選擇顯得更加重要與迫切。因此，在厚樸良種選育過程中應充分重視優(yōu)良種源、優(yōu)良家系與優(yōu)良單株的配合選擇。

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AFLP Analysis on Genetic Diversity ofMagnoliaofficinalisfrom Different Groups

JIANG Yan-feng, PAN Xin-he, ZHU Hong et al

(Lishui Academy of Forestry, Lishui, Zhejiang 323000)

[Objective]The aim was to investigate the genetic diversity ofMagnoliaofficinalisfrom different provenances,families and individuals, provide a theoretical basis for breeding. [Method]Amplified fragment length polymorphism(AFLP) was used to evaluate the genetic diversity ofMagnoliaofficinalisfrom Hubei, Guangxi and Zhejiang among different provenances, families, individuals.[Result]The genetic distance between the 3 provenances was 0.048 2-0.128 4, and the similarity between Guangxi and Zhejiang was higher than Hubei. The average level of population genetic diversity, total population gene diversity, gene flow were 0.203 5, 0.254 1, 3.421 7. The average number of observed alleles and effective alleles were 1.658 3 and 1.341 4; Nei’s and Shannon diversity index were 0.203 5 and 0.308 7.The genetic diversity level of Hubei was the highest (0.225 8), Zhejiang Jingning was the lowest (0.173 9). The genetic diversity in families were 0.264 4, 0.181 9 and 0.173 8, Shannon diversity index was 0.415 4. [Conclusion]The genetic diversity of Hubei Wufeng was the highest, and so was the genetic diversity among individuals. The diversity index and information index among different provenances were close which indicate that the variation level of the different species in families was similar in the respective ecological environment. It should be payed full attention to the selection of superior provenances,families and superior individuals in the process of breeding ofMagnoliaofficinalis.

AFLP;Magnoliaofficinalis;Groups;Genetic diversity

蔣燕鋒(1984- )，浙江嘉興人，工程師，碩士，從事中藥材資源及開發(fā)利用研究。

2016-07-13

S 567

A

0517-6611(2016)27-0131-04