黃宗華
(廣東培正學院,廣東廣州 510830)
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七葉一枝花種子萌發(fā)和組織培養(yǎng)
黃宗華
(廣東培正學院,廣東廣州 510830)
[目的]研究七葉一枝花種子萌發(fā)的最適赤霉素(GA3)濃度和組織培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基。[方法]采用不同濃度GA3處理種子,研究促進種子快速萌發(fā)且萌發(fā)率高的GA3濃度,再將胚根3~4 cm長的種子播于土壤中,分別在光照培養(yǎng)箱和自然條件下生長并觀察第一片葉的長勢。采用不同濃度的6-BA誘導愈傷組織,研究愈傷組織誘導的適宜6-BA濃度。[結果]150 mg/L GA3處理種子的萌發(fā)率最高,種子外植體最合適的愈傷組織誘導培養(yǎng)基為添加0.1 mg/L 6-BA和0.5 mg/L NAA的 1/2MS基本培養(yǎng)基。[結論]七葉一枝花種子的快速萌發(fā)方法是可行的。
七葉一枝花;種子;萌發(fā)率;愈傷組織
七葉一枝花(Parispolyphylla)為百合科重樓屬多年生草本植物,別名重樓、草河車、七葉蓮等,主要分布于江西、浙江、廣東、四川、貴州等省。七葉一枝花以根莖入藥,具有清熱解毒、消腫止痛等功效,多用于治療無名腫毒和毒蛇咬傷,以及流行性腮腺炎、扁桃體炎、咽喉腫痛等。七葉一枝花種子具有明顯的后熟特點,胚需要休眠完成后熟才能萌發(fā),在自然條件下經(jīng)過2個冬天才能出土成苗,且成苗率較低[1]。七葉一枝花種子繁殖的關鍵是打破其休眠,促進生理后熟,使其快速出苗。層積、低溫、赤霉素(GA3)和聚乙二醇(PEG)均能提高種子的萌發(fā)率,打破種子的休眠期,縮短種子出苗時間。
獲得良好的胚性愈傷組織是七葉一枝花組織培養(yǎng)成功的關鍵因素。影響七葉一枝花愈傷組織誘導和培養(yǎng)條件的因素主要包括外植體的選擇及預處理、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件及植物激素等。雖然國外學者對延齡草屬植物的組織培養(yǎng)獲得了成功,誘導出小根莖,但在培養(yǎng)過程中無法誘導出愈傷組織[2]。筆者研究七葉一枝花種子萌發(fā)和組織培養(yǎng),以期為其大規(guī)模生產(chǎn)提供技術支撐。
1.1試驗材料供試七葉一枝花成熟種子采集于云南大理,經(jīng)中南民族大學劉學群教授鑒定后置于冰箱的密封塑料袋內使其腐爛,用水流強的自來水洗去穎殼,用手搓揉種子外種皮并用細孔篩篩去紅色漿果的外種皮,余下白色種子,晾干后人工除殘留物,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2種子萌發(fā)試驗
1.2.1浸種處理。用不同濃度赤霉素(GA3)浸泡七葉一枝花種子24 h,以蒸餾水作為對照,置于20 ℃培養(yǎng)箱。24 h后倒掉溶液,用自來水沖洗種子,直至洗凈殘留液體為止,再用蒸餾水沖洗,無菌條件下處理種子。
1.2.2無菌處理。在超凈工作臺內,用無菌水沖洗種子3~5次,然后使用75%乙醇消毒30 s(乙醇回收利用),無菌水沖洗3~5次,再用0.1%HgCl2浸泡10~15 min(乙醇回收,集中處理),無菌水沖洗3~5次,最后置于無菌的150 mm帶濾紙的培養(yǎng)皿內培養(yǎng)。
1.2.3培養(yǎng)條件。將種子按一定比例埋藏于基質濕沙中,然后將其置于4 ℃下處理60 d,再將溫度調至18~20 ℃放置90 d,再調至低溫(6~8 ℃)放置60 d,后置于20~22 ℃處理60 d,然后播種在土壤中萌發(fā),留一個缽子的種子繼續(xù)濕沙層積。種子萌發(fā)的標志以胚根剛突破種皮作為標準,萌發(fā)率=萌發(fā)的種子數(shù)/種子總數(shù)×100%[3]。
1.2.4試驗設計。GA3濃度為100、150和600 mg/L,對照為相同體積的雙蒸水。采用單因素設計,3次重復,每次取100粒種子。
1.3種子的組織培養(yǎng)
1.3.1培養(yǎng)基的準備。基本培養(yǎng)基為1/2MS,添加不同濃度的6-BA(0.1、0.5、0.7、1.0、1.4和2.0 mg/L)和0.5 mg/L NAA,之后分裝在500 mL三角瓶內,每瓶裝300 mL,于121 ℃高壓滅菌20 min,冷卻至不燙手時分裝于50 mL已滅菌的三角瓶內,每瓶倒30 mL,備用。
1.3.2種子的消毒與接種。在超凈工作臺上用無菌水清洗種子外植體3~5次,然后放入盛有75%乙醇的燒杯中浸泡30 s并輕輕搖晃,后用無菌水清洗3~5次,再用0.1%HgCl2浸泡種子外植體10~15 min(不斷搖晃燒杯,保證所有外植體均勻接觸溶液),無菌水洗3~5次,最后用無菌濾紙吸干種子表面的水分,接種于愈傷組織誘導培養(yǎng)基[4-5]。
1.3.3培養(yǎng)條件。溫度(18±2)℃,濕度70%,光照條件1 000 μmol/(m2·s),光照時間12 h/d。
2.1濕沙基質中種子的萌發(fā)情況濕沙基質層積240 d后,將種子播于土壤中萌發(fā),結果100 mg/L GA3溶液浸泡48 h種子的萌發(fā)率為95.35%(圖1 a);150 mg/L GA3溶液浸泡種子48 h的萌發(fā)率為98.51%(圖1 b);600 mg/L GA3溶液浸泡種子48 h的萌發(fā)率僅為55.81%(圖1 c),剩余種子均干死,無法得到充足的水分。
濕沙基質層積240 d后,將種子留在濕沙基質中,繼續(xù)恒溫18 ℃培養(yǎng),120 d后,種子的胚根已經(jīng)木質化發(fā)育成主根,且有3株種子的種殼已經(jīng)脫落,露出包裹的子葉,在每個根莖部位均分化出側芽;360 d后,胚乳的營養(yǎng)已被逐漸耗盡,種皮漸變成黑色,直至干枯自然脫落,子葉明顯可見(圖1 d)。
注:a.100 mg /L GA3處理,b.150 mg /L GA3處理,c.600 mg /L GA3處理,d.100 mg /L GA3處理后360 d。Note: a.100 mg /L GA3 treatment, b. 150 mg /L GA3 treatment, c. 600 mg /L GA3 treatment, d. 100 mg/L GA3 for 360 days. 圖1 濕沙基質的種子胚根Fig. 1 The seeds radicle in wet sand substrate
濕沙基質試驗過程中發(fā)現(xiàn),僅高溫或低溫并不能打破種子休眠,而是需要高低溫的交替;采用不同濃度的GA3浸泡種子,然后進行低溫層積和18 ℃培養(yǎng)箱層積,結果低溫層積種子未發(fā)芽,原因可能是七葉一枝花種子的胚發(fā)育不完全。
2.2長出胚根的種子在土壤中的萌發(fā)情況將胚根長至3~4 cm的種子于春季栽種在缽子里,其上覆蓋一層2 cm左右的土,第一次澆透定根水,之后每隔3~5 d澆水,放于光照培養(yǎng)箱內,溫度為(18±2) ℃,濕度為70%,弱光照條件下觀察生長情況。另一部分于相同時間種在小缽子內,在湖北省恩施土家族苗族自治州的自然條件下,挖土一定的深度放入缽子與地面相平,溫度、光照時間和濕度均在不斷檢測中。
光照培養(yǎng)箱和自然條件栽種的種子均能長成心形幼苗,說明各種處理方法均能獲得大量種苗,此方法是可行的。光照培養(yǎng)箱七葉一枝花的種子在其外面還殘留部分鱗莖,阻礙子葉展開,而自然條件下七葉一枝花的種子已經(jīng)長成心形幼苗,比光照培養(yǎng)箱內長得快且長勢良好。其原因是光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)條件較恒定,通風狀況較差,若水澆多,會在其上出現(xiàn)一層白膜,而自然條件下不僅通風良好且不會存積水分,自然條件下生長的七葉一枝花幼苗比光照培養(yǎng)箱生長的快和好(圖2)。
經(jīng)過上述方法打破七葉一枝花種子的休眠期,需要180~210 d,種子可形成心形單葉幼苗。
2.3不同濃度6-BA對種子愈傷組織的影響種子外植體形成愈傷組織的適宜培養(yǎng)基為1/2MS(大量元素、微量元素、有機溶劑和鐵鹽都為MS培養(yǎng)基的50%)+0.1 mg/L 6-BA +0.5 mg /L NAA。試驗過程中發(fā)現(xiàn),在種子外植體愈傷組織誘導初期對培養(yǎng)基的要求較低,說明培養(yǎng)初期胚乳可以提供種子所需要的養(yǎng)分。6-BA 是植物組織培養(yǎng)中使用較廣泛的一種細胞分裂素,且在許多植物上表現(xiàn)出較強的誘導不定芽形成的能力。該試驗結果也說明6-BA用于種子不定芽的誘導是適宜的,且最佳濃度為0.1 mg /L。隨著6-BA濃度的增加,誘導不定芽的能力增強,同時外植體開始褐化,因此,在一定濃度范圍內,高濃度的6-BA對誘導不定芽的形成是不合適的。
雖然是相同濃度的激素,但種子外植體誘導的效果不同,有的能直接形成愈傷組織,有的能形成愈傷組織和長出芽。種子外植體形成的愈傷組織(圖3 a),在整個種子的周圍形成一圈愈傷組織,愈傷組織較松散且易碎,誘導效果不理想。選擇長勢好的愈傷組織進行分化培養(yǎng),一段時間后發(fā)現(xiàn),愈傷組織不同程度地褐變甚至顏色變黑,未分化出苗,既有愈傷組織又有芽的種子外植體也開始褐變和變黑(圖3 b和圖3 c),但種子長出的芽可以進一步生長和發(fā)育(圖3 d~f)。
注:a和b.光照培養(yǎng)箱,c和d.自然條件。Note: a and b. Illuminating incubator, c and d. Natural conditions.圖2 光照培養(yǎng)箱和自然條件下生長的幼苗Fig. 2 Seedlings in labs and under natural conditions
注:a.愈傷組織,b.芽和愈傷組織,c.黑色的愈傷組織,d.分化的芽,e.芽生長和發(fā)育,f.長出根。Note: a. Callus, b. Bud and callus, c. Black callus, d. Differentiation of bud, e. Bud growth and development, f. Growing root.圖3 七葉一枝花種子愈傷組織誘導過程Fig.3 Seed callus induction process of Paris polyphylla Smith
6-BA能有效地被種子外植體所吸收,致使6-BA富集,且誘導的不定芽在含有6-BA的培養(yǎng)基上繼代幾次后,其玻璃化程度不斷加重,說明種子外植體有富集細胞分裂素6-BA的傾向。
雖然種子誘導出的愈傷組織未分化出苗,然而觀察發(fā)現(xiàn)其種子先長出胚根,露出種子之外(圖4 a~c),隨著胚根的不斷發(fā)育和進一步對種子進行誘導分化(圖4 d~f),胚根向下生長,形成主根;與此同時,胚軸細胞也相應地生長和伸長,把胚芽連同子葉一起推出;最后胚芽突出種皮,向上生長,形成莖和葉,獲得了無菌苗(圖4 g~i)。由此可知,七葉一枝花是子葉出土萌發(fā)。
研究結果表明,七葉一枝花種子快速萌發(fā)期由2 a縮短為0.5 a,萌發(fā)率由10%~46%提高到90%以上。150 mg/L GA3處理種子的萌發(fā)率最高。在七葉一枝花育苗、栽培生產(chǎn)中可以選擇這些植物激素,提高其出苗率和幼苗成活率。
較高濃度GA3有利于種子萌發(fā),低濃度則使萌發(fā)率下降。先用水溶液浸泡種子,使種子充分吸脹,再用GA3溶液浸泡,有利于種子充分吸收GA3溶液。GA3不僅能誘導水解酶類的合成,也能促進酶的分泌,水解貯藏物質供胚生長的小分子化合物,促進種子萌發(fā),且促進效果最明顯。
種子外植體最合適的愈傷組織誘導培養(yǎng)基為添加0.1 mg/L 6-BA和0.5 mg /L NAA的 1/2MS基本培養(yǎng)基,誘導的愈傷組織比較松散,濕度大,且易碎??煽紤]使用未成熟的種子胚,此時胚比較幼嫩和容易獲得;根莖和種子外植體都能誘導出愈傷組織,但均未分化出苗。后續(xù)試驗考慮使用正交試驗篩選出合適的愈傷組織分化培養(yǎng)基,獲得植物體,以期為解決種苗問題提供理論指導。
注:a~c.出現(xiàn)胚根,d~f.誘導分化,g~i.無菌苗。Note:a-c.Radide, d-f.Inducing differentiation, g-i.Aseptic seedling.圖4 種子形成無菌苗的過程Fig. 4 The process of seeds growing into aseptic seedling
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Seeds Germination and Tissue Culture ofParispolyphyllaSmith
HUANG Zong-hua
(Guangdong Peizheng College, Guangzhou, Guangdong 510830)
[Objective] To research the optimal GA3concentration and the optimal culture medium for seed germination of Paris polyphylla Smith. [Method] Seeds ofP.polyphyllawere processed by different concentrations of GA3. The optimal GA3concentration to promote the rapid seed germination and high germination rate was researched. Seeds with 3-4 cm radicle were planted in the soil. Under the condition of illumination and natural growth, growth of the first leaf was observed, respectively. Callus were induced by different concentrations of 6-BA, so as to find the optimal concentration of 6-BA. [Result] In 150 mg/L GA3treatment, seeds had the highest germination rate. The optimal callus induction medium for seed explants was 1/2 MS +0.1 mg/L 6-BA + 0.5 mg /L NAA. [Conclusion] This ratpid germination method forP.polyphyllais feasible.
ParispolyphyllaSmith; Seeds; Germination rate; Callus
湖北省自然科學基金項目(2010CDA035);中南民族大學植物遺傳與發(fā)育創(chuàng)新團隊資助項目。
黃宗華(1987- ),女,黑龍江哈爾濱人,碩士研究生,研究方向:應用生物化學。
2016-07-20
S 188
A
0517-6611(2016)27-0118-04