徐萌萌，張　紅，何　姣，涂　璇，顏　霞，黃麗麗

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) a 生命科學(xué)學(xué)院，b 植物保護(hù)學(xué)院，c 理學(xué)院， 陜西 楊凌 712100；2 旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室，陜西 楊凌 712100；3 三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院,湖北 宜昌 443002)

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生防鏈霉菌gCLA4遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立與優(yōu)化

徐萌萌1a,2，張紅1c,2，何姣1a,2，涂璇3，顏霞1a,2，黃麗麗1b,2

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) a 生命科學(xué)學(xué)院，b 植物保護(hù)學(xué)院，c 理學(xué)院， 陜西 楊凌 712100；2 旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室，陜西 楊凌 712100；3 三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院,湖北 宜昌 443002)

【目的】 建立生防菌淡紫灰鏈霉菌(Streptomyceslavendularectus)gCLA4的遺傳轉(zhuǎn)化體系，為定向改造基因、提高基因表達(dá)水平及其生防分子機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。【方法】 以具有安普霉素(Apramycin)抗性基因標(biāo)記的整合型質(zhì)粒pSET152為出發(fā)質(zhì)粒，EscherichiacoliET12567(pUZ8002，pSET152)為供體，淡紫灰鏈霉菌gCLA4為受體進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移試驗，并對影響接合效率的培養(yǎng)基、熱激溫度、接合轉(zhuǎn)移時間和篩選轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)基等因素進(jìn)行優(yōu)化?！窘Y(jié)果】 成功地將質(zhì)粒pSET152轉(zhuǎn)入到了生防鏈霉菌gCLA4中，明確了可用于篩選鏈霉菌gCLA4轉(zhuǎn)化子的抗生素為安普霉素或四環(huán)素；鏈霉菌gCLA4孢子50 ℃熱激時轉(zhuǎn)化效率較高，接合效率在16，18，20 h下沒有明顯差異，MS培養(yǎng)基作為接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基時轉(zhuǎn)化效率最高，接合產(chǎn)物涂布到高氏一號抗性培養(yǎng)基上進(jìn)行陽性轉(zhuǎn)化子篩選的效果最好。【結(jié)論】 建立了生防鏈霉菌gCLA4的遺傳轉(zhuǎn)化優(yōu)化體系。

生防鏈霉菌gCLA4菌株；接合轉(zhuǎn)移；遺傳轉(zhuǎn)化；質(zhì)粒pSET152

淡紫灰鏈霉菌gCLA4(Streptomyceslavendularectus,GenBank登錄號為EF469608,菌種保藏號為GCMCC 2131)是旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室分離自黃瓜葉片的一株拮抗菌，該菌株及其發(fā)酵液對番茄早疫病菌(Alternariasolani)、辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)、油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiotum)、蘋果樹腐爛病菌(Valsamali)等多種重要的植物病原菌均有很強的抑制作用，有良好的生防應(yīng)用潛力[1]。目前對生防鏈霉菌gCLA4的研究僅限于對其發(fā)酵條件的優(yōu)化及活性物質(zhì)的初步研究[2]等方面，對其生防機(jī)理的分子機(jī)制涉及不多。旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室已經(jīng)對生防鏈霉菌gCLA4進(jìn)行了全基因組測序，為了進(jìn)一步對其中一些功能基因進(jìn)行研究，建立簡單、高效的gCLA4遺傳轉(zhuǎn)化體系就顯得非常必要[3]。

鏈霉菌中常用的導(dǎo)入外源遺傳物質(zhì)的方法有PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、接合轉(zhuǎn)移法和電穿孔法。但不同的菌株因其特性不同，轉(zhuǎn)化方法差別也很大[4]。自從Mazodier等[5]通過接合轉(zhuǎn)移法成功將質(zhì)粒由大腸桿菌轉(zhuǎn)入變鉛青鏈霉菌后，接合轉(zhuǎn)移法作為一種非常有效的鏈霉菌基因轉(zhuǎn)移方法，近年來得到了廣泛應(yīng)用，如福司曲星(Fostriecin)產(chǎn)生菌(Streptomycespulveraces)[6]、武夷菌素產(chǎn)生菌不吸水鏈霉菌(Strepomycesahygroscopicusvar.wuyiensis)[7]和Xinaomycins產(chǎn)生菌諾爾斯鏈霉菌(Streptomycesnoursei)[8]等鏈霉菌遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的構(gòu)建，淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesdiastatochromogenes)1628接合轉(zhuǎn)移體系的構(gòu)建[9]，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)生菌(Streptomycesmobaraensis)屬間接合轉(zhuǎn)移體系的構(gòu)建[10]等。pSET152是一種整合型的質(zhì)粒，具有安普霉素抗性基因，可借助于自身所攜帶的噬菌體φC31整合酶基因，和attP位點與鏈霉菌染色體上的特定重組位點attB結(jié)合，從而整合到鏈霉菌染色體上，是研究鏈霉菌基因接合轉(zhuǎn)移方法時常用的質(zhì)粒[11]。

本研究采用接合轉(zhuǎn)移法建立外源基因轉(zhuǎn)入生防淡紫灰鏈霉菌gCLA4的遺傳轉(zhuǎn)化體系并進(jìn)行優(yōu)化，是首次將外源基因?qū)朐撴溍咕?，因此對采用鏈霉菌gCLA4進(jìn)行基因遺傳操作進(jìn)而研究其抗病的分子機(jī)制有重要意義。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株及質(zhì)粒淡紫灰鏈霉菌gCLA4由旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室從黃瓜葉片中分離并保存。大腸桿菌EscherichiacoliET12567(pUZ8002)為去甲基化菌株[12]。pSET152質(zhì)粒為大腸桿菌-鏈霉菌穿梭型整合質(zhì)粒，具有安普霉素抗性基因aac(3) Ⅳ、pUC18復(fù)制子、接合轉(zhuǎn)移起點oriT及噬菌體φC31的整合酶基因int和整合位點attP[11]。

1.1.2培養(yǎng)基及抗生素淡紫灰鏈霉菌gCLA4產(chǎn)孢培養(yǎng)基為高氏一號，液體培養(yǎng)基為TSB[13]；接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基分別采用MS、高氏一號、TSB、YD、R2YE；孢子預(yù)萌發(fā)培養(yǎng)基采用2×YT；篩選轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)基選用高氏一號、2CMY、YD、YMS，上述培養(yǎng)基的配制參照鏈霉菌遺傳操作手冊[14]。大腸桿菌培養(yǎng)基為LB[13]?？股匕让顾?Cml)、卡那霉素(Kan)、安普霉素(Apr)、萘啶酮酸(Nal)、四環(huán)素(Tet)和潮霉素(Hyg)。

1.2方法

1.2.1質(zhì)粒及鏈霉菌基因組DNA的提取大腸桿菌質(zhì)粒提取基本操作參見文獻(xiàn)[15]。鏈霉菌總DNA提取方法參照鏈霉菌遺傳操作手冊[14]。

1.2.2抗生素抗性檢測選取安普霉素、卡那霉素、四環(huán)素、潮霉素、萘啶酮酸5種抗生素，分別加入2CMY培養(yǎng)基中，每種抗生素終質(zhì)量濃度為0，1.0，2.0，5.0，10.0，15.0，20.0 mg/L。劃線接種野生型gCLA4，28 ℃黑暗培養(yǎng)8 d后觀察結(jié)果。

1.2.3大腸桿菌和鏈霉菌gCLA4之間的接合轉(zhuǎn)移將整合型質(zhì)粒pSET152用熱激法[15]轉(zhuǎn)入EscherichiacoliET12567(pUZ8002)中，得到供體菌株EscherichiacoliET12567(pUZ8002，pSET152)。挑取單菌落，接種于3 mL含有安普霉素50 mg/L和卡那霉素50 mg/L以及氯霉素30 mg/L的 LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜后，按1∶100的體積比轉(zhuǎn)接到30 mL含有相同抗生素的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6。離心收集菌體，用等體積不含抗生素的新鮮LB培養(yǎng)基洗滌菌體3次，將菌體懸浮于1 mL不含抗生素的 LB培養(yǎng)基中備用。

在長滿鏈霉菌gCLA4孢子的高氏一號平板上加10 mL無菌水，用接種環(huán)刮下孢子后將孢子粗懸液倒入離心管中，渦旋振蕩打散孢子后離心倒掉上清液，然后將菌體懸浮于1 mL 2×YT培養(yǎng)基中，熱激10 min后于28 ℃、150 r/min搖床中預(yù)萌發(fā)2.5 h。

將備用的大腸桿菌和預(yù)萌發(fā)好的鏈霉菌gCLA4孢子懸液按1∶1體積比混合，每200 μL滴在孔徑為0.22 μm的微孔濾膜(放置于接合培養(yǎng)基表面)上。28 ℃培養(yǎng)16～20 h后，用400 μL無菌水將微孔濾膜上的菌體洗滌到含有抗生素的篩選培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)3～4 d后長出接合子。

1.2.4接合轉(zhuǎn)移體系的優(yōu)化接合轉(zhuǎn)移過程中熱激溫度設(shè)置45，50，55 ℃ 3個處理，時間設(shè)置16，18，20 h 3個時間段，接合培養(yǎng)基選擇R2YE、MS、TSB、YD和高氏一號5種，篩選轉(zhuǎn)化子的抗性培養(yǎng)基選擇高氏一號、2CMY、YD、YMS 4種(每種培養(yǎng)基中含萘啶酮酸20 mg/L和安普霉素10 mg/L)。所有試驗中供體大腸桿菌細(xì)胞數(shù)量保持108不變，鏈霉菌gCLA4菌絲體量或孢子量從105～108以10倍遞增。以肉眼可分辨的轉(zhuǎn)化子為準(zhǔn)，接合效率用接合子數(shù)除以菌絲體或孢子量表示，取3次重復(fù)的平均值。

1.2.5接合轉(zhuǎn)化子的PCR擴(kuò)增反應(yīng)驗證用含有10 mg/L安普霉素的2CMY培養(yǎng)基培養(yǎng)接合轉(zhuǎn)化子，打取菌餅接種于含有10 mg/L安普霉素的TSB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，收集菌絲體，提取總DNA作為模板。以野生型鏈霉菌gCLA4的總DNA為陰性對照，以pSET152質(zhì)粒為陽性對照，同時設(shè)清水對照。根據(jù)安普霉素抗性基因設(shè)計1對引物，擴(kuò)增大小為750 bp左右的片段。PCR條件反應(yīng)程序為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃10 min。引物為AMF(5′-GGTTCATGTGCAGCTCCATCAGC-3′)和AMR(5′-ATGAGCTCAGCCAATCGACTGG-3′)[16]。

2　結(jié)果與分析

2.1生防鏈霉菌gCLA4接合轉(zhuǎn)移體系的建立和優(yōu)化

2.1.1對抗生素的敏感性為了確定能用于鏈霉菌gCLA4遺傳操作的抗生素選擇標(biāo)記，分別檢測了生防鏈霉菌gCLA4對安普霉素、四環(huán)素、卡那霉素、萘啶酮酸、潮霉素5種抗生素的抗性水平。由表1結(jié)果可知，生防鏈霉菌gCLA4對安普霉素和四環(huán)素比較敏感，在含2.0 mg/L安普霉素或5.0 mg/L四環(huán)素的平板上生長非常緩慢；對潮霉素、卡那霉素和萘啶酮酸不敏感，在含20.0 mg/L卡那霉素、潮霉素和萘啶酮酸的平板上依然可以生長，表明安普霉素或四環(huán)素的抗性基因可以用于鏈霉菌gCLA4遺傳操作的選擇標(biāo)記。

表 1　生防鏈霉菌gCLA4對不同抗生素的敏感性Table 1　Sensitivity of Streptomyces lavendularectus gCLA4 to antibiotics

注：++.正常生長；+.緩慢生長；-.不生長。

Note:++.Normal growth；+.Slow growth；-.No growth.

2.1.2熱激溫度對接合效率的影響熱激處理的目的是促進(jìn)孢子萌發(fā)，孢子萌發(fā)是影響接合效率的一個重要因素。試驗中設(shè)置45，50，55 ℃ 3個溫度處理，每個溫度熱激10 min，然后在28 ℃、150 r/min 的搖床中預(yù)萌發(fā)2.5 h，結(jié)果見表2。

表 2　熱激溫度對生防鏈霉菌gCLA4接合效率的影響Table 2　Influence of heat temperature on conjugation frequency of Streptomyces lavendularectus gCLA4

表2顯示，在50 ℃ 熱激10 min、28 ℃預(yù)萌發(fā)2.5 h條件下接合效率最高，為2.46×10-6。當(dāng)熱激溫度為45 ℃時接合效率較低，而當(dāng)溫度為55 ℃時沒有接合轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。因此確定孢子萌發(fā)條件為50 ℃熱激10 min后再28 ℃預(yù)萌發(fā)2.5 h。

2.1.3接合轉(zhuǎn)移時間對接合效率的影響試驗結(jié)果顯示，接合轉(zhuǎn)移時間為16，18，20 h時，接合效率沒有明顯變化。

2.1.4接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基對接合效率的影響選擇R2YE、MS、TSB、YD和高氏一號5種不同的接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基，分別直接涂布平板，使用0.22 μm微孔濾膜進(jìn)行接合。結(jié)果表明：在MS培養(yǎng)基上使用 0.22 μm微孔濾膜進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移的效率為10-7～10-6，而在其他培養(yǎng)基上得到的接合轉(zhuǎn)化子很少甚至得不到接合子。因此，選擇MS培養(yǎng)基作為鏈霉菌gCLA4接合轉(zhuǎn)移的最適培養(yǎng)基。

2.1.5篩選轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)基對接合效率的影響將0.22 μm微孔濾膜上的混合菌體洗滌到篩選培養(yǎng)基上時，選擇高氏一號、2CMY、YD、YMS 4種培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基中抗生素為萘啶酮酸(20 mg/L)、安普霉素(10 mg/L)。結(jié)果顯示，鏈霉菌gCLA4在高氏一號抗性平板上的接合效率為10-7～10-6，而在2CMY、YD、YMS 3種抗性培養(yǎng)基上均出現(xiàn)了生長非常旺盛、與大腸桿菌混在一起且難以分辨的單菌落。因此，選擇含有萘啶酮酸20 mg/L、安普霉素10 mg/L的高氏一號抗性培養(yǎng)基作為篩選轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)基。

2.2生防鏈霉菌gCLA4接合子的PCR鑒定及穩(wěn)定性檢測

pSET152屬于基因整合型質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入鏈霉菌gCLA4后，不能單獨存在于細(xì)胞質(zhì)中，而是整合到菌株的基因組上[13]。隨機(jī)挑選20個生防鏈霉菌gCLA4接合子，提取其基因組DNA，用安普霉素的抗性基因引物分別擴(kuò)增。PCR檢測結(jié)果(圖1)顯示，轉(zhuǎn)化子及陽性對照pSET152質(zhì)粒均擴(kuò)增出750 bp左右的條帶，而野生型鏈霉菌gCLA4 DNA沒有擴(kuò)增出目的片段，由此證實pSET152質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入到鏈霉菌gCLA4中。

圖 1　生防鏈霉菌gCLA4接合轉(zhuǎn)化子的PCR擴(kuò)增 W.清水對照；1.質(zhì)粒pSET152；2～21.接合轉(zhuǎn)化子；22.野生型鏈霉菌gCLA4；M.DNA MarkerFig.1　PCR identification of exconjugants of Streptomyces lavendularectus gCLA4 W.Water control;1.Plasmid pSET152;2-21.Exconjugants;22.Wild Streptomycete gCLA4;M.DNA Marker

為了檢測質(zhì)粒pSET152在接合轉(zhuǎn)化子中的穩(wěn)定性，將接合轉(zhuǎn)化子在不含安普霉素的2CMY平板上連續(xù)轉(zhuǎn)接5次后，隨機(jī)挑取100個單菌落轉(zhuǎn)接到含有安普霉素的2CMY平板上，沒有發(fā)現(xiàn)抗性消失的菌落；同時隨機(jī)挑選10個單菌落，經(jīng)PCR驗證發(fā)現(xiàn)，與接合轉(zhuǎn)化子驗證結(jié)果一致；表明質(zhì)粒pSET152能在鏈霉菌gCLA4中穩(wěn)定遺傳。

3　討論與結(jié)論

鏈霉菌是一類具有重要經(jīng)濟(jì)價值的革蘭氏陽性菌，其(G+C)含量一般高達(dá)70%以上，能產(chǎn)生多種抗生素和生物活性物質(zhì)。不同鏈霉菌菌株之間差異很大，因而轉(zhuǎn)化方法及轉(zhuǎn)化效率也不同[4]。

本試驗中，50 ℃熱激10 min時生防鏈霉菌gCLA4的接合效率最高，45 ℃時接合效率較低，55 ℃時則沒有長出接合子；接合轉(zhuǎn)移時間為16，18，20 h時接合效率沒有明顯差異；在MS培養(yǎng)基上使用0.22 μm微孔濾膜的接合效率最高，因為0.22 μm微孔濾膜可以使大腸桿菌與鏈霉菌充分緊密接觸，菌體可以透過濾膜吸收必要的營養(yǎng)物質(zhì)，維持其生長，從而提高接合效率；篩選接合轉(zhuǎn)化子時采用含有萘啶酮酸20 mg/L、安普霉素10 mg/L的高氏一號抗性培養(yǎng)基效果最好，因為含有抗生素的平板相對于抗生素?zé)o菌水覆蓋平板而言，用前者篩選接合轉(zhuǎn)化子的結(jié)果更可靠，假陽性相對較少，但含有抗生素培養(yǎng)基的種類根據(jù)不同的種屬有較大的差異，需要根據(jù)菌株選擇優(yōu)化。

建立生防鏈霉菌gCLA4遺傳操作體系是對其遺傳調(diào)控進(jìn)行分子水平研究的必要前提；同時，遺傳操作體系的建立使得有目的地定向改造基因、提高基因表達(dá)水平以及改造菌株生產(chǎn)能力、依靠基因重組生成新的化合物成為了可能，為其生防分子機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。

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Establishment and optimization of genetic transformation system for bio-controlStreptomyceslavendularectusgCLA4

XU Mengmeng1a,2,ZHANG Hong1c,2,HE Jiao1a,2,TU Xuan3,YAN Xia1a,2,HUANG Lili1b,2

(1 aCollegeofLifeSciences,bCollegeofPlantProtection,cCollegeofScience,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China;2StateKeyLaboratoryofCropStressBiologyforAridAreas,Yangling,Shaanxi712100,China;3CollegeofBiologicalandPharmaceutical,ChinaThreeGorgesUniversity,Yichang,Hubei443002,China)

【Objective】 The genetic transformation system of bio-controlStreptomyceslavendularectusgCLA4 was established for modifying gene and raising the level of gene expression and laying foundation for research of its bio-control mechanisms.【Method】 Intergeneric genetic transfer system was based upon integrative plasmid pSET152 with apramycin resistance gene from donorEscherichiacoliET12567/pUZ8002 toS.lavendularectusgCLA4.Various influencing factors including culture medium,heat temperature,time of conjugation and the medium for screening were optimized.【Result】 The plasmid was transferred intoS.lavendularectusgCLA4 and the best conditions of conjugation were determined.Apramycin and tetracycline could be used to screen the transformation of gCLA4.When the gCLA4 spores were heat-shocked at 50 ℃,the conjugation efficiency was the highest.There was no difference in conjugation among different times 16,18,and 20 h.MS medium was the preferred medium for conjugation and exconjuants coating to the GAUZE’s medium No.1 with antibiotic was the best.【Conclusion】 The optimal genetic transformation system of bio-controlS.lavendularectusgCLA4 was established.

StreptomyceslavendularectusgCLA4；conjugal transfer；genetic transformation;pSET152

時間:2016-09-0709:03DOI：10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.10.017

2015-03-11

國家自然科學(xué)基金項目(31101476，31171796)；陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計劃項目(2013K01-45)；楊凌示范區(qū)科技計劃項目(2014NY-41)

徐萌萌(1988-)，女，山東即墨人，在讀碩士，主要從事微生物資源與利用研究。E-mail：woshixiaxue@126.com

顏霞(1974-)，女，山東寧陽人，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事微生物資源利用研究。

E-mail：yanxia@nwsuaf.edu.cn

Q933

A

1671-9387(2016)10-0121-05

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