米丹陽(yáng)　段　睿　宋軍營(yíng)　孫向東　張鐘允　閆　敏　袁　永　張振強(qiáng)　張改平　劉文第

(河南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室/鄭州市抗體組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,鄭州450046)

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·免疫學(xué)技術(shù)與方法·

鼠抗人S100A9天然蛋白單克隆抗體的制備與鑒定①

米丹陽(yáng)段睿宋軍營(yíng)孫向東張鐘允閆敏袁永張振強(qiáng)張改平②劉文第

(河南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室/鄭州市抗體組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,鄭州450046)

目的：探索以白細(xì)胞為免疫原的鼠抗人白細(xì)胞天然蛋白單克隆抗體(monoclonal antibodies，mAbs)制備與克隆篩選鑒定方法，制備鼠抗人S100A9天然蛋白單克隆抗體，并鑒定抗體性質(zhì)。方法：用健康人外周血白細(xì)胞免疫小鼠，利用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備mAbs，通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)法對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行非特異性陽(yáng)性篩選，有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，應(yīng)用免疫沉淀-質(zhì)譜法進(jìn)行mAb特異性鑒定，通過(guò)Western blot進(jìn)行細(xì)胞株篩選，小鼠體內(nèi)誘生腹水法制備單抗，親和層析法純化，ELISA間接法測(cè)定效價(jià)及親和力，Western blot進(jìn)行特異性鑒定及交叉反應(yīng)性分析，免疫組化染色人乳腺癌石蠟切片。結(jié)果：獲得免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)陽(yáng)性多克隆細(xì)胞35孔，分泌鼠抗人S100A9蛋白單克隆抗體細(xì)胞株11株，優(yōu)選1株制備腹水并純化鑒定抗體，抗體效價(jià)為1∶3.18×105，亞類為IgG1，輕鏈為kappa鏈，抗體純度達(dá)95%以上，親和力常數(shù)3.54×108L/mol，與S100A8的交叉反應(yīng)率為0.12%,與S100A12和S100A13幾乎無(wú)交叉反應(yīng)，組化染色識(shí)別人乳腺癌組織中的S100A9蛋白。結(jié)論：成功制備鼠抗人S100A9天然蛋白單克隆抗體，該單抗具有高效價(jià)、較高親和力和高特異性，能為其應(yīng)用于免疫組化檢測(cè)S100A9蛋白的表達(dá)提供依據(jù)。

白細(xì)胞；S100A9；單克隆抗體；免疫學(xué)特性

白細(xì)胞是機(jī)體防御系統(tǒng)的重要組成部分，它通過(guò)吞噬、產(chǎn)生抗體和淋巴因子等方式來(lái)抵御和消滅入侵的病原微生物[1]。對(duì)白細(xì)胞相關(guān)蛋白的檢測(cè)，可以探索多種疾病的發(fā)病機(jī)理、病程、預(yù)后，具有很高的臨床和科研價(jià)值。本研究以健康人外周血白細(xì)胞為免疫原免疫BALB/c小鼠，利用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備單抗，探索以白細(xì)胞為免疫原的鼠抗人白細(xì)胞天然蛋白mAb制備及克隆篩選鑒定方法。

S100A9是S100鈣結(jié)合蛋白家族的一個(gè)重要成員，又稱鈣粒蛋白B(Calgranulin B，CAGB)、骨髓相關(guān)蛋白-14(Myeloid related protein of molecular weight 14 kD，MRP-14)、遷移抑制因子相關(guān)蛋白-14(Migration inhibitory factor-related protein of molecular weight 14 kD，MRP14)等[2]。S100A9主要限制性地表達(dá)于單核/巨噬細(xì)胞系、中性粒細(xì)胞以及特定病理狀態(tài)下的角質(zhì)化細(xì)胞中[3]。S100A9結(jié)合Ca2+、Zn2+、花生四烯酸、角蛋白中間絲、晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)、Toll-樣受體4(TLR4)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)等，具有細(xì)胞內(nèi)、外調(diào)節(jié)活性，參與炎癥反應(yīng)和腫瘤發(fā)展過(guò)程[4]。S100A9蛋白的檢測(cè)對(duì)研究感染性疾病、免疫性疾病、腫瘤等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展、治療、預(yù)后均有指導(dǎo)意義，以S100A9為靶點(diǎn)的藥物研發(fā)也成為國(guó)外研究的熱點(diǎn)。本研究成功制備了鼠抗人S100A9天然蛋白mAb，為S100A9蛋白檢測(cè)試劑盒的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1材料與試劑健康人外周血經(jīng)改良白膜法制備血小板過(guò)程中的白膜[5](富含白細(xì)胞)取自河南省紅十字血液中心成分室，6～8周齡的雌性BALB/c小鼠和小鼠骨髓瘤細(xì)胞株SP2/0來(lái)自河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，人乳腺癌組織切片來(lái)源于河南省腫瘤醫(yī)院病理科。人外周血淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)?；HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(H+L)(鄭州益康)；Protein G-Agarose(Santa Cruz，美國(guó))；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、Protein G親和層析柱(美國(guó)GE)；小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒(武漢三鷹)；重組人S100A9、S100A8、S100A12、S100A13蛋白(北京義翹神州)。

1.1.2儀器超靈敏化學(xué)發(fā)光成像儀、AKTATMpure分離純化系統(tǒng)(美國(guó)GE)；自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)(英國(guó)UVItec)；免疫組化全自動(dòng)染色機(jī)(德國(guó)Leica BOND Ⅲ)。

1.2方法

1.2.1單抗制備

1.2.1.1白細(xì)胞懸液的制備與小鼠免疫血液中心取回的新鮮白膜，用兩倍體積的PBS稀釋混勻，取50 ml離心管加10 ml淋巴細(xì)胞分離液，將20 ml稀釋的白膜緩慢平穩(wěn)加于淋巴細(xì)胞分離液液面上，水平低溫離心機(jī)500 g、緩升緩降、18℃、離心20 min；收集環(huán)狀乳白色層至新的離心管中，洗滌重懸后計(jì)數(shù)并調(diào)整至所需濃度。經(jīng)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)，淋巴細(xì)胞約占50%，單核細(xì)胞約占5%，粒細(xì)胞約占10%。上述白細(xì)胞懸液，以約1×106個(gè)細(xì)胞、200 μl背部皮下分點(diǎn)注射，免疫6～8周齡的雌性BALB/c小鼠。首次免疫后第3、6、9周再次免疫，等量細(xì)胞腹腔注射。細(xì)胞融合前3 d以約1×107個(gè)細(xì)胞、300 μl腹腔注射加強(qiáng)免疫。收集每次免疫后小鼠血清，-20℃保存，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)免疫后血清抗體效價(jià)。

1.2.1.2免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)制備白細(xì)胞懸液，以每孔1×105個(gè)細(xì)胞，接種至96孔板中，無(wú)血清1640培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)2 h，離心后吸取上清，V(甲醇)：V(雙氧水)=100∶1固定，棄上清，PBS-T(含0.05%的吐溫-20)洗4次，5%脫脂奶37℃封閉1 h，PBS-T洗4次。加一抗：免疫后小鼠血清或雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清100 μl/孔，37℃孵育1 h，棄上清，PBS-T洗4次；加二抗：100倍稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，50 μl/孔，37℃孵育1 h，棄上清，PBS-T洗4次；AEC顯色液室溫避光顯色5～15 min，倒置顯微鏡下觀察并記錄。

1.2.1.3細(xì)胞融合與亞克隆融合前2周復(fù)蘇SP2/0細(xì)胞，融合前2 d擴(kuò)大培養(yǎng)。采取聚乙二醇(Polyethylene glycol，PEG)化學(xué)融合法，SP2/0細(xì)胞與脾細(xì)胞的個(gè)數(shù)比例為1∶8～1∶10，使用HAT 1640完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)。3～5 d可進(jìn)行半數(shù)換液，7～10 d可過(guò)度到HT培養(yǎng)基，2周后可用1640完全培養(yǎng)基。密切觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)至大于孔底面積1/10時(shí)，可抽取培養(yǎng)上清，應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)法進(jìn)行抗體非特異性陽(yáng)性篩選，對(duì)檢測(cè)陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)檢測(cè)仍為陽(yáng)性者予以凍存并分批有限稀釋法亞克隆。

1.2.1.4免疫沉淀-質(zhì)譜法抗體特異性鑒定對(duì)陽(yáng)性單克隆細(xì)胞，進(jìn)行免疫沉淀-質(zhì)譜法鑒定。用NP40細(xì)胞裂解液裂解白細(xì)胞，每107個(gè)細(xì)胞加入1 ml裂解液，冰上裂解1 h后，4℃，10 000 g，離心20 min，收集上清，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，-20℃保存。將50 μl 50% Protein G-Agarose加入1～2 mg裂解的蛋白中，4℃混合30 min，100 g，4℃離心3 min，沉淀與Protein G非特異性結(jié)合的蛋白；收集上清至新的EP管中，加1～4 μg的抗體(200～300 μl細(xì)胞培養(yǎng)上清)，4℃混合2 h，再加50 μl Protein G，4℃混合2 h，4℃、100 g離心30 s，沉淀與細(xì)胞培養(yǎng)上清中的抗體結(jié)合的抗原蛋白；棄上清，PBS洗3次，加×5 SDS 上樣緩沖液，95℃加熱5 min，10 000離心3 min，每個(gè)泳道取20 μl進(jìn)行SDS-PAGE，剩余樣品-80℃保存。在進(jìn)行SDS-PAGE的同時(shí)，以HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG為二抗，ECL顯色，進(jìn)行Western blot分析，以確定抗體結(jié)合的抗原條帶，對(duì)SDS-PAGE分離得到的與抗體相互作用的蛋白切膠，進(jìn)行質(zhì)譜分析，通過(guò)確定抗原的性質(zhì)鑒定抗體。

1.2.1.5Western blot篩選細(xì)胞株為驗(yàn)證免疫沉淀-質(zhì)譜法鑒定結(jié)果，在得知抗原性質(zhì)后，進(jìn)行Western blot抗體鑒定與細(xì)胞株篩選。將測(cè)得的抗原重組蛋白溶于上樣緩沖液，進(jìn)行SDS-PAGE并轉(zhuǎn)PVDF膜，5%脫脂奶封閉，以細(xì)胞培養(yǎng)上清為一抗，培養(yǎng)基代替一抗作為陰性對(duì)照，室溫孵育1 h，TBS-T洗3次，加HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，室溫孵育1 h，洗膜3次后ECL顯色觀察結(jié)果。

1.2.1.6抗體效價(jià)測(cè)定采用間接酶聯(lián)免疫吸附法，以0.25 μg/ml的抗原重組蛋白包被96孔ELISA板，用3%BSA每孔300 μl進(jìn)行封閉，以雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清或腹水作為一抗，設(shè)空白對(duì)照和陰性對(duì)照，37℃孵育1 h；洗滌后加二抗，37℃孵育1 h；洗滌后加入TMB底物顯色液及終止液，以450 nm測(cè)定OD值。

1.2.1.7單克隆抗體腹水制備與純化采用小鼠體內(nèi)誘生腹水法制備單克隆抗體，將腹水300 g離心30 min除去細(xì)胞和其他沉淀物，飽和硫酸銨鹽析法初步純化后，應(yīng)用AKTATMpure分離純化系統(tǒng)進(jìn)行Protein G親和層析進(jìn)一步純化。BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定抗體蛋白含量，SDS-PAGE鑒定抗體純度?？贵w效價(jià)檢測(cè)采用ELISA間接法，以陽(yáng)性值與陰性值的比值大于 2.0 的最大抗體稀釋倍數(shù)確定抗體效價(jià)。

1.2.2單克隆抗體特性的鑒定

1.2.2.1單抗亞類鑒定應(yīng)用鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2.2單抗親和力常數(shù)測(cè)定采用Beatty等[6]建立的方法測(cè)定單克隆抗體的親和力常數(shù)。分別用濃度為0.5 μg/ml、0.25 μg/ml的S100A9重組蛋白包被ELISA板；加入倍比稀釋的S100A9單克隆抗體，37℃溫育15 min；再加入羊抗鼠IgG-HRP酶標(biāo)二抗，37℃溫育30 min；TMB顯色10 min后測(cè)OD450nm值。以S100A9單克隆抗體濃度為橫坐標(biāo)，以O(shè)D450nm值為縱坐標(biāo)，繪出相應(yīng)的2條反應(yīng)曲線，以每條曲線上部平坦段的OD450nm值作為100%，在曲線上算出50%OD450nm值時(shí)對(duì)應(yīng)的單克隆抗體的質(zhì)量濃度，按照下面的公式計(jì)算：親和常數(shù)Kaff=(n-1)/2(n[Ab′]t-[Ab]t)，其中n=[Ag]t/[Ag′]t，[Ag]t、[Ag′]t為兩個(gè)不同的包被原濃度，[Ab]t、[Ab′]t為包被原濃度對(duì)應(yīng)的抗體濃度。

1.2.2.3單克隆抗體特異性的鑒定[7]選用S100蛋白家族S100A8、S100A12和S100A13重組蛋白作為抑制劑，用阻斷ELISA法測(cè)定各抑制物的IC50，以抗體對(duì)S100A9蛋白的IC50與各抑制物的IC50之比的百分?jǐn)?shù)為其交叉反應(yīng)率，即交叉反應(yīng)率(CR%)=IC50S100A9蛋白/IC50反應(yīng)物×100%。

1.2.2.4單克隆抗體Western blot法檢測(cè)分析用勻漿器將人乳腺癌組織勻漿，加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑，混勻組織，勻漿樣品，冰上孵育30 min后，3 150 g離心10 min，獲得組織蛋白。將其加入還原性 SDS-PAGE上樣緩沖液中，100℃沸水中變性10 min。分別以S100A9重組蛋白和乳腺癌組織蛋白進(jìn)行SDS-PAGE并轉(zhuǎn)膜。加入ⅡD4B10雜交瘤制備腹水并純化的抗體作為一抗，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。室溫孵育后PBST 洗 3 次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgG，ECL顯色后觀察結(jié)果。

1.2.2.5S100A9單克隆抗體在免疫組化檢測(cè)中的應(yīng)用以本實(shí)驗(yàn)室制備純化的S100A9單克隆抗體為一抗，對(duì)人乳腺正常組織和乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織石蠟切片進(jìn)行免疫組化染色，參照Leica BOND Ⅲ說(shuō)明書進(jìn)行操作：上機(jī)前準(zhǔn)備組織切片、配置相關(guān)試劑并對(duì)所放樣品進(jìn)行編號(hào)；結(jié)束后取出組織進(jìn)行顯色、襯染、封片：取出切片，加入DAB顯色液中顯色5 min，用流水沖洗10 min，蘇木素染液復(fù)染1 min，0.5%鹽酸酒精分化3 s，流水沖洗10 min，脫水、透明、封片，鏡下觀察。

2　結(jié)果

2.1免疫與融合效果免疫小鼠3只，免疫后小鼠血清用PBS稀釋200倍后進(jìn)行倍比稀釋，同時(shí)設(shè)未免疫血清陰性對(duì)照和PBS空白對(duì)照，進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)，以出現(xiàn)明顯染色的最大稀釋倍數(shù)為抗體效價(jià)，結(jié)果3只小鼠加強(qiáng)免疫后血清抗體效價(jià)均達(dá)到1∶6 400。成功融合小鼠3只，每只4塊96孔板，融合率約90%。融合后12 d左右肉眼可見(jiàn)白色點(diǎn)狀克隆團(tuán)，取細(xì)胞培養(yǎng)上清，進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)，設(shè)加強(qiáng)免疫后血清陽(yáng)性對(duì)照和未免疫血清陰性對(duì)照，共檢測(cè)到35個(gè)陽(yáng)性孔。

2.2免疫沉淀-質(zhì)譜法抗體特異性鑒定對(duì)3號(hào)小鼠融合后的強(qiáng)陽(yáng)性孔4F7進(jìn)行3次有限稀釋法亞克隆后，為確定陽(yáng)性單克隆細(xì)胞ⅡD4B10分泌抗體的性質(zhì)，以白細(xì)胞裂解蛋白為抗原，以ⅡD4B10細(xì)胞培養(yǎng)上清為抗體，通過(guò)Protein G進(jìn)行免疫沉淀，同時(shí)進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot，分析得到可以與雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的抗體相互作用的蛋白(圖1)。

將免疫沉淀獲得的抗原蛋白(圖1A箭頭所示)送上海中科新生命生物科技有限公司，進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectro-metry，MALDI-TOF-MS)，分析類型為一級(jí)肽指紋質(zhì)量與二級(jí)肽碎片質(zhì)量綜合分析(Combined MS+MS/MS)，檢索UniProt_human數(shù)據(jù)庫(kù)，鑒定為人S100A9蛋白。

2.3Western blot篩選S100A9單抗細(xì)胞株以重組人S100A9蛋白為抗原，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，以ⅡD4B10及其同一小鼠來(lái)源的單克隆雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清為一抗，以培養(yǎng)基代替一抗作為陰性對(duì)照，以HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，ECL顯色，進(jìn)行Western blot，共得到11株分泌抗S100A9單抗的細(xì)胞(圖2)。

2.4腹水制備及效價(jià)檢測(cè)[8,9]以上細(xì)胞株經(jīng)抗體效價(jià)檢測(cè)選取IID4B10進(jìn)行小鼠腹水制備，3只小鼠10 d共收集12 ml腹水，間接ELISA 法檢測(cè)腹水效價(jià)為1∶3.18×105。

2.5單克隆抗體腹水純化利用飽和硫酸銨鹽析法和蛋白A親和層析柱純化后的腹水，通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)，可見(jiàn)雜質(zhì)蛋白被大量去除，純化后的單克隆抗體純度達(dá)95%以上，回收率達(dá)80%。經(jīng)SDS-PAGE證實(shí)，電泳形成2條大小分別約為50 kD和25 kD的IgG重鏈與輕鏈條帶(圖3)，分子量大小符合鼠源抗體特點(diǎn)。BCA法測(cè)腹水純化后蛋白質(zhì)量濃度為1.086 mg/ml。

圖1　免疫沉淀獲取mAb結(jié)合的抗原Fig.1　Antigen was obtained by immunoprecipitationNote: A.SDS-PAGE(Coomassie blue staining)；B.Western blot.M.Marker;1.Leukocyte protein+Cell supernatant+Protein G；2.Cell supernatant+Protein G；3.Leukocyte protein+Protein G.

圖2　Western blot篩選S100A9單抗細(xì)胞株Fig.2　Monoclonal antibody cell strains against S100A9 screened by Western blot Note: M.Marker；A.SDS-PAGE(Coomassie blue staining); B-N.Western blot.

2.6單克隆抗體亞類鑒定以捕獲ELISA法測(cè)定抗S100A9單克隆抗體亞類，如表1所示，S100A9單克隆抗體重鏈為IgG1，輕鏈為kappa型(圖4)。

2.7親和力測(cè)定結(jié)果高親和力的抗體在短時(shí)間內(nèi)可結(jié)合較多的抗原，且抗原-抗體復(fù)合物解離的半衰期也更長(zhǎng)，在免疫學(xué)使用中效果也較好。2條反應(yīng)曲線如圖5所示，ⅡD4B10所分泌的單克隆抗體與抗原結(jié)合達(dá)到飽和的50%所需單克隆抗體的濃度分別為0.746 μg/ml、0.479 μg/ml，代入親和力公式計(jì)算可得Ka為3.54×108L/mol。

圖3　SDS-PAGE 檢測(cè)純化前后抗體純度Fig.3　Identification of purity of antibody by SDS-PAGENote: M.Marker；1.No purified ascites；2.Ammonium sulfate purified antibody；3.Other protein；4.Affinity chromatography purified antibody.

表1S100A9單克隆抗體亞型鑒定

Tab.1Subtype identification of S100A9 mAb

1234567SubdassIgG1IgG2aIgG2bIgG3IgMKappaLambdaOD450nm1.2920.0920.0910.0680.0660.5510.059

圖4　S100A9 mAb 抗體亞型Fig.4　Subtype of S100A9 mAb

圖5　S100A9 抗體親和常數(shù)測(cè)定曲線Fig.5　Curve for determination of affinity constant of S100A9 mAb

表2S100A9單抗與其他競(jìng)爭(zhēng)物的交叉反應(yīng)

Tab.2Percent cross-reactivity of S100A9 mAb with compete compounds

S100proteinfamily(recombinantprotein)IC50(ng/ml)Cross-reactivity(%)S100A99.89100%S100A8>2.0×103<0.12S100A12>1.0×104<0.03S100A13>1.0×104<0.03

圖6　Western blot檢測(cè)人乳腺癌組織中S100A9蛋白Fig.6　Western blot detection S100A9 in breast cancer tissue of human Note: A.Negative control PBS；B.Purified antibody.M.Marker；1.S100A9 recombinant protein；2.Human breast cancer tissue

2.8單克隆抗體特異性的測(cè)定測(cè)定S100A9單克隆抗體的特異性見(jiàn)表2，由表可以看出它與S100A8的交叉反應(yīng)率小于0.12%，與其他競(jìng)爭(zhēng)物的交叉反應(yīng)率均小于0.03%，說(shuō)明本試驗(yàn)制備的抗S100A9單克隆抗體的特異性較強(qiáng)。

2.9Western blot法檢測(cè)分析利用純化好的S100A9小鼠腹水檢測(cè)其識(shí)別人乳腺癌組織中蛋白的情況。結(jié)果顯示(圖6)：在分子量為14 kD附近處出現(xiàn)特異性條帶，說(shuō)明該抗體特異性識(shí)別人乳腺癌組織中的S100A9蛋白。

圖7　免疫組織化學(xué)檢測(cè)分析S100A9單抗染色人乳腺癌石蠟切片(×200)Fig.7　Detection of S100A9 protein expression in human breast cancer tissues(×200)Note: A.Negative control normal breast tissue；B.Breast cancer tissue.

2.10檢測(cè)人乳腺癌組織中S100A9蛋白表達(dá)乳腺癌組織中S100A9陽(yáng)性染色主要定位于細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色，定位清晰[10]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7：人正常乳腺組織中未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)，人乳腺癌組織中S100A9抗原表達(dá)呈陽(yáng)性，自制的S100A9單抗對(duì)人乳腺癌組織中的S100A9蛋白具有識(shí)別能力。

3　討論

免疫原的選擇是抗體制備至關(guān)重要的一步，由于完整細(xì)胞通常具有強(qiáng)免疫原性，無(wú)需佐劑輔助[11]，能保持蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)，故本研究以健康人外周血白細(xì)胞作為免疫原，制備抗天然蛋白的高特異性mAb。白細(xì)胞免疫小鼠后，豐富的蛋白被加工提呈，可產(chǎn)生大量的抗體，免疫后小鼠血清抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果證實(shí)白細(xì)胞免疫小鼠取得了理想的免疫效果。根據(jù)克隆選擇原理，特異性免疫細(xì)胞可產(chǎn)生針對(duì)所有抗原的各種TCR、BCR和抗體[12]，在單克隆抗體篩選的過(guò)程中，每個(gè)克隆的特異性都會(huì)得到體現(xiàn)。因此，本研究首先通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)法對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行非特異性陽(yáng)性篩選，然后再對(duì)單克隆細(xì)胞株進(jìn)行抗體特異性鑒定?；谌藗儗?duì)抗原的認(rèn)識(shí)比對(duì)抗體的認(rèn)識(shí)更加完善、深入的現(xiàn)狀，本研究采取免疫沉淀技術(shù)獲取與雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體結(jié)合的抗原，再通過(guò)質(zhì)譜法鑒定抗原的性質(zhì)，以此推斷抗體的性質(zhì)，由此建立了一種全細(xì)胞免疫制備單抗的篩選鑒定方法。然而，免疫細(xì)胞化學(xué)法對(duì)表達(dá)量較少的膜表面抗原靈敏度欠佳，因此，對(duì)于針對(duì)細(xì)胞膜抗原的抗體篩選方法仍有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探索。

S100A9蛋白主要定位表達(dá)于中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的胞質(zhì)中，分別占胞內(nèi)蛋白的45%和1%[3]，這使其容易作為優(yōu)勢(shì)抗原參與免疫應(yīng)答，在mAb的鑒定過(guò)程中首先被明確性質(zhì)。S100A9蛋白分子量約14 kD[13]，在鑒定過(guò)程中，部分樣品在28 kD附近也出現(xiàn)了特異性結(jié)合條帶，這可能與S100A9蛋白常以同型二聚體形式存在相關(guān)[14]。為了得到純度較高的抗體，本研究先將腹水用飽和硫酸銨鹽析法沉淀，再用蛋白G親和層析法純化，此方法結(jié)合了硫酸銨鹽析法回收率較高和蛋白G親和層析法純化得到的抗體純度高的優(yōu)點(diǎn)。間接ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)為1∶3.18×105，親和力常數(shù)為 3.54×108L/mol，依據(jù)Beatty[15]等的結(jié)論，親和常數(shù)為107～1012L/mol可視為高親和力抗體，說(shuō)明該單抗與S100A9蛋白具有高結(jié)合力與親和力。該抗體可檢測(cè)人乳腺癌組織中S100A9蛋白的表達(dá)，這為該抗體在免疫組化中的應(yīng)用提供了依據(jù)。

S100A9蛋白能夠參與炎癥反應(yīng)，介導(dǎo)髓系細(xì)胞的遷移潛力，調(diào)節(jié)髓系細(xì)胞的成熟，富集髓源性抑制細(xì)胞促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[4]。已有研究證實(shí)S100A9與許多疾病的相關(guān)性，例如S100A9在正常人血清含量為(338±202) ng/ml，在免疫性疾病或炎癥狀態(tài)下含量激增，并且在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)腔液、慢性肺病患者病灶局部和痰液、炎性腸病的糞便、腎小球腎炎的腎組織中都可檢測(cè)到S100A9的高表達(dá)[16]。S100A9的定位也與癌癥中心的炎癥或其他病理過(guò)程相關(guān)，S100A9在乳腺癌、肝癌、胃癌、肺癌、結(jié)直腸癌等許多癌癥類型上調(diào)[17]。目前多種在疾病的位點(diǎn)阻止S100A9和/或其活動(dòng)的治療策略正在開(kāi)發(fā)，例如炎癥、癌癥、心血管疾病、阿爾茨海默氏病等[18-20]。隨著對(duì)S100A9蛋白研究的深入，S100A9單抗的應(yīng)用將會(huì)更加廣泛，本研究中S100A9抗原來(lái)自白細(xì)胞天然蛋白，這將使該抗體在未來(lái)的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用中更具有優(yōu)勢(shì)。

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[收稿2016-03-08修回2016-04-17]

(編輯許四平)

Development and identification of mouse anti-human S100A9 natural protein

MI Dan-Yang，DUAN Rui，SONG Jun-Ying，SUN Xiang-Dong，ZHANG Zhong-Yun，YAN Min，YUAN Yong，ZHANG Zhen-Qiang，ZHANG Gai-Ping，LIU Wen-Di.

Traditional Chinese Medicine Immunology Laboratory,Henan University of Traditional Chinese Medicine/Zhengzhou Key Laboratory of Antibodomics，Zhengzhou 450046,China

Objective:To prepare and identify the mouse anti-human monoclonal antibodies (mAbs) using leukocytes as immunogens. Methods: The mice were immunized using human peripheral blood leukocytes.Then,use of B lymphocyte hybridoma technology preparation of mAbs,followed screening by immunocytochemistry and limited dilution.The secreted mAbs were identified by immunoprecipitation,mass spectrometry,Western blot,ELISA and immunohistochemistry.Results: The 35 positive polyclonal cells were obtained,of which 11 strains secreted mAbs against S100A9.And one strain was used to prepare monoclonal antibody.The purified mAb against S100A9 were purified and identified as IgG1 subtype,with the titer,purity and affinity constant was 1∶3.18×105,95% and 3.54×108L/mol,respectively.This mAb generally had 0.12 % crossed reactivity to S100A8 ,and showed little or no cross reactivity to S100A12 and S100A13.The prepared monoclonal antibodies can specifically recognizes the S100A9 antigen in human breast cancer tissues．Conclusion: Successful preparation of mAb against S100A9,which can secrete specific mAb against S100A9 protein with high titers and specificity have been established successfully，which laid the foundation for the immunology application.

Leukocyte；S100A9；Monoclonal antibody；Immunity characterisation

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.10.017

米丹陽(yáng)(1987年-)，女，碩士，助理實(shí)驗(yàn)師，主要從事醫(yī)學(xué)免疫學(xué)研究，E-mail:amymidanyang@163.com。

及指導(dǎo)教師：劉文第(1954年-)，男，教授，主要從事抗體組學(xué)研究，E-mail:wendiliu@163.com。

R392.11

A

1000-484X(2016)10-1485-06

①本文為2015年度河南省科技創(chuàng)新人才計(jì)劃(No.154100510019)河南中醫(yī)學(xué)院創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(No.2014XCXTD01)和河南中醫(yī)學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng)課題(No.2014KYYWF-ZZCX3-06)。

②河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南450002。