于淑靜　周蓮娣　魏彩冰　孫宗良　張起輝　陶　崑

(重慶醫(yī)科大學(xué)分子醫(yī)學(xué)與腫瘤研究中心，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，重慶400016)

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·中醫(yī)中藥與免疫·

表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)對(duì)免疫性肝損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究①

于淑靜周蓮娣魏彩冰孫宗良張起輝②陶崑

(重慶醫(yī)科大學(xué)分子醫(yī)學(xué)與腫瘤研究中心，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，重慶400016)

目的：探討表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)對(duì)雷公藤甲素(TP)誘導(dǎo)的免疫性肝損傷的保護(hù)性作用及其作用機(jī)制。方法：雌性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為4組，即正常對(duì)照組、EGCG對(duì)照組、TP組、EGCG治療組。以賴(lài)氏法檢測(cè)血清中ALT水平，以分光光度法檢測(cè)肝勻漿中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和還原型谷胱甘肽(GSH)的變化情況，以HE染色觀測(cè)小鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)變化，以ELISA方法檢測(cè)肝臟中白細(xì)胞介素(IL)-17和IL-6的表達(dá)水平，以Western blot方法檢測(cè)肝臟中Toll樣受體4(TLR4)的表達(dá)情況。結(jié)果：TP組小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶水平明顯高于正常對(duì)照組(P<0.005)，EGCG對(duì)照組與正常對(duì)照組比較無(wú)變化(P>0.05)，而EGCG治療組小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶水平與TP組相比下降明顯(P<0.005)。TP組小鼠肝臟病理切片示較多肝細(xì)胞壞死和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，EGCG對(duì)照組和正常對(duì)照組小鼠肝臟形態(tài)學(xué)基本正常，EGCG治療組示肝細(xì)胞炎癥壞死程度較TP組有大幅減輕。TP組小鼠肝臟中MDA、IL-17及IL-6水平明顯高于正常對(duì)照組(P<0.005)，而SOD和GSH水平明顯低于正常對(duì)照組(SOD，P<0.05;GSH,P<0.005)，EGCG對(duì)照組與正常對(duì)照組比較無(wú)變化(P>0.05)，EGCG治療組小鼠肝臟中MDA、IL-17及IL-6水平均下降明顯(P<0.005)，而SOD和GSH水平均增高，與TP組比較有顯著性差異(SOD,P<0.05;GSH,P<0.005)。TP組肝臟TLR4蛋白表達(dá)水平高于正常對(duì)照組，EGCG對(duì)照組與正常對(duì)照組比較無(wú)變化(P>0.05)，而EGCG治療組TLR4水平顯著降低。結(jié)論：EGCG對(duì)TP所致小鼠肝損傷有明顯的保護(hù)作用，可能與其抗氧化作用及對(duì)炎癥因子的調(diào)節(jié)有關(guān)。

表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯；雷公藤甲素；肝損傷；炎癥因子；抗氧化作用

兒茶素沒(méi)食子酸酯(Epigallocatechin-3-gallate,EGCG)是從綠茶中提取的一種多酚性化合物，具有抗炎和抗氧化等作用[1]?？捎行е委熁蚓徑飧螕p傷，但其具體機(jī)制尚不明確，有待探究。雷公藤甲素(Triptolide，TP)，又稱(chēng)雷公藤內(nèi)酯醇或雷公藤內(nèi)酯，是從衛(wèi)矛科植物雷公藤(Trip terygiumwilfordii Hook·F)、 昆明山海棠 (T.Hypoglaucum Levl Hukeda)、蒼山雷公藤(T.ForretiiDials)和東北雷公藤(T． Regelli Sprague et Taketa)等植物中分離得到的一種二萜內(nèi)酯類(lèi)化合物[2]，該類(lèi)化合物具有免疫抑制、抗炎、抗生育及抗腫瘤等生物活性，在臨床上得到廣泛的運(yùn)用，但其毒性較強(qiáng)，可導(dǎo)致肝臟、胃腸道、骨髓、心臟和腎臟等器官的實(shí)質(zhì)性損傷[3,4]。300～1 000 μg/kg的TP能夠引起肝脂質(zhì)過(guò)氧化和肝細(xì)胞壞死而最終造成肝損傷[5,6]。而EGCG已被證實(shí)對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的肝損傷、酒精性肝損傷和非酒精性脂肪肝具有保護(hù)作用[7-9]。

另外，研究表明免疫性肝損傷與促炎癥細(xì)胞因子IL-17和IL-6密切相關(guān)，可激活多種免疫細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致肝臟反復(fù)炎癥損傷和肝功能下降[10-13]。同時(shí)，Toll樣受體4(TLR4)能夠促進(jìn)肝損傷，在肝損傷發(fā)生機(jī)制中起重要作用[14]。

因此，本實(shí)驗(yàn)以TP構(gòu)建小鼠肝損傷模型，并以EGCG對(duì)模型進(jìn)行干預(yù)治療，通過(guò)觀察炎癥相關(guān)因子IL-17、IL-6、TLR4和氧化指標(biāo)丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和還原型谷胱甘肽(GSH)的變化情況，從抗炎和抗氧化兩方面研究EGCG對(duì)TP誘導(dǎo)的免疫性肝損傷的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑TP及EGCG購(gòu)自四川省維克奇生物科技有限公司，ALT、MDA、SOD和GSH試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，小鼠IL-17和IL-6檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海橋杜生物科技有限公司，組織裂解液、BCA蛋白測(cè)定試劑盒、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠試劑盒、超敏化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，TLR4抗體購(gòu)自萬(wàn)類(lèi)生物有限公司。

1.1.2動(dòng)物模型制作和分組C57BL/6雌性小鼠(體重18～20 g)，購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，C57BL/6小鼠共40只，隨機(jī)分成4組：正常對(duì)照組、EGCG對(duì)照組、TP組、EGCG治療組，每組10只。EGCG對(duì)照組和EGCG治療組每天經(jīng)灌胃給予5 mg/kg的EGCG，2次/d，共10 d，正常對(duì)照組和TP組同時(shí)給予等體積的生理鹽水。10 d后，TP組和EGCG治療組的小鼠灌胃給予0.5 mg/kg的TP，正常對(duì)照組和EGCG對(duì)照組同時(shí)給予等體積的生理鹽水。22 h后取各組小鼠外周血并處死取肝組織。

1.2方法

1.2.1小鼠血清ALT檢測(cè)小鼠麻醉后，摘除小鼠眼球取血，常溫1 200 r/min離心10 min，取血清，用微板賴(lài)氏法檢測(cè)血清ALT水平。

1.2.2HE染色觀測(cè)肝臟組織形態(tài)學(xué)改變小鼠麻醉后處死，無(wú)菌取肝臟組織，4%多聚甲醛液浸泡固定、脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟、HE染色、透明、封片，最后顯微鏡下觀察染色效果，并于×200下拍照。

1.2.3IL-17、IL-6、SOD、MDA和GSH的水平測(cè)定取適量肝臟，用生理鹽水制備10%的肝勻漿，爾后采用分光光度法檢測(cè)MDA、SOD及GSH水平，采用ELISA方法檢測(cè)肝勻漿中IL-17和IL-6的水平。

1.2.4Western blot法檢測(cè)TLR4蛋白的表達(dá)取適量肝組織，裂解液處理后，12 000 r/min離心10 min，取上清，用BCA法測(cè)定蛋白濃度，經(jīng)配膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵一抗、二抗后發(fā)光，凝膠圖像分析儀曝光拍照。β-actin 作為內(nèi)參對(duì)照，比較不同組間TLR4蛋白表達(dá)差異。

2　結(jié)果

2.1各組小鼠血清ALT水平結(jié)果顯示(圖1)：TP組血清中ALT水平較正常對(duì)照組顯著升高(P<0.005)，EGCG對(duì)照組與正常對(duì)照組比較無(wú)變化(P>0.05)，EGCG治療組血清ALT水平較TP組明顯降低(P<0.005)。

圖1　各組小鼠血清ALT水平Fig.1　Levels of ALT in mice of each groupNote: *.P<0.005 vs normal control group or TP group.

圖2　EGCG 對(duì)免疫性肝損傷小鼠肝臟的影響(×200)Fig.2　Effects of EGCG on liver in mice with immuno-logical liver injury (×200)

GroupsIL-17(pg/ml)IL-6(pg/ml)MDA(nmol/mg)SOD(U/mg)GSH(μmol/g)Controlgroup163.15±11.83105.39±13.181.22±0.88401.70±38.4624.00±4.98EGCGgroup156.69±6.29100.30±8.471.07±0.35396.04±25.9222.78±3.52TPgroup267.94±19.781)217.72±22.711)3.91±1.381)337.58±29.202)1.92±0.281)TP+EGCGgroup176.22±17.823)101.66±14.873)0.78±0.133)398.62±39.134)3.59±0.713)

Note：1)P<0.005,2)P<0.05 vs control group；3)P<0.005,4)P<0.05 vs TP group.

圖3　各組小鼠肝臟TLR4蛋白表達(dá)水平的比較Fig.3　Protein expression of TLR4 among various groupsNote: **.P<0.005 vs normal control group;*.P<0.05 vs TP group.

2.2HE染色結(jié)果正常對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞形態(tài)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，匯管區(qū)區(qū)分清晰。EGCG對(duì)照組小鼠可見(jiàn)肝細(xì)胞形態(tài)基本正常，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，匯管區(qū)正常。TP組小鼠肝細(xì)胞明顯水腫，充血壞死，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，并有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。EGCG治療組小鼠可見(jiàn)肝細(xì)胞水腫減輕，肝小葉結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少(見(jiàn)圖2)。

2.3IL-17、IL-6、MDA、SOD及GSH水平檢測(cè)與正常對(duì)照組比較，TP組小鼠肝勻漿IL-17、IL-6和MDA水平明顯升高(P<0.005)，SOD和GSH水平明顯下降(SOD,P<0.05;GSH,P<0.005)。EGCG對(duì)照組與正常對(duì)照組比較無(wú)變化(P>0.05)。EGCG治療組小鼠肝勻漿中IL-17、IL-6和MDA水平明顯降低(P<0.005)，SOD和GSH水平明顯升高，與TP組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(SOD,P<0.05;GSH,P<0.005)，見(jiàn)表1。

2.4TLR4表達(dá)檢測(cè)各組小鼠肝組織在42 kD和120 kD處有特異免疫反應(yīng)蛋白條帶，蛋白灰度值分析結(jié)果顯示TP組小鼠肝臟TLR4蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于正常對(duì)照組(P<0.005)，EGCG對(duì)照組與正常對(duì)照組比較無(wú)變化(P>0.05)，而EGCG治療組小鼠肝臟TLR4蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于TP組(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

3　討論

EGCG是從綠茶中提取的一種多酚化合物，有抗炎及抗氧化作用，研究表明EGCG能夠逆轉(zhuǎn)刀豆蛋白引起的肝組織中MDA、SOD、GSH、IL-6和TLR4等的變化水平，即EGCG能通過(guò)抗氧化和抗炎機(jī)制修復(fù)肝損傷[9]。同時(shí)，EGCG對(duì)四氯化碳引起的肝損傷的保護(hù)也與其抗炎及抗氧化作用有關(guān)[12]。因此，本實(shí)驗(yàn)擬從抗炎和抗氧化兩方面來(lái)探討EGCG保護(hù)TP誘導(dǎo)的免疫性肝損傷的作用機(jī)制。

TP具有免疫抑制、抗炎、抗生育及抗腫瘤等生物活性，因此得以廣泛運(yùn)用，但應(yīng)用過(guò)程中其毒性和不良反應(yīng)不容忽視，其中關(guān)于肝毒性的報(bào)道最多。研究表明，TP可通過(guò)多種機(jī)制引起肝損傷，如誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、誘導(dǎo)iNOS表達(dá)、引起免疫性損傷等[15]。研究表明，TP能致小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶明顯升高，肝組織中MDA含量明顯增加，SOD和 GSH 活性明顯降低，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明TP誘導(dǎo)的肝損傷作用與誘導(dǎo)氧化應(yīng)激關(guān)系密切[16-18]。丁虹等通過(guò)研究得出以下結(jié)論，經(jīng)腹腔給予小鼠TP后發(fā)現(xiàn)肝TNF和NO釋放增加，這提示了免疫損傷在TP誘導(dǎo)的肝損傷中至關(guān)重要[3,19]。

實(shí)驗(yàn)中，灌胃給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物0.5 mg/kg的TP后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其血清中ALT的水平明顯升高，肝組織中MDA含量明顯增加，SOD和 GSH活性明顯降低，肝臟病理切片也支持嚴(yán)重的肝損傷的結(jié)論，而經(jīng)EGCG治療后的小鼠肝臟形態(tài)學(xué)損傷減輕，血清中ALT的含量明顯下降，肝組織中MDA含量明顯下降，SOD和 GSH活性明顯提高，這些說(shuō)明EGCG確實(shí)對(duì)TP所致的肝損傷有保護(hù)作用，且這種保護(hù)作用與其具有抗氧化作用密不可分。

另外，TP組小鼠肝臟IL-17、IL-6和TLR4水平均有不同程度提高，EGCG使它們水平下降，提示EGCG在減輕肝損傷的同時(shí)亦降低了IL-17、IL-6和TLR4的水平，這一過(guò)程與肝臟中的炎癥因子水平變化息息相關(guān)。由此可以推斷，EGCG對(duì)TP所致的免疫性肝損傷的保護(hù)作用與其抗炎作用也有關(guān)。

總之，我們通過(guò)檢測(cè)氧化應(yīng)激指標(biāo)和細(xì)胞因子的變化情況，明確了TP誘導(dǎo)肝損傷與免疫因子的關(guān)聯(lián)性，也闡明了EGCG保護(hù)雷公藤甲素所致的小鼠肝損傷的機(jī)制，即EGCG通過(guò)抗氧化作用和對(duì)炎性因子的調(diào)節(jié)作用，保護(hù)了TP所致的免疫性肝損傷。

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[收稿2015-12-15修回2016-02-17]

(編輯張曉舟)

Study of protective effect of EGCG on immunological liver injury and relevant mechanism

YU Shu-Jing,ZHOU Lian-Di,WEI Cai-Bing,SUN Zong-Liang,ZHANG Qi-Hui,TAO-Kun.

Research Center of Molecular Medicine and Cancer，College of Basic Medical Sciences,Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China

Objective:To investigate the protective effect of Epigallocatechin-3-gallate (EGCG) on triptolide (TP)-induced immunological liver injuries,and explore the relevant mechanisms of action.Methods: A total of 40 female C57BL/6 mice were randomly divided into four groups: control group,EGCG group,TP group and TP+EGCG group.The ALT levels in serum was examined by Reitman Frankel method.The activity of hepatic MDA,SOD and GSH was examined by spectrophotometry.HE staining was used to observed the changes of the hepatic histopathology.The hepatic IL-17,IL-6 levels was examined by ELISA and the expression of hepatic TLR4 protein was examined by Western blot.Results: The results showed that serum alanine aminotransaminase (ALT) levels of TP group were obviously elevated (P<0.005,vs normal control group) and serum ALT levels were obviously reduced in EGCG treatment group(P<0.005,vs normal TP group).There were no significantly differences between EGCG group and control group (P>0.05).Meanwhile,EGCG could ameliorate hepatic pathological damage.Furthermore,in TP group,the activity of malondialdehyde (MDA),the expression of Toll-like receptor 4 (TLR4) protein and the contentration of hepatic interleukin (IL)-17,IL-6 were higher than normal control group (P<0.005).On the contrary,the activity of superoxide dismutase (SOD) and restored glutathione (GSH) were significantly lower than normal control group (SOD，P<0.05;GSH,P<0.005).In EGCG treatment group,the expression of TLR4 protein and the concentration of MDA,hepatic IL-17 and IL-6 were lower than TP group (TLR4,P<0.05;MDA,P<0.005;IL-17,P<0.005;IL-6,P<0.005).On the contrary,SOD and GSH were significantly higher than TP group (SOD，P<0.05;GSH,P<0.005).Conclusion: This study suggests that EGCG possesses hepatoprotective effect against TP-induced immunological liver injury through its anti-inflammatory and anti-oxidant actions.

EGCG;TP;Liver injury;Inflammatory cytokines;Antioxidant effect

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.10.011

于淑靜(1988年-)，女，主要從事天然藥物對(duì)肝損傷的免疫治療方面的研究，E-mail：893879387@qq.com。

及指導(dǎo)教師：周蓮娣(1978年-)，女，博士，講師，碩士生導(dǎo)師，主要從事天然產(chǎn)物對(duì)免疫機(jī)制調(diào)控的相關(guān)研究，E-mail：1356874164@qq.com。

陶崑(1968年-)，女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤免疫治療及白血病免疫治療研究，E-mail：taokun68@126.com。

R965

A

1000-484X(2016)10-1458-04

①本文為重慶市基礎(chǔ)與前沿研究項(xiàng)目(cstc2014jcyjA10108)和中央高?；緲I(yè)務(wù)費(fèi) (CQDXWL-2014-Z007；201310611045)。

②重慶大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶400044。