陳曉香　張俊華　盛家和

(鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院,河南省腫瘤醫(yī)院,鄭州450008)

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胸腺在EAE小鼠不同臨床時(shí)期變化的研究

陳曉香張俊華盛家和①

(鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院,河南省腫瘤醫(yī)院,鄭州450008)

目的：探討胸腺在EAE小鼠不同臨床時(shí)期的變化。方法：記錄小鼠EAE模型誘導(dǎo)后第0、10、15、20天的胸腺指數(shù)和胸腺細(xì)胞數(shù)；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)觀察胸腺細(xì)胞的凋亡比例和脾臟CD4+CD44+T細(xì)胞的比例；應(yīng)用PCR和電泳技術(shù)觀察凋亡因子p53和Bcl-2的含量變化。結(jié)果：EAE小鼠在第0、10、15天胸腺指數(shù)和胸腺細(xì)胞數(shù)相應(yīng)地逐漸減少；第10、15天胸腺細(xì)胞凋亡率升高，第10天最高；CD4+CD44+T細(xì)胞比例在第10、15天升高，第10天最高；EAE誘導(dǎo)第10天胸腺細(xì)胞p53含量升高，而B(niǎo)cl-2含量降低。結(jié)論：EAE小鼠誘導(dǎo)后第15天胸腺萎縮最嚴(yán)重，第10天凋亡率最高，并且與基因p53和Bcl-2調(diào)控有關(guān)；EAE小鼠胸腺變化與小鼠發(fā)病關(guān)系密切，并且胸腺又先于臨床癥狀恢復(fù)。

EAE；胸腺；凋亡；CD4+CD44+T細(xì)胞

多發(fā)性硬化癥(Multiple sclerosis,MS)是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥和脫髓鞘為發(fā)病特點(diǎn)，細(xì)胞免疫介導(dǎo)的自身免疫性疾病[1]。目前實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)是MS的理想動(dòng)物模型[2]。胸腺是T淋巴細(xì)胞分化發(fā)育成熟的主要中樞免疫器官，同時(shí)脾臟是T淋巴細(xì)胞成熟的外周免疫器官。凋亡是T淋巴細(xì)胞在胸腺中分化發(fā)育成熟的重要環(huán)節(jié)[3]。前期有研究稱(chēng)在EAE小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)其淋巴器官存在大量的凋亡現(xiàn)象[4]。并且有研究證實(shí)了在EAE小鼠胸腺細(xì)胞中主要的凋亡細(xì)胞群是CD4+CD8+細(xì)胞(Double positive,DP)[5]。那么關(guān)于EAE誘導(dǎo)后不同時(shí)期小鼠胸腺萎縮和細(xì)胞凋亡情況的變化以及脾臟CD4+T細(xì)胞的變化鮮有報(bào)道，并且這些差異與EAE小鼠的發(fā)病情況的關(guān)系也少有報(bào)道。另外，我們通過(guò)流式分析來(lái)檢測(cè)小鼠外周脾臟CD4+T細(xì)胞的活化情況來(lái)了解其遷移情況，并初步解釋EAE小鼠的發(fā)病機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料C57BL/6小鼠，體質(zhì)量(20±2)g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)在SPF級(jí)環(huán)境中；髓鞘少突膠質(zhì)糖蛋白(Myelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG)，購(gòu)于上海吉爾生化公司；弗氏完全佐劑(Complete freund′s adjuvant,CFA)，滅活結(jié)核分枝桿菌含量5 mg/ml，百日咳毒素(Pertussis toxin,PT)均購(gòu)于上海三踏生物科技有限公司；大鼠抗小鼠抗體CD4-FITC、CD44-PE等購(gòu)于eBioscience公司；Annexin V/PI凋亡試劑盒和引物p53和Bcl-2購(gòu)于上海生工生物工程股份有限公司；TRIzol試劑，PCR擴(kuò)增混合物(Invtrogen公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(愛(ài)康生物)；流式細(xì)胞儀，BD Calibur(美國(guó))。

1.2方法

1.2.1EAE小鼠模型誘導(dǎo)5 mg/ml CFA與1.5 mg/ml MOG按照1∶1比例混勻，使用乳化管反復(fù)推拉混勻，形成油包水樣的乳劑。兩點(diǎn)背部皮下免疫，使用量為200 μl/只；同時(shí)在免疫的第0天和第2天尾靜脈注射PT試劑，用量2 μl/只。每天記錄小鼠的臨床評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分，正常小鼠；0.5分，尾巴部分癱瘓；1分，尾巴完全癱瘓；1.5分，一后肢無(wú)力；2分，兩后肢均無(wú)力；2.5分，一后肢癱瘓，一后肢無(wú)力；3分，兩后肢均癱瘓；3.5分，前肢無(wú)力；4分，一前肢無(wú)力，一前肢癱瘓；4.5分，前肢完全癱瘓；5分，死亡。

1.2.2獲得胸腺和脾臟分別在EAE小鼠誘導(dǎo)后的第0、10、15、20天取3只小鼠，稱(chēng)量每只小鼠體重，然后頸椎脫臼處死小鼠，打開(kāi)小鼠胸腔暴露心臟上方白色的胸腺，從根部摘除胸腺。觀察胸腺大小，并稱(chēng)量相應(yīng)小鼠胸腺重量，記錄各個(gè)階段每個(gè)小鼠胸腺指數(shù)(100×胸腺重量/小鼠重量)[6]。按照同樣的方法摘除小鼠脾臟。

1.2.3分離小鼠胸腺細(xì)胞和脾臟細(xì)胞使用剪刀將小鼠的脾臟和胸腺剪碎，使用研磨棒研磨脾臟和胸腺組織塊，充分研磨后濾網(wǎng)過(guò)濾，1 800 r/min離心5 min棄上清，重懸胸腺細(xì)胞備用。脾臟細(xì)胞懸液需要使用紅細(xì)胞裂解液ACK裂解紅細(xì)胞1 min，PBS終止裂解反應(yīng)后，70 μm濾網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液，1 800 r/min離心5 min棄上清，重懸細(xì)胞備用。

1.2.4凋亡檢測(cè)和流式檢測(cè)取胸腺細(xì)胞1×106，按照生工Annexin V/PI試劑盒的操作步驟進(jìn)行凋亡檢測(cè)。取脾臟細(xì)胞2×106，標(biāo)記抗小鼠流式抗體CD4-FITC、CD44-PE，使用FlowJo軟件分析胸腺細(xì)胞凋亡情況和脾臟細(xì)胞CD4+T細(xì)胞的活化情況。

1.2.5凋亡基因檢測(cè)1 ml TRIzol (106細(xì)胞/管)，提取小鼠胸腺細(xì)胞中總mRNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟獲得DNA。DNA定量?jī)x上計(jì)數(shù)DNA量，每只小鼠取等量的DNA進(jìn)行DNA擴(kuò)增。擴(kuò)增后的產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠(1%溴化乙錠)，100V 50A環(huán)境下進(jìn)行檢測(cè)。獲得的瓊脂糖凝膠條帶使用BanScan 5.0進(jìn)行定量分析。

2　結(jié)果

2.1EAE小鼠不同臨床時(shí)期胸腺萎縮情況EAE誘導(dǎo)后第9～10天小鼠開(kāi)始發(fā)病，出現(xiàn)尾部無(wú)力麻痹等癥狀，隨后波及小鼠的后肢乃至前肢，第15天小鼠發(fā)病達(dá)到最高峰(圖1A)，第20～22天小鼠的癥狀明顯減輕，逐漸恢復(fù)(圖1A)；小鼠開(kāi)始發(fā)病至高峰期胸腺指數(shù)逐漸降低，在EAE小鼠恢復(fù)前期,即第20天，胸腺指數(shù)又恢復(fù)近正常(圖1B)。

2.2EAE小鼠不同臨床時(shí)期胸腺細(xì)胞數(shù)變化獲取胸腺細(xì)胞懸液后，記錄胸腺細(xì)胞數(shù)：小鼠開(kāi)始發(fā)病至高峰期后，與正常小鼠(44.33±9.262)相比，第10天(28.33±6.386)和第15天(3.477±1.818)的胸腺細(xì)胞明顯減少，并且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但是在恢復(fù)前期第20天(32.53±6.474)，胸腺細(xì)胞明顯恢復(fù)，且與正常小鼠的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

2.3EAE小鼠不同臨床時(shí)期胸腺細(xì)胞凋亡情況在EAE誘導(dǎo)后第0、10、15、20天4個(gè)時(shí)間點(diǎn)流式檢測(cè)凋亡細(xì)胞(Annexin V+細(xì)胞)的比例，發(fā)現(xiàn)在EAE誘導(dǎo)后第10天胸腺細(xì)胞的凋亡率最高，與正常組小鼠的凋亡細(xì)胞比例差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而EAE誘導(dǎo)后第15和第20天，凋亡率僅略高于正常組小鼠(圖3A)。我們?nèi)〉蛲雎首罡叩牡?0天胸腺細(xì)胞，通過(guò)提取總mRNA，逆轉(zhuǎn)錄，PCR擴(kuò)增和凝膠電泳來(lái)檢測(cè)基因p53和Bcl-2的含量，發(fā)現(xiàn)凋亡基因p53顯著增加而抗凋亡基因Bcl-2明顯減少(圖3B)。

圖1　EAE小鼠臨床評(píng)分和胸腺指數(shù)Fig.1　Clinical score and thymic index of EAE mice

圖2　EAE誘導(dǎo)后第0、10、15、20天小鼠胸腺細(xì)胞數(shù)Fig.2　Thymocyte number at 0,10,15,20 days after EAE induction

圖3　EAE小鼠不同臨床時(shí)期胸腺細(xì)胞凋亡情況Fig.3　Different clinical period EAE mice thymus cell apoptosisNote: A.Percent of thymocyte apoptosis;B.The content of gene p53 and Bcl-2 at 10 days after EAE induction.

圖4　EAE誘導(dǎo)后第0、10、15、20天小鼠脾臟CD4+CD44+T細(xì)胞比例Fig.4　Percent of CD4+CD44+T cells in spleen at 0,10,15,20 days after EAE induction

2.4EAE小鼠不同臨床時(shí)期脾臟CD4+T細(xì)胞活化情況獲取各個(gè)時(shí)間點(diǎn)小鼠脾臟細(xì)胞，流式檢測(cè)CD4+CD44+活化細(xì)胞的比例，我們可以發(fā)現(xiàn)：第10天和第15天脾臟CD4+T細(xì)胞的活化比例顯著升高，并且與正常組小鼠差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在恢復(fù)前期第20天活化細(xì)胞的比例降低，但是仍舊高于正常組小鼠(圖4)。

3　討論

MS可引起視神經(jīng)、腦和脊髓等神經(jīng)障礙，并且由于其較高的發(fā)病率、慢性病程和青壯年易得而引起廣大學(xué)者的關(guān)注。CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞是浸潤(rùn)MS患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要細(xì)胞，尤其是CD4+T淋巴細(xì)胞[7]。因此，胸腺作為T(mén)淋巴細(xì)胞成熟的主要器官，將會(huì)是我們研究的主要內(nèi)容。眾所周知，胸腺是一個(gè)極其容易萎縮的器官，很多情況都可引起胸腺細(xì)胞的凋亡，例如：壓力[8]、感染等等。Francelin等[6]學(xué)者發(fā)現(xiàn)瘧原蟲(chóng)感染模型中胸腺細(xì)胞大量凋亡并且促使未成熟CD4+CD8+T細(xì)胞釋放至外周。但是，關(guān)于EAE小鼠誘導(dǎo)后不同臨床時(shí)期小鼠胸腺萎縮和細(xì)胞凋亡情況少有報(bào)道，并且這些差異可在一定程度上解釋EAE小鼠的發(fā)病機(jī)制。同時(shí)，我們檢測(cè)了凋亡基因p53和Bcl-2在凋亡率最高時(shí)間點(diǎn)的含量，來(lái)研究凋亡基因是否有參與胸腺細(xì)胞的凋亡。為了能夠更有說(shuō)服力的驗(yàn)證胸腺細(xì)胞凋亡與EAE小鼠的發(fā)病機(jī)制存在一定的聯(lián)系，我們流式檢測(cè)小鼠外周脾臟CD4+T細(xì)胞的活化比例(CD4+CD44+)，因?yàn)榛罨?xì)胞比例升高，證明細(xì)胞的遷移能力也升高，在EAE小鼠體內(nèi)這種活化的細(xì)胞一定會(huì)遷移至其致病部位，即中樞神經(jīng)系統(tǒng)。通過(guò)這些研究，我們可以初步解釋CD4+T細(xì)胞在EAE誘導(dǎo)后的成熟、活化和遷移情況，使我們對(duì)EAE小鼠的發(fā)病機(jī)制有更深一步的理解。

EAE誘導(dǎo)后記錄其臨床評(píng)分，通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)我們繪制出小鼠臨床評(píng)分表現(xiàn)為：第10天小鼠開(kāi)始發(fā)病，誘導(dǎo)后第15天小鼠發(fā)病達(dá)到高峰期，第22天小鼠開(kāi)始恢復(fù)。綜合考慮實(shí)驗(yàn)?zāi)康模覀冞x取第0、10、15、20天4個(gè)時(shí)間點(diǎn)來(lái)研究。我們發(fā)現(xiàn)在第0、10、15天3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，小鼠的胸腺指數(shù)逐漸降低，并且三者的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。相應(yīng)的我們發(fā)現(xiàn)：正常小鼠胸腺細(xì)胞數(shù)是(44.33±9.262)×106，第10天減少至(28.33±6.386)×106，第15天細(xì)胞數(shù)最低(3.477±1.818)×106三者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但是在恢復(fù)前期第20天細(xì)胞數(shù)增加至(32.53±6.474)×106，這些變化與胸腺指數(shù)的變化一致，說(shuō)明胸腺在EAE小鼠從開(kāi)始發(fā)病至發(fā)病高峰期逐漸萎縮，并且在臨床恢復(fù)前期自我恢復(fù)。緊接著，我們流式檢測(cè)了胸腺細(xì)胞中凋亡細(xì)胞(Annexin V+)[9]在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的差異，我們發(fā)現(xiàn)：正常小鼠胸腺凋亡細(xì)胞的比例為(1.09±0.08)%，在第10天細(xì)胞凋亡率達(dá)到最高(6.48±0.79)%，在發(fā)病高峰期第15天凋亡率明顯降低至(1.76±0.23)%，第20天恢復(fù)至正常。因此我們得出結(jié)論在這4個(gè)時(shí)間點(diǎn)胸腺細(xì)胞的凋亡率在EAE誘導(dǎo)后第10天最高，所以我們選用了第10天的胸腺細(xì)胞來(lái)研究p53和Bcl-2[10]的關(guān)系。經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄，PCR擴(kuò)增和凝膠電泳，我們發(fā)現(xiàn)凋亡率最高的胸腺細(xì)胞中促凋亡基因p53升高和抗凋亡基因Bcl-2降低，這些變化在一定程度上說(shuō)明p53和Bcl-2調(diào)控了EAE小鼠胸腺細(xì)胞的凋亡。最后，我們研究了外周脾臟CD4+T細(xì)胞的活化情況，發(fā)現(xiàn)第10、15天CD4+CD44+T細(xì)胞的比例顯著升高，并且第10天活化細(xì)胞的比例最高。

綜上所述，我們認(rèn)為在EAE小鼠第10天胸腺細(xì)胞的凋亡情況最嚴(yán)重并且外周CD4+T細(xì)胞的活化比例也最高，但是胸腺的萎縮和細(xì)胞的數(shù)量變化均在發(fā)病高峰期第15天最明顯，說(shuō)明EAE小鼠在第10天胸腺細(xì)胞通過(guò)高凋亡率來(lái)加快T淋巴細(xì)胞的分化和成熟，最終促使第15天小鼠T細(xì)胞浸潤(rùn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)最嚴(yán)重。同時(shí)，在我們研究中發(fā)現(xiàn)EAE小鼠發(fā)病前期第20天，胸腺細(xì)胞數(shù)、胸腺細(xì)胞的凋亡率和脾臟CD4+T細(xì)胞的活化程度均接近正常小鼠，說(shuō)明胸腺先于臨床癥狀的自復(fù)能力[3]。Duszczyszyn等[11]學(xué)者認(rèn)為RRMS患者體內(nèi)可見(jiàn)明顯的胸腺萎縮，同時(shí)又補(bǔ)償性的升高外周T細(xì)胞的增殖反應(yīng)來(lái)產(chǎn)生患者體內(nèi)的自體反應(yīng)性淋巴細(xì)胞。前期也有研究稱(chēng)大量凋亡現(xiàn)象存在于EAE小鼠的免疫器官中，并且這些凋亡可改變Th1/Th2的免疫反應(yīng)，增加MOG-T細(xì)胞的產(chǎn)生，進(jìn)而加強(qiáng)EAE臨床表現(xiàn)[4]。同時(shí)也有報(bào)道稱(chēng)胸腺可通過(guò)IL-17信號(hào)通路加速Foxp3+T細(xì)胞的分化，進(jìn)而改善EAE小鼠的臨床癥狀[12]?？梢?jiàn)，胸腺可調(diào)節(jié)EAE小鼠的發(fā)病和恢復(fù)。我們的研究與前期研究結(jié)果證實(shí)了胸腺在EAE小鼠發(fā)病初期通過(guò)增加凋亡率來(lái)促使疾病的發(fā)展，而又先于臨床癥狀恢復(fù)來(lái)促使疾病的恢復(fù)。

雖然，我們的研究在一定程度上探討了胸腺在EAE不同臨床時(shí)期的變化，也能在一定程度上解釋EAE小鼠的發(fā)病機(jī)制和胸腺在EAE小鼠發(fā)病過(guò)程中的主要作用。但是，我們的研究還不能詳細(xì)闡述T淋巴細(xì)胞在胸腺中的分化發(fā)育成熟機(jī)制與EAE小鼠臨床癥狀的關(guān)系，更不能解釋外周活化T細(xì)胞是通過(guò)什么樣的機(jī)制穿過(guò)血腦屏障并遷移至致病部位的。所以，T細(xì)胞在胸腺中的發(fā)育過(guò)程和T細(xì)胞從外周免疫器官遷移至中樞神經(jīng)系統(tǒng)的過(guò)程，將會(huì)是我們以后的研究重點(diǎn)。

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[收稿2015-11-20]

(編輯倪鵬)

Study on change of thymus in different clinical period of EAE mice

CHEN Xiao-Xiang,ZHANG Jun-Hua，SHENG Jia-He.

Department of Clinical Laboratory，The Affiliated Tumor Hospital of Zhengzhou University,Henan Tumor Hospital,Zhengzhou 450008,China

Objective:To investigate the change of thymus in different period of EAE mice.Methods: The thymic index and thymocyte number at 0,10,15,20 days after EAE induced were recorded.The percent of thymic apoptosis and CD4+CD44+T cells in spleen was acquired by Flow Cytometry.The content of p53 and Bcl-2 gene was detected by PCR and electrophoretic technique.Results: The thymic index and thymocyte number correspondingly reduced at 0,10,15 days after EAE induced.Apoptotic rate of thymocyte increased at 10,15 days after EAE induced,highest at 10 days.The percent of CD4+CD44+T cells also increased at 10,15 days after EAE induced,highest at 10 days.The content of p53 increased,while Bcl-2 reduced at 10 days after EAE induced.Conclusion: The atrophy of thymus is most serious at 15 days after induction;while the apoptotic percent is highest at 10 days after induction,which have a relationship with regulation of p53 and Bcl-2.The change of thymus in EAE mice closely related with EAE attack,and the recovery of thymus precede EAE.

EAE;Thymus;Apoptosis;CD4+CD44+T cells

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.10.010

，E-mail：shjh6208@163.com。

陳曉香(1967年-)，女，副主任技師，主要從事自身免疫性疾病與分子診斷學(xué)方面的研究，E-mail:15936229361@163.com。

R392.3

A

1000-484X(2016)10-1454-04