張婧婧　趙慶偉　楊景瑞　段巨洪　于海川

(河南省新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院分子診斷與醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，新鄉(xiāng)453003)

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吉西他濱對(duì)人非小細(xì)胞肺癌HCC827活性和凋亡的影響

張婧婧趙慶偉楊景瑞段巨洪于海川

(河南省新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院分子診斷與醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，新鄉(xiāng)453003)

目的：研究吉西他濱對(duì)人非小細(xì)胞肺癌HCC827細(xì)胞活性以及凋亡的影響，以及與Bcl-2表達(dá)的關(guān)系。方法：采用cell counting kit-8法、細(xì)胞核Hochest33258染色法、流式細(xì)胞儀Annexin V-FITC/PI 雙染法等多種方法，體外研究吉西他濱對(duì)人非小細(xì)胞肺癌HCC827的活性、凋亡和細(xì)胞周期的影響；采用Western blot法，觀察藥物作用后細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果：吉西他濱(0.1～1 000 ng/ml)對(duì)人非小細(xì)胞肺癌HCC827活性具有抑制作用，并有促凋亡效應(yīng)。此外，可以將細(xì)胞阻滯在S期。在吉西他濱誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程中，凋亡因子Bcl-2蛋白的表達(dá)下調(diào)。結(jié)論：吉西他濱可以抑制人非小細(xì)胞肺癌HCC827細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，S期周期阻滯，其誘導(dǎo)的凋亡可能是其殺死腫瘤細(xì)胞的主要機(jī)制之一，此外，凋亡與相關(guān)基因Bcl-2蛋白的表達(dá)具有一定關(guān)系。

細(xì)胞凋亡；人非小細(xì)胞肺癌HCC827細(xì)胞；吉西他濱；Bcl-2蛋白

肺癌是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其總發(fā)病數(shù)占全部惡性腫瘤發(fā)病數(shù)的21%左右，而死亡數(shù)占總癌癥死亡數(shù)的24%左右，并呈明顯上升趨勢(shì)[1,2]。在所有的肺癌病例中，70%～80%為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)[3，4]。目前臨床上化療仍然是非小細(xì)胞肺癌的傳統(tǒng)治療方法。

在上個(gè)世紀(jì)90年代，臨床上出現(xiàn)了一批治療肺癌的細(xì)胞毒藥物如紫杉醇、長(zhǎng)春瑞濱、吉西他濱等[5-7]。而其中吉西他濱(Gemcitabine，GEM)是對(duì)NSCLC最有效果的化療藥物之一[8]。GEM 為去氧胞苷的衍生物，其結(jié)構(gòu)和代謝均與阿糖胞苷相似，屬抗代謝類抗癌藥，1996年被美國(guó)FDA批準(zhǔn)為非小細(xì)胞肺癌和胰腺癌的一線化療藥物[9,10]。有研究報(bào)道吉西他濱的抗腫瘤可能是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡達(dá)到殺死肺癌細(xì)胞的，但具體機(jī)制尚不清楚。Bcl-2是一種非常強(qiáng)的凋亡拮抗基因，Bcl-2蛋白能夠阻斷細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[11,12]。本研究主要是考察吉西他濱對(duì)人非小細(xì)胞肺癌HCC827細(xì)胞的凋亡作用以及凋亡相關(guān)因子Bcl-2蛋白在吉西他濱誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的作用。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑吉西他濱(CAS號(hào)：95058-81-4，含量≥98.9%)購(gòu)自北京諾其雅生物科技有限公司；RPMI1640 培養(yǎng)基，小牛血清購(gòu)自Gibco公司；Bcl-2單克隆抗體(Trevigen，美國(guó))購(gòu)于艾美捷科技有限公司；cell counting kit-8(CCK-8)試劑(DOJINDO，日本)盒購(gòu)自上海華雅思創(chuàng)生物科技有限公司；Hochest 33258染色試劑盒(KEYGEN)購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；AnnexinV-FITC/PI雙染凋亡試劑盒(Invitrogen，美國(guó))購(gòu)自重慶市華雅干細(xì)胞技術(shù)有限公司；Western blot 所用試劑均購(gòu)自北京信諾金達(dá)生物科技有限公司。

1.1.2儀器恒溫恒濕細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Scientific，美國(guó))購(gòu)自上海輔澤商貿(mào)有限公司；多功能酶標(biāo)儀(Hidex，芬蘭) 購(gòu)自東樂(lè)自然基因生命科學(xué)公司；流式細(xì)胞儀(HPC-100，加拿大)購(gòu)自普瑞麥迪(北京)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司；熒光顯微鏡(XY40S)購(gòu)自香港先達(dá)分析儀器有限公司；近紅外雙色激光成像系統(tǒng) (Licor Biosciences) 來(lái)自于美國(guó)Odyssey公司。

1.1.3細(xì)胞株人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞HCC827，為上皮細(xì)胞樣細(xì)胞，由中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)提供。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞株培養(yǎng)HCC827細(xì)胞培養(yǎng)在RPMI1640培養(yǎng)液(含10%小牛血清)中，并置于5%CO2、37℃、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶的70%～80%時(shí)，用0.25%的胰蛋白酶(含0.02% EDTA)消化，然后放培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞活性檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCC827細(xì)胞，胰酶消化后制成1×105ml-1的細(xì)胞懸液，取100 μl接種于96孔板中，每組設(shè)4個(gè)平行孔。待貼壁后，加入不同濃度的吉西他濱，分別置培養(yǎng)箱中孵育24、48、72 h。吸出含藥培養(yǎng)液，加入含10%CCK-8的新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育15～30 min，以不含藥物的細(xì)胞做為空白對(duì)照組，然后用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm吸光度值(A450)。細(xì)胞活性(%)=實(shí)驗(yàn)組平均A450值÷對(duì)照組平均A450值×100%。

1.2.3細(xì)胞核形態(tài)學(xué)觀察取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCC827細(xì)胞，用 0.25%胰酶消化后，以 1×105孔-1的密度接種于6孔板中，加入不同濃度藥物處理48 h后，去掉舊培養(yǎng)液，加入含10 μg/ml Hochest 33258的細(xì)胞培養(yǎng)液染色20～30 min，然后用磷酸緩沖液(PBS)沖洗三遍，再加入適量PBS。用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核的形態(tài)。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期藥物處理HCC827細(xì)胞48 h后，用胰酶消化細(xì)胞后，將細(xì)胞分散均勻，然后收集細(xì)胞。先用1 000 r/min離心5 min，去掉上清培養(yǎng)基。再加入1 ml 4℃預(yù)冷的乙醇(70%)，用移液槍混勻。4℃固定過(guò)夜，為了除去乙醇，通過(guò)1 000 r/min離心5 min，去掉上清，然后加適量RNA酶，37℃中水浴1 h，將細(xì)胞分成兩組：第一組，加入0.5 mg/L碘化丙啶(PI)及Annexin V-FITC在冰浴中染色10～20 min，最后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。采用Cell Quest軟件分析細(xì)胞凋亡率；第二組，將離心固定的細(xì)胞用PI避光染色25 min，于流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞周期，并分析統(tǒng)計(jì)細(xì)胞周期比例。

1.2.5Western blot檢測(cè)Bcl-2蛋白表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCC827細(xì)胞，胰酶消化后分散均勻，以5×105ml-1的密度接種到6孔板中，每孔1 ml細(xì)胞混懸液。待細(xì)胞貼壁后，給予不同濃度的吉西他濱藥物作用48 h，消化細(xì)胞并收集，用4℃預(yù)冷的PBS洗滌，再通過(guò)蛋白裂解液4℃裂解細(xì)胞20 min，隨后用12 000 r/min在4℃下離心20 min，收集上清液，即為細(xì)胞總蛋白，用Bradford法進(jìn)行蛋白含量測(cè)定。蛋白變性后，以50 μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳(10%分離膠，5% 濃縮膠)。電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%PBST牛血清白蛋白封閉液封閉，再進(jìn)行Bcl-2相應(yīng)抗體孵育，最后采用近紅外雙色激光成像系統(tǒng)進(jìn)行成像和蛋白含量檢測(cè)。

2　結(jié)果

2.1細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果如表1所示，0.1～1 000 ng/ml的吉西他濱分別作用24、48、72 h后對(duì)HCC827細(xì)胞的活性均有一定的抑制作用，并且呈濃度和時(shí)間依賴性 (P<0.05)。

2.2細(xì)胞核形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果如圖1所示，對(duì)照組的HCC827細(xì)胞核形態(tài)完整，0.1、10、1 000 ng/ml吉西他濱分別處理HCC827細(xì)胞48 h后，細(xì)胞出現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、細(xì)胞核固縮、凋亡小體等凋亡特點(diǎn)，而且隨著藥物濃度的增加，凋亡現(xiàn)象更明顯。

2.3細(xì)胞凋亡率檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，細(xì)胞經(jīng)過(guò)0、0.1、10、1 000 ng/ml吉西他濱處理48 h后，細(xì)胞主要分布在Q2和Q3區(qū)，而Q2區(qū)為細(xì)胞凋亡區(qū)。經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)分析，如表2所示，作用72 h后，0、0.1、10、1 000 ng/ml吉西他濱處理的細(xì)胞的凋亡率分別為(3.5±1.2)%、(20.9±1.5)%、(43.9±2.1)%、(84.6±2.5)%，隨著藥物濃度增加細(xì)胞凋亡增加。

2.4細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果如表3所示，細(xì)胞經(jīng)過(guò)0、0.1、10、1 000 ng/ml吉西他濱處理48 h后，G0/G1期細(xì)胞比例不斷下降，而S期細(xì)胞比例不斷上升，對(duì)細(xì)胞周期有明顯影響，將細(xì)胞阻滯在S期。

Cellviability(%)0ng/ml0.1ng/ml1ng/ml10ng/ml100ng/ml1000ng/ml24h100±3.697.6±1.993.6±1.31)68.6±1.51)49.9±2.41)30.6±4.21)48h100±2.883.9±5.11)89.9±2.21)53.6±2.11)33.6±2.81)20.1±1.81)72h100±2.380.8±4.61)76.9±3.31)46.5±3.21)26.9±1.11)11.3±3.41)

Note：1)P<0.05,compared with the 0 ng/ml control group in the same treating time.

圖1　細(xì)胞核Hoechst33258熒光染色結(jié)果Fig.1　Result of nucleus Hoechst33258 staining

圖2　流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡Fig.2　Apoptosis detected by flow cytometry

圖3　Western blot檢測(cè)Bcl-2蛋白表達(dá)情況Fig.3　Bcl-2 protein expression detected by Western blot

GEMconcentration(ng/ml)00.1101000Apoptosisrate(%)3.5±1.2%20.9±1.5%1)43.9±2.1%1)84.6±2.5%1)

Note：1)P<0.05,compared with 0 ng/ml control group.

Cellcycle(%)G0/G1SG2/M052.1±2.427.9±1.220±2.90.150.6±3.132.5±2.816.9±1.61043.1±2.11)38.4±1.51)18.5±2.8100026.9±2.62)60.9±1.82)12.2±4.2

Note：1)P<0.05，2)P<0.01,compared with 0 ng/ml control group intra-group.

表4Bcl-2蛋白表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)結(jié)果

Tab.4Statistical results of Bcl-2 protein expression

GEMconcentration(ng/ml)00.1101000Bcl-2level260.9±8.9231.1±4.91)162.9±9.71)46.9±8.31)

Note：1)P<0.05,compared with 0 ng/ml control group.

2.5Bcl-2蛋白表達(dá)水平檢測(cè)如圖3所示，經(jīng)灰度分析，0、0.1、10、1 000 ng/ml吉西他濱處理48 h后，細(xì)胞中Bcl-2蛋白灰度值逐漸降低。經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)分析得出結(jié)果如表4所示，Bcl-2的表達(dá)水平隨著藥物濃度的提高而逐漸下降，與0 ng/ml空白對(duì)照組相比存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

3　討論

非小細(xì)胞肺癌最常見(jiàn)的、死亡率很高的一種惡性腫瘤。吉西他濱目前已被臨床證實(shí)為治療非小細(xì)胞肺癌高效低毒的藥物之一，已有文獻(xiàn)報(bào)道其抗腫瘤的機(jī)制可能與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。細(xì)胞凋亡是一種細(xì)胞程序性死亡方式，通常它是在嚴(yán)密調(diào)控的基因介導(dǎo)發(fā)生的主動(dòng)自殺的過(guò)程。腫瘤細(xì)胞的凋亡及其相關(guān)基因調(diào)控過(guò)程已成為了國(guó)際腫瘤研究的一個(gè)熱點(diǎn)[13，14]。

本課題中，我們考察了吉西他濱對(duì)HCC827細(xì)胞凋亡的影響。通過(guò)細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒(CCK-8)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)吉西他濱可以明顯的抑制HCC827細(xì)胞的增殖活性。通過(guò)細(xì)胞核特異性染料Hochest33258染色法可以觀察到HCC827細(xì)胞凋亡的細(xì)胞核形態(tài)學(xué)變化。藥物處理后，細(xì)胞核出現(xiàn)固縮和片段化，這可能是細(xì)胞凋亡過(guò)程中出現(xiàn)的凋亡小體。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)雙染法，測(cè)得細(xì)胞的凋亡率為(3.5±1.2)%、(20.9±1.5)%、(43.9±2.1)%、(84.6±2.5)%。以上結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，吉西他濱可以誘導(dǎo)HCC827細(xì)胞發(fā)生明顯的凋亡，是一種有效的治療非小細(xì)胞肺癌的藥物。但是吉西他濱誘導(dǎo)的凋亡過(guò)程涉及了哪些凋亡蛋白是值得研究的問(wèn)題。

Bcl-2 家族蛋白質(zhì)在細(xì)胞凋亡的調(diào)控過(guò)程中起到了非常重要的作用[15,16]。有研究證實(shí)，Bcl-2 家族蛋白可以影響PT通道(可以無(wú)選擇性地允許≤1.5 kD 分子通過(guò))開(kāi)放及其細(xì)胞色素C(Cyto-c)、凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)的釋放，還可以改變線粒體膜的通透性[17-19]。Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)的話，會(huì)阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生，提高細(xì)胞的存活率，而B(niǎo)cl-2蛋白下調(diào)的話，將促進(jìn)細(xì)胞凋亡[20]。在本研究中，我們采用 Western blot法，來(lái)檢測(cè)吉西他濱處理細(xì)胞前后，Bcl-2蛋白表達(dá)的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，吉西他濱作用HCC827細(xì)胞后，Bcl-2蛋白的表達(dá)下調(diào)。因此，我們推測(cè)這可能是Bcl-2蛋白的下調(diào)影響了PT通道的開(kāi)放以及Cyto-c、AIF的釋放、線粒體外膜的通透性，從而促進(jìn)了HCC827細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)吉西他濱具有顯著抑制非小細(xì)胞肺癌HCC827細(xì)胞體外活性的效果，其抗腫瘤機(jī)制可能與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞周期S期阻滯有關(guān)，此外，凋亡因子Bcl-2蛋白在吉西他濱誘導(dǎo)的凋亡過(guò)程中起到了一定的作用。

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[收稿2016-01-25修回2016-03-09]

(編輯許四平)

Effect of Gemcitabine on viability and apoptosis of non-small cell lung cancer HCC827 in vitro

ZHANG Jing-Jing,ZHAO Qing-Wei,YANG Jing-Rui,DUAN Ju-Hong,YU Hai-Chuan.

Collaborative Innovation Center of Henan Province,Institute of Medical Laboratory Scinence and Molecular Diognostics and Medical Laboratory Technology,Xinxiang 453003,China

Objective:To observe the effect of Gemcitabine (GEM) on the viability and apoptosis of non-small cell lung cancer HCC827 in vitro.Methods: The cell viability,apoptosis and cell cycle of HCC827 cells induced by Gemcitabine were detected with cell counting kit-8 assay (CCK-8),Annexin V-FITC/PI staining and flow cytometry.The expression of Bcl-2 protein of cells treated with GEM was examined by Western blot assay.Results: There was significant inhibition effect on HCC827 cells treated with 0.1-1 000 ng/ml of GEM,which can promote the occurrence of HCC827 cell apoptosis and arrest cell in the S phrase.The apoptosis induced by GEM was accompanied with the down regulation of Bcl-2 protein.Conclusion: GEM can inhibit the cell viability and induce the HCC827 cell apoptosis and S phrase arrest.Its cell dead type was apoptosis,which was related with the expression of Bcl-2 protein.

Cell apoptosis;Human non-small cell lung cancer HCC827 cell;Gemcitabine;Bcl-2 protein

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.10.009

張婧婧(1982年-)，女，碩士，實(shí)驗(yàn)師，主要從事分子免疫學(xué)研究。

及指導(dǎo)教師：于海川(1979年-)，男，博士，副教授，主要從事造血免疫分化方面的研究。

R734.2

A

1000-484X(2016)10-1450-04