丁海霞　王富軍　劉　貝　史　寧　杜亞萍　齊會卿　丁　娟

(河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院內分泌科，石家莊050000)

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人臍帶血干細胞移植對2型糖尿病家兔血清學的影響①

丁海霞王富軍劉貝史寧杜亞萍齊會卿丁娟

(河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院內分泌科，石家莊050000)

目的：觀察人臍帶血干細胞(Human umbilical cord blood stem cells，HUCBSC)移植后2型糖尿病家兔血糖、胰島素及二肽基肽酶Ⅳ ( Dipeptidyl peptidase-Ⅳ,DPP-Ⅳ/CD26 )的變化。方法：18只家兔隨機分成正常對照組(6只,C組)和糖尿病造模組(12只)，造模組制備2型糖尿病模型，其中6只經兔耳緣靜脈輸注給予免疫學表型為CD45+、CD34-的HUCBSC移植(A組)，6只同法輸注等量的PBS液作為對照(B組)。以上三組家兔均喂養(yǎng)觀察4周，每天監(jiān)測家兔血糖，每周測血胰島素及DPP-Ⅳ/CD26的水平。結果：HUCBSC陽性標志物CD45表達率達100%，陰性標志物CD34表達率為3.5%。與非移植組相比，HUCBSC移植組家兔血糖和DPP-Ⅳ/CD26逐漸下降，胰島素水平逐漸上升，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結論：HUCBSC呈圓形或橢圓形貼壁生長，免疫學表型為CD45+、CD34-。HUCBSC移植可以明顯降低家兔血糖、增加胰島素分泌量、降低血DPP-Ⅳ/CD26的水平，從而為臨床糖尿病及其并發(fā)癥的治療提供新的理論依據。

人臍帶血干細胞；2型糖尿病；家兔；血清學

近年來，糖尿病的發(fā)病率逐年增加，而糖尿病所致的高血糖主要是由于患者的胰島素分泌絕對或相對不足所致，長期存在的高血糖可導致心、腦、眼、腎等各種組織的慢性損害和功能障礙[1]。糖尿病最根本的治療方法是胰腺或胰島移植促進胰島素分泌，但終因來源匱乏、價格昂貴且需終生服用免疫抑制劑而無法廣泛應用于臨床，因此需要尋找更好的治療方法。而人臍帶血干細胞因其可分化為胰島β細胞分泌胰島素使得其在糖尿病治療中的效果備受關注[2]，與骨髓干細胞和外周血干細胞相比，臍帶血干細胞具有來源廣泛、免疫源性低、增殖能力強等特點[3,4]，本研究中對其CD45+、CD34-的免疫學表型進行鑒別，可用來區(qū)別血液中的造血干細胞、間充質干細胞和內皮祖細胞，目前已有25 000多例臨床移植成功的案例[5,6]。因此用臍帶血干細胞移植治療糖尿病及其并發(fā)癥成為研究的熱點。

此外，研究發(fā)現(xiàn)，二肽基肽酶Ⅳ(Dipeptidyl pep-tidase-Ⅳ,DPP-Ⅳ/CD26)參與了2型糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展[7,8]。與非糖尿病組相比，2型糖尿病患者血清中可溶性DPP-Ⅳ濃度顯著增加。因此，本實驗通過經家兔耳緣靜脈移植臍帶血干細胞，觀察其對糖尿病家兔血糖、胰島素和DPP-Ⅳ/CD26水平的影響，以期為臍帶血干細胞應用于治療糖尿病及其并發(fā)癥提供更多的理論依據。

1　材料與方法

1.1材料健康家兔18只(河北醫(yī)科大學動物實驗中心提供)，體重(2.7±0.5)kg。淋巴細胞分離液由天津顥陽公司(密度為1.077 g/ml)提供，低糖DMEM培養(yǎng)液、 0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液于北京索萊寶科技有限公司購買，CD34單抗-PE、CD45單抗-PE購買于德國美天旎公司，超凈工作臺購于美國Biological公司，倒置相差顯微鏡購于日本三洋公司，恒溫培養(yǎng)箱由中國常州華普達儀器制造廠提供，200目一次性尼龍膜美國Sigma公司，流式細胞儀、高速離心機購于德國Heraeus公司，血糖測定試劑盒由保定長城臨床試劑公司提供，血糖監(jiān)測采用羅氏血糖儀，胰島素ELISA試劑盒由Mercodia公司提供，DPP-Ⅳ/CD26 ELISA試劑盒購買于北京百奧萊博科技有限公司。

1.2方法

1.2.1HUCBSC混懸液的制備臍帶血由石家莊市婦產醫(yī)院提供，來源于足月分娩的健康產婦，乙肝、艾滋、梅毒等檢測均呈陰性，產婦及其家屬均簽署知情同意書，實驗方案經醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。取新鮮臍帶血8例，每例取50～80 ml(6 h內用畢)，用PBS液等倍稀釋后置于50 ml離心管中，按1∶1比例加入至人淋巴細胞分離液上，4℃，2 000 r/min，離心20 min后，臍帶血分5層，中間白膜層即為單個核細胞。用移液器小心吸取富含單個核細胞的懸液以2∶1比例放入備好的兩個離心管內，4℃，1 000 r/min離心15 min，PBS洗滌3次。細胞數(shù)量較多的離心管用低糖DMEM培養(yǎng)液懸浮，計數(shù)細胞濃度為5×105ml，HUCBSC混懸液制備成功，細胞數(shù)量較少的離心管內的細胞凍存后用于細胞表型的鑒定。

1.2.2HUCBSC表型的鑒定成功復蘇細胞后以1×106ml-1接種于60 mm×15 mm培養(yǎng)皿中，放于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，以低糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，每天換液，培養(yǎng)7 d后細胞貼壁良好，細胞鋪滿80%～90%皿底，倒掉培養(yǎng)基，PBS沖洗3遍后，對貼壁干細胞拍照觀察其形態(tài)學表現(xiàn)，加入0.25%胰酶-EDTA消化液消化貼壁干細胞，鏡下觀察待細胞間隙增大停止消化。用無菌吸管反復吹打貼壁細胞至脫落，將細胞懸液吸入離心管中，1 000 r/min離心3 min，加入2 ml PBS液稀釋，吹打均勻后移入EP管中，在每個EP管中加入10 μl CD34單抗-PE和10 μl CD45單抗-PE，常溫下避光染色30min。PBS液沖洗后加入1 ml PBS液，每個EP管中的細胞懸液用200目一次性尼龍膜分別過濾，流式細胞儀上機檢測細胞表面標志物CD34和CD45的表達。

1.2.3兔2型糖尿病模型的制備12只家兔基礎飼料適應性喂養(yǎng)1 周，給予100 g高脂飼料喂養(yǎng)，高脂飼料配方：2%膽固醇、1%脫氧膽酸鈉、5%豬油、92%普通飼料。第5周所有動物禁食16 h(不禁水)，經耳緣靜脈一次快速注射STZ 60 mg/kg，于STZ 造模后第1 周、第2 周分別空腹采血1 次。采血后及時分離血清，測定FBG，以空腹血糖≥11.0 mmol/L為2型糖尿病造模成功。

1.2.4臍帶血干細胞移植術12只2型糖尿病家兔造模成功后，隨機分成兩組，其中一組經耳緣靜脈輸注臍帶血干細胞懸液2 ml，濃度為5×105個/ml(A組),其余6只家兔經耳緣靜脈輸注等量的PBS液作為對照(B組)。正常對照組(C組)家兔和上述兩組家兔均喂養(yǎng)觀察4周，每天監(jiān)測家兔血糖，每周通過ELISA法檢測家兔血胰島素及DPP-Ⅳ/CD26水平，采血及血糖監(jiān)測時間均為夜間空腹10 h后次日晨8點。

2　結果

2.1HUCBSC表型的鑒定倒置顯微鏡下觀察到的HUCBSC呈貼壁生長，細胞形態(tài)為圓形或橢圓形(見圖1A)。經流式細胞儀檢測貼壁生長的HUCBSC陰性標志物CD34表達率為3.5%(見圖1B)，陽性標志物CD45表達率達100%(見圖1C)。

圖1　HUCBSC的免疫學表型特征Fig.1　Immunophenotype character of HUCBSCNote: A.HUCBSCwere round or oval,with adherent growth (×200).B.Expression of CD34 in HUCBSC was negative and negative expression rate was 96.5%；C.Expression of CD45 in HUCBSC was positive and positive expression rate was 100%.

表1移植前后各組家兔血糖水平的變化

Tab.1Changes of blood glucose levels in rabbits before and after transplantation

GroupsBloodglucose(mmol/L)BeforeOneweeklaterFourweekslaterFPA21.22±1.123)13.22±1.182)3)7.87±1.22)3)195.5050.000B21.18±1.393)21.93±1.781)3)21.92±1.761)3)0.0490.952C5.50±0.411)2)5.53±0.321)2)5.53±0.291)2)0.0190.981F471.110257.911305.023P0.0000.0000.000

Note：Compared with group A，1)P<0.01；compared with group B，2)P<0.01；compared with group C，3)P<0.01.

表2移植前后各組家兔胰島素水平的變化

Tab.2Changes of insulin levels in rabbits before and after transplantation

GroupsInsulin(mU/L)BeforeOneweeklaterFourweekslaterFPA3.78±0.283)10.88±0.912)3)18.13±0.812)3)590.2450.000B3.72±0.273)3.72±0.281)3)3.77±0.291)3)0.0620.940C25.65±1.041)2)25.75±1.181)2)25.63±1.191)2)0.0180.982F2331.364984.0741021.327P0.0000.0000.000

Note：Compared with group A，1)P<0.01;compared with group B，2)P<0.01;Compared with group C,3)P<0.01.

表3移植前后各組家兔血DPP-Ⅳ/CD26水平的變化

Tab.3Changes of blood DPP-Ⅳ/CD26 levels in rabbits before and after transplantation

GroupsBeforeDPP-Ⅳ(ng/ml)OneweeklaterDPP-Ⅳ(ng/ml)FourweekslaterDPP-Ⅳ(ng/ml)FPA19.06±1.213)12.93±0.862)3)8.82±0.402)3)201.2950.000B19.08±1.223)19.05±1.251)3)19.02±1.091)3)0.0050.995C4.35±0.331)2)4.22±0.291)2)4.32±0.291)2)0.3110.737F424.132419.692714.584P0.0000.0000.000

Note：Compared with group A,1)P<0.01;compared with group B,2)P<0.01;compared with group C,3)P<0.01.

2.2HUCBSC移植后對家兔血糖、胰島素及DPP-Ⅳ/CD26水平的影響18只家兔均進入結果分析，中途無脫落，與正常對照組(C組)相比，2型糖尿病造模組造模后血糖、DPP-Ⅳ/CD26明顯升高，血胰島素水平較正常明顯減低，差異有統(tǒng)計學意義。臍帶血干細胞移植組(A組)在移植后血糖及DPP-Ⅳ/CD26的水平逐漸下降，胰島素水平逐漸上升，與非移植組(B組)比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1～3。

3　討論

糖尿病以其高發(fā)生率、高致殘率和高死亡率嚴重影響著患者的生活質量，甚至危及生命[9]，目前主要應用口服藥物及胰島素注射降糖，但都不能從根本上解決胰島素分泌不足的問題，因此有學者利用臍帶血干細胞移植來治療糖尿病，取得了不錯的療效[10,11]，新生兒臍帶血中含有豐富的造血干細胞，研究發(fā)現(xiàn)，小鼠胰島中有10%～20%的胰島素陽性細胞可檢測出造血干細胞標志物，說明造血干細胞與胰島β細胞再生存在密切的關系[12]。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)臍帶血干細胞移植組家兔血糖逐漸下降，胰島素分泌量逐漸增加，與上述的研究結果一致。臍帶血干細胞移植治療2型糖尿病的機制可能使臍帶血干細胞到達胰腺微環(huán)境，受到定向的誘導從而分化為胰島β細胞，促進胰島細胞的再生，恢復胰島素分泌功能有關[13]。本研究應用的臍帶血干細胞是一種存在于人臍帶血的多能干細胞，形態(tài)學表現(xiàn)為圓形或橢圓形，其CD45+、CD34-的免疫學表型，可用來區(qū)別血液中的造血干細胞、間充質干細胞和內皮祖細胞[14]。

糖尿病并發(fā)癥的發(fā)病機制復雜，研究顯示免疫和炎癥在其病理過程中發(fā)揮重要作用。DPP-Ⅳ酶在1966年首次從大鼠肝臟中分離得到，1990年以來這種能夠降解腸促激素等多肽的水解酶在糖尿病領域逐漸受到重視，1993年，DPP-Ⅳ酶經進一步確認也是一種T細胞激活分子-CD26，DPP-Ⅳ/CD26是一種膜結合蛋白水解酶，廣泛存在于胃腸道、腎臟、淋巴結和結締組織中，同時在免疫細胞及非免疫細胞上均有表達[15]。動物研究表明，糖尿病患者血清中DPP-Ⅳ的增加可能與糖尿病性心肌病有關。血清中的DPP-Ⅳ每增加100 pmol/(min·ml)，左室功能異常發(fā)生的風險增加10%[16]。此外DPP-Ⅳ的活性還與內皮細胞的促凝狀態(tài)有關，DPP-Ⅳ水平升高，可導致血液呈高凝狀態(tài)，說明其與糖尿病血管并發(fā)癥有關[7]。長期的高糖毒性可使腎臟局部生長因子表達增加，導致腎臟基底膜增厚，引起腎小球結構和功能異常。研究發(fā)現(xiàn)伴有尿微量白蛋白增高的2型糖尿病患者其血清DPP-Ⅳ水平明顯高于尿微量白蛋白正常的糖尿病患者，提示DPP-Ⅳ可能參與了糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展[8]。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病造模組，血清DPP-Ⅳ的水平明顯升高，說明DPP-Ⅳ可能參與了糖尿病的發(fā)病，臍帶血干細胞移植后糖尿病家兔血清DPP-Ⅳ的水平明顯降低，由上述研究結果可以推出由DPP-Ⅳ導致的糖尿病相關的腎病、血管病變、心肌病變等并發(fā)癥發(fā)病風險明顯降低，但其具體機制目前仍不清楚。相信隨著我們對臍帶血干細胞和DPP-Ⅳ的關系研究逐漸深入，將為糖尿病及其并發(fā)癥的治療提供更多的思路和方法。

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[收稿2015-12-14修回2016-02-02]

(編輯許四平)

Effection of human umbilical cord blood stem cell transplantation on serum of rabbits with type 2 diabetes mellitus

DING Hai-Xia,WANG Fu-Jun,LIU Bei,SHI Ning,DU Ya-Ping,QI Hui-Qing，DING Juan.

Department of Endocrinology,the Fourth Affiliated Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050000,China

Objective:To observe the changes of blood glucose,insulin and dipeptidyl peptidase-Ⅳ(DPP-Ⅳ/CD26)on type 2 diabetes mellitus in rabbits after HUCBSC(human umbilical cord blood stem cells)transplantation.Methods: 18 rabbits were randomly divided into normal control group (6 rats,Group C) and diabetic model group (12 rats).After preparation model of type 2 diabetes,and 6 rats of them were treated with HUCBSC (CD45+，CD34-) transplantation by ear vein transfusion (Group A),and 6 rats were treated with PBS(Group B).All three groups of rabbits were fed for 4 weeks,and the blood glucose was monitored every day,and the level of blood insulin and DPP-IV/CD26 were measured every week.Results: The negative expression rate of CD34 in HUCBSC was 96.5%.The positive expression rate of CD45 in HUCBSC was 100%.Compared with non transplantation group,the blood glucose and DPP-IV/CD26 in the umbilical cord blood stem cell transplantation group were gradually decreased,and insulin level was gradually increased,the difference was statistically significant (P<0.01).Conclusion: HUCBSC were round or oval,with adherent growth,HUCBSC transplantation can significantly reduce blood glucose,increase insulin secretion,reduce the level of DPP-IV/CD26，the immunological phenotype of HUCBSC was CD45+,CD34-,thus providing a new theoretical basis for the clinical treatment of diabetes and its complications.

Human umbilical cord blood stem cell;Type 2 diabetes mellitus;Rabbits;Serology.

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.10.008

丁海霞(1981年-)，女，博士，主治醫(yī)師，主要從事糖尿病下肢血管病變的研究。

R587.1

A

1000-484X(2016)10-1446-04

①本文為河北省衛(wèi)生廳課題(No.20150760)。