鄭全輝　田　楓　李文婷　張秋如　王　姍

(華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北省慢性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，唐山市慢性病臨床基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，唐山063000 )

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·基礎(chǔ)免疫學(xué)·

miR-150基因缺失對小鼠繁殖和血液學(xué)指標(biāo)的影響①

鄭全輝田楓②李文婷張秋如王姍

(華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北省慢性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，唐山市慢性病臨床基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，唐山063000 )

目的：探討miR-150基因缺失對小鼠繁殖和血液學(xué)指標(biāo)的影響。方法：采用miR-150ko小鼠，觀察該小鼠的窩產(chǎn)仔數(shù)和離乳率及生長曲線，測定其生殖指標(biāo)；以全自動血球計數(shù)儀和自動生化分析儀測定2月齡miR-150ko小鼠和正常對照C57BL/6J小鼠血液細(xì)胞學(xué)和血清生化參數(shù)。結(jié)果：miR-150ko小鼠窩產(chǎn)仔數(shù)與離乳率與C57BL/6J正常對照小鼠相比均顯著下降；miR-150ko小鼠外周血白細(xì)胞計數(shù)、中間細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)、中間細(xì)胞百分比、中性粒細(xì)胞百分比與C57BL/6J小鼠相比顯著升高；而血小板計數(shù)、淋巴細(xì)胞百分比顯著下降；miR-150ko小鼠的血清葡萄糖、總膽固醇水平較正常對照小鼠顯著增高。結(jié)論：miR-150基因缺失可影響到小鼠的繁殖功能，并對某些血液細(xì)胞學(xué)指標(biāo)及血糖、膽固醇水平產(chǎn)生影響。

miR-150；基因缺失；小鼠；繁殖；血液學(xué)

miR-150是一個在哺乳動物組織廣泛表達(dá)的microRNA。已有研究表明，miR-150在乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、肺癌等實(shí)體瘤細(xì)胞和T、B淋巴瘤等白血病細(xì)胞中發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用[1,2]。另外，miR-150在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、重癥肌無力、多發(fā)性硬化癥、敗血癥等自身免疫性和感染性疾病中發(fā)生表達(dá)變化[3-5]，通過調(diào)控miR-150的表達(dá)，可以影響以上疾病的發(fā)生或進(jìn)展?？梢姡琺iR-150在多種組織、細(xì)胞的發(fā)育、分化、凋亡及轉(zhuǎn)化等生理或病理過程中發(fā)揮作用。然而到目前為止，對miR-150的功能研究主要集中在特異的組織或細(xì)胞，而對小鼠整體產(chǎn)生的影響，如對繁殖性能、血液學(xué)參數(shù)等是否會產(chǎn)生影響，國內(nèi)外則鮮有報道。由于多種疾病如腫瘤、自身免疫病的發(fā)生或發(fā)展往往與全身生理或生化機(jī)能改變密切相關(guān)，為此，我們應(yīng)用miR-150基因敲除小鼠(miR-150ko)，從生物整體水平和組織水平上探討miR-150基因缺失對小鼠繁殖和血液細(xì)胞學(xué)及生化指標(biāo)的影響，試圖發(fā)現(xiàn)miR-150基因缺失可能會對何種器官和組織產(chǎn)生影響，從而可能引發(fā)某些相關(guān)疾病，為深入研究miR-150的功能提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料miR-150ko小鼠購自美國Jackson 實(shí)驗(yàn)室，對照C57BL/6J 小鼠購買于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部，許可證號為SCXK (京) 2011-0012。小鼠均飼養(yǎng)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部屏障環(huán)境中，許可證號為SYXK (京) 2011-0039；小鼠飼喂SPF 級全價營養(yǎng)鼠料，由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供，許可證號為SCXK(京) 2014-0010。實(shí)驗(yàn)分為兩組，共40只，8～10周miR-150ko 小鼠20只，雌雄各半，同周齡C57BL/6J小鼠20只，雌雄各半。

1.2方法

1.2.1miR-150ko小鼠基因型鑒定miR-150ko小鼠基因型PCR鑒定以鼠尾DNA為模版，引物分別為：上游：5′-CAAGGACAGGAACCCTTCAGCA-3′；下游：5′-CCATGATGCCTGGAAGACATTTC-3′。miR-150ko小鼠擴(kuò)增產(chǎn)生長度為262 bp的DNA片段，對照C57BL/6J小鼠擴(kuò)增產(chǎn)生長度為866 bp的DNA片段。

1.2.2 繁殖性能的測定70～80日齡miR-150ko小鼠種鼠和對照小鼠采用1∶1同質(zhì)純合子互交，各6對，觀察小鼠窩產(chǎn)仔數(shù)和離乳率，用G&G 電子天平測定小鼠體重，繪制生長曲線。

1.2.3血液細(xì)胞學(xué)指標(biāo)的測定小鼠眼眶靜脈叢取全血20 μl加入3 ml血球稀釋液中應(yīng)用Nikon自動血球計數(shù)儀進(jìn)行白細(xì)胞總數(shù)(WBC)、紅細(xì)胞數(shù)(RBC)、血紅蛋白(HGB)、血細(xì)胞比容(HCT)、平均紅細(xì)胞體積(MCV)、平均血紅蛋白量(MCH)、平均血紅蛋白濃度(MCHC)、紅細(xì)胞體積(RDW)、血小板計數(shù)(PLT)、血小板比積(PCT)、平均血小板體積(MPV)、血小板平均分布寬度 (PDW)、淋巴細(xì)胞數(shù)(LYM)、中間細(xì)胞數(shù)(MID)、中性粒細(xì)胞數(shù)(GRN)、淋巴細(xì)胞百分比(LYM%)、中間細(xì)胞百分比(MID%)、中性粒細(xì)胞百分比(GRN%)的測定。

1.2.4血液生化指標(biāo)的測定小鼠眼眶靜脈叢取血，離心分離血清，應(yīng)用Mindray BS-180全自動生化分析儀測定血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(GPT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(GOT)、葡萄糖(GLU)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、總蛋白質(zhì)(TP)、白蛋白(ALB)、肌酐(CREA-J)、尿酸(UA)、尿素(UREA)、肌酸激酶(CK)、羥丁酸脫氫酶(α-HBDH)、肌酸激酶Mb型(CK-MB)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。測定試劑盒均購自Mindray公司。

2　結(jié)果

2.1miR-150ko小鼠基因鑒定miR-150ko鼠尾DNA 經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)生262 bp片段，對照C57BL/6J小鼠產(chǎn)生866 bp片段，miR-150ko小鼠基因鑒定正確(圖1)。

2.2miR-150ko小鼠繁殖情況miR-150ko小鼠窩產(chǎn)仔數(shù)和離乳率與C57BL/6J正常對照小鼠相比均顯著降低，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，見表1。

2.3miR-150ko小鼠哺乳期仔鼠體重增長情況圖2結(jié)果顯示，miR-150ko小鼠與C57BL/6J正常對照小鼠相比在哺乳期體重并無顯著性差異。

2.4miR-150ko小鼠離乳后體重增長情況圖3結(jié)果顯示，miR-150ko小鼠與C57BL/6J正常對照小鼠相比離乳后體重并無顯著性差異。

2.5 miR-150ko小鼠血液細(xì)胞學(xué)參數(shù)的變化miR-150ko 小鼠白細(xì)胞計數(shù) (P<0.05)、中間細(xì)胞數(shù)(P<0.05)、中性粒細(xì)胞數(shù)(P<0.05)、中間細(xì)胞百分比(P<0.01)、中性粒細(xì)胞百分比(P<0.01)與C57BL/6J對照小鼠相比顯著升高，而血小板計數(shù)(P<0.05)、血小板比積(P<0.05)、淋巴細(xì)胞百分比(P<0.01)與C57BL/6J小鼠相比則顯著降低(表2)。

圖1　PCR 鑒定miR-150ko小鼠基因型Fig.1　PCR genotyping of miR-150ko miceNote: 1.miR150ko;2.C57BL/6J control.

GroupsNumberoflittersWeaningrate(%)miR-150ko4.5±2.51)56.0±5.51)C57BL/6J6.8±1.492.3±4.2

Note：1)P<0.05，compared with control mice.

圖2　miR-150ko小鼠哺乳期仔鼠體重增長情況Fig.2　Weight growth curve of miR-150ko mice during lactation

圖3　miR-150ko小鼠離乳后體重增長情況Fig.3　Weight growth curve of miR-150ko mice after weaning

2.6miR-150ko小鼠血清生化參數(shù)的變化miR-150ko小鼠血清葡萄糖水平(P<0.01)和總膽固醇水平(P<0.05)與C57BL/6J對照小鼠相比顯著升高，而其他各項(xiàng)血清指標(biāo)未見顯著性差異(表3)。

3　討論

miR-150是一個長度為22個核苷酸的單鏈小分子RNA，定位于人類染色體19q13.33，在淋巴結(jié)和脾臟中顯著高表達(dá)，并參與免疫系統(tǒng)和造血系統(tǒng)發(fā)生、胚胎發(fā)育以及干細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)，其異常表達(dá)會導(dǎo)致免疫系統(tǒng)及造血系統(tǒng)疾病的發(fā)生[6]。若miR-150缺失，Zhou等[7]最早發(fā)現(xiàn)miR-150缺失導(dǎo)致B細(xì)胞異常擴(kuò)增，體液免疫應(yīng)答顯著增強(qiáng)，但對CD4和CD8傳統(tǒng)T細(xì)胞的發(fā)育和功能沒有影響，表明miR-150在不同淋巴細(xì)胞發(fā)育和功能中發(fā)揮不同的作用。本研究中我們應(yīng)用miR-150ko小鼠，通過觀測其窩產(chǎn)仔數(shù)和離乳率，探討miR-150缺失是否會對小鼠的繁殖性能產(chǎn)生影響，結(jié)果顯示miR-150ko小鼠第一胎、第三胎和第四胎的窩產(chǎn)仔數(shù)和離乳率與正常對照小鼠相比均顯著下降。目前關(guān)于miR-150敲除影響小鼠窩產(chǎn)仔數(shù)和離乳率的機(jī)制仍不清楚，以往研究表明，某些特異microRNAs如miR-132、miR-212、miR-224、miR-145在促性腺激素的作用下發(fā)生表達(dá)變化，進(jìn)而通過調(diào)控卵巢粒層細(xì)胞的增殖或凋亡影響繁殖[8-10]。最近研究發(fā)現(xiàn)，miR-150在小鼠卵巢發(fā)育和卵泡形成過程中發(fā)生表達(dá)變化，因此，miR-150是否也通過相似的機(jī)制影響小鼠的繁殖尚需在以后實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步探討[11]?？傊狙芯繑?shù)據(jù)證明miR-150缺失可能會影響到胚胎的發(fā)育。但是對哺乳期體重和離乳之后的體重增長情況觀察，miR-150ko小鼠的生長狀況與正常對照小鼠未見顯著性差異。

ParametersmiR-150koC57BL/6JWBC(109L-1)15.0±3.81)9.5±2.9RBC(1012L-1)8.9±0.39.7±0.6HGB(g/L)145.0±4.0150.0±3.5HCT(%)44.3±1.745.5±1.9MCV(fl)49.4±0.446.8±1.7MCH(pg)16.0±0.215.4±0.7MCHC(g/L)327.0±6.0333.0±3.0RDW(%)14.2±0.415.3±2.0PLT(109L-1)317.7±29.61)420.3±55.9PCT(%)0.11±0.011)0.15±0.01MPV(%)3.6±0.23.7±0.2PDW(%)13.8±0.413.3±1.5LYM(109L-1)8.9±2.47.5±2.3MID(109L-1)1.6±0.31)0.8±0.3GRN(109L-1)3.6±1.21)1.1±0.5LYM(%)63.4±1.51)79.6±4.0MID(%)11.4±1.01)8.2±0.3GRN(%)25.3±1.51)12.2±3.9

Note：1)P<0.05，compared with control mice.

IndexesmiR-150koC57BL/6JGPT(U/L)50.8±15.041.0±12.2GOT(U/L)92.5±5.488.6±16.2GLU(mmol/L)8.6±1.11)5.0±0.3TC(mmol/L)2.6±0.11)1.7±0.4TG(mmol/L)0.9±0.10.9±0.1TP(g/L)58.2±3.256.4±2.1ALB(g/L)34.4±1.631.7±1.5CREA-J(μmol/L)48.2±6.163.0±9.3UA(μmol/L)68.1±17.065.7±4.9UREA(mmol/L)7.2±1.09.5±1.2CK(U/L)168.6±21.8186.7±69.8α-HBDH(U/L)109.5±1.9183.7±26.7CK-MB(U/L)12.1±1.621.4±5.4HDL-C(mmol/L)2.2±0.31.6±0.3LDL-C(mmol/L)0.4±0.10.3±0.1

Note：1)P<0.05，compared with control mice.

已有一些關(guān)于miR-150在免疫系統(tǒng)中的作用并參與炎癥反應(yīng)的報道。如Trifari等[12]的研究表明，miR-150參與了對細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T lymphocytes,CTLs)生成的調(diào)節(jié)，其活性能被IL-2、炎癥反應(yīng)和抗原刺激等許多因素調(diào)節(jié)。又如在miR-150敲除小鼠的骨髓內(nèi)，NK細(xì)胞的發(fā)育和成熟嚴(yán)重受阻。相應(yīng)地，過表達(dá)miR-150則能促進(jìn)NK細(xì)胞的發(fā)育成熟[13]。本研究顯示miR-150ko小鼠的血常規(guī)中，miR-150ko小鼠白細(xì)胞計數(shù)、中間細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)、中間細(xì)胞百分比、中性粒細(xì)胞百分比與C57BL/6J小鼠相比顯著升高，表明miR-150缺失的小鼠呈現(xiàn)炎性反應(yīng)的狀態(tài)。

miRNAs在造血發(fā)育過程中的作用是目前miRNA研究的一個熱點(diǎn)。Barroga等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miR-150能影響巨核-紅系祖細(xì)胞(Megakaryocyte er-ythrocyte progenitors,MEPs)的最終分化命運(yùn)。同時Edelstein 等[15]研究發(fā)現(xiàn)miR-150促進(jìn)后期巨核細(xì)胞分化和血小板生成。在本研究中發(fā)現(xiàn)miR-150ko小鼠血小板計數(shù)較正常對照小鼠顯著降低，亦證明miR-150影響到血小板的生成。

從血清生化指標(biāo)來看，miR-150ko小鼠的血糖值要顯著高于正常對照小鼠，表明miR-150缺失可能會促進(jìn)糖尿病的發(fā)生。關(guān)于miR-150與糖尿病之間的相關(guān)性，也有研究報道。如崔云霞[16]的研究在糖尿病大鼠模型中發(fā)現(xiàn)miR-150低表達(dá)；鄭全輝等[17]發(fā)現(xiàn)miR-150缺失增強(qiáng)小鼠NKT細(xì)胞IFN-γ產(chǎn)生并促進(jìn)小鼠Ⅰ型糖尿病的發(fā)生。另外，我們還觀察到miR-150ko小鼠血清總膽固醇較正常對照小鼠顯著升高，這一發(fā)現(xiàn)提示miR-150或許與動脈粥樣硬化等心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生有一定的相關(guān)性，有待進(jìn)一步探討和證實(shí)。

綜上所述，miR-150缺失對小鼠的繁殖性能、血液細(xì)胞學(xué)中與炎癥有關(guān)的指標(biāo)及血小板產(chǎn)生影響，同時有加速糖尿病發(fā)生的可能性。

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[收稿2015-12-15修回2016-02-10]

(編輯張曉舟)

miR-150 deletion affects breeding and hematologic parameters of mice

ZHENG Quan-Hui,TIAN Feng,LI Wen-Ting,ZHANG Qiu-Ru,WANG Shan.

Hebei Key Laboratory for Chronic Diseases，Tangshan Key Laboratory for Preclinical and Basic Research on Chronic Diseases,School of Basic Medical Sciences,North China University of Science and Technology,Tangshan 063000，China

Objective:To investigate the effect of miR-150 gene deletion on the breeding and hematologic parameters of mice.Methods: The nest litter size,wean rate and weight changes of miR-150 knock out (miR-150ko) and C57BL/6J mice were compared.The hematology indexes were analyzed by automated blood cell counter,the serum biochemical parameters were analyzed by automatic biochemical analyzer.Results: The nest litter size and wean rate of miR-150ko mice were significantly decreased compared with that of C57BL/6J mice.The number of total white blood cells,intermediate cells,neutrophils,and the percentage of neutrophils and intermediate cells were significantly increased in miR-150ko mice compared with that of C57BL/6J mice.However,the number and percentage of platelets and lymphocytes decreased significantly in miR-150ko mice.In addition,the levels of serum glucose and TC were increased significantly in miR-150ko mice compared with that of C57BL/6J mice.Conclusion: miR-150 gene deletion impairs the breeding and has complex impact on hematologic parameters of mice.

miR-150;Gene deletion;Mice;Breeding;Hematology

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.10.001

①本文受國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81373111)和河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(H2013209019)資助。

鄭全輝(1973年-)，男，博士，副教授，主要從事免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)育和功能的分子調(diào)控機(jī)制研究，E-mail: zquanhui@ yahoo.com。

R34

A

1000-484X(2016)10-1409-04

②并列第一作者，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部，北京100191。