祝　驥　董浙清　許穎齡　盧德趙?

·檢測診斷·

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血濾泡輔助性T細(xì)胞的表達(dá)

祝驥董浙清許穎齡盧德趙?

目的 觀察新型CD4+T輔助細(xì)胞亞群-濾泡輔助性T細(xì)胞（Tfh）在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）患者中的表達(dá)，探究其在RA發(fā)病中的作用及機(jī)制。方法 采用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測RA患者和健康者外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）中Tfh細(xì)胞的比例，同時(shí)提取淋巴細(xì)胞RNA，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測Tfh的特異性轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6，用ELISA檢測效應(yīng)分子IL-21。結(jié)果 與對照組比較，RA患者Tfh細(xì)胞的比例明顯上調(diào)，其特異性轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6和效應(yīng)分子IL-21的表達(dá)水平均顯著上升。結(jié)論 Tfh細(xì)胞亞群的功能調(diào)節(jié)失?？赡苁荝A的重要發(fā)病機(jī)制之一。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 濾泡輔助性T細(xì)胞 流式細(xì)胞術(shù)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是臨床常見的一種以關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥為特征的全身性自身免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制至今尚不完全清楚［1-2］。研究表明免疫功能異常是重要的致病因素。濾泡輔助性T細(xì)胞（Tfh）是最近發(fā)現(xiàn)的一種能夠輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體反應(yīng)的CD4+T細(xì)胞亞群。Tfh定位于生發(fā)中心，表面特異性標(biāo)志為CD4+CXCR5+，其分化不僅由轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6調(diào)控，且需要人IL-21、誘導(dǎo)性協(xié)同刺激分子、抗體親和力等多種因素參與［3］。Tfh中的任何相關(guān)因子表達(dá)異常，將引發(fā)多種自身免疫性疾病。本實(shí)驗(yàn)擬通過對RA患者外周血Tfh細(xì)胞表型及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞因子的檢測，探討其與RA發(fā)病的關(guān)系。

1　臨床資料

1.1一般資料 選取2014年1月至2015年1月本院門診及病房的初次診斷未接受治療的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者20例，其中男6例，女14例；年齡40～55歲，均符合2009年RA診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除未明確診斷的患者、合并其他自身免疫性疾病、免疫缺陷病、急性感染和惡性腫瘤等患者。另選擇本院健康體檢者20例為對照組。兩組年齡分布、性別構(gòu)成比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2流式細(xì)胞儀檢測外周血Tfh細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例 采集受檢者晨起空腹外周血2ml，置于EDTA抗凝真空采血管中，搖勻后在＜6h測試進(jìn)行檢測。檢測方法：每管中加入100μl血液，并向試驗(yàn)管中加入熒光抗體CXCR5（CD185）-PerCp及CD4-FITC，而在對照管加入同型對照抗體，輕輕搖勻；室溫下避光孵育30min，每管加1ml紅細(xì)胞裂解液，混勻后避光孵育10min，等紅細(xì)胞裂解后，于1500r/min離心5min，棄上清液。用2mlPBS液洗滌2次，1500r/min離心5min，加400μl PBS液重懸，制成單細(xì)胞懸液細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀（BD公司FACSCanto Ⅱ）分析檢測，測定時(shí)各熒光通道均以相應(yīng)同種型IgG染色細(xì)胞作陰性對照。

1.3熒光定量PCR法檢測Bcl-6 mRNA的表達(dá) 收集兩組外周血，采用Ficoll密度-梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，用TRIZOL法提取標(biāo)本總RNA，紫外分光光度法檢測產(chǎn)物OD260/OD280，確定其濃度及純度，1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性。從Genebank查詢Bcl-6 mRNA的核苷酸序列，利用Primer5.0設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行熒光定量PCR分析。1.4 血清IL-21檢測 本實(shí)驗(yàn)采用雙抗體夾心ELISA法，操作方法按試劑盒說明書操作。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。以卡方測試檢驗(yàn)數(shù)據(jù)正態(tài)性。屬于正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，以（x±s）表示。以Levene's test檢測方差齊性，采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，比較兩樣本均數(shù)，根據(jù)方差齊性，采用t檢驗(yàn)或t'檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1正常人與RA患者外周血CD4+CXCR5+細(xì)胞百分率 RA組中CD4+CXCR5+細(xì)胞數(shù)量顯著增加（P＜0.01），表明濾泡輔助性T細(xì)胞與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎存在一定的相關(guān)性。見圖1。

圖1　外周血淋巴細(xì)胞中CD4+CXCR5+細(xì)胞百分率

2.2兩組外周血淋巴細(xì)胞Bcl-6 mRNA的表達(dá) 與正常組比較，RA患者外周血淋巴細(xì)胞中Bcl-6 mRNA顯著增加（P＜0.01）。見圖2。

圖2　外周血淋巴細(xì)胞中Bcl-6 mRNA的表達(dá)

2.3正常人與RA患者外周血IL-21的水平 RA患者外周血中細(xì)胞因子IL-21的水平為（328.2±51.11）pg/ml，顯著高于對照組（146.4±20.42）pg/ml（P＜0.01）。見圖3。

圖3　外周血淋巴細(xì)胞中IL-21的表達(dá)

3　討論

在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清中有較多異常表達(dá)的抗體如抗核周因子抗體（APF）、抗角蛋白抗體（AKA）、抗聚角蛋白微絲蛋白抗體（AFA）及抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（CCP）等［2］，但這些異?？贵w產(chǎn)生原因尚未明確。病理性自身抗體的產(chǎn)生多是B細(xì)胞正性應(yīng)答的結(jié)果，這一過程離不開T細(xì)胞的輔助。

濾泡B輔助性T細(xì)胞作為負(fù)責(zé)輔助B細(xì)胞的T細(xì)胞亞群［3］，在輔助B細(xì)胞的體液免疫應(yīng)答中起著關(guān)鍵性的作用。本資料結(jié)果表明，RA患者外周血淋巴細(xì)胞中Tfh細(xì)胞的比例明顯上調(diào)。Tfh細(xì)胞可持續(xù)表達(dá)CXCR5，在CXCRl3的趨化下遷移到B細(xì)胞濾泡并同時(shí)高表達(dá)ICOS、Bcl-6和PD-l，分泌IL-21，執(zhí)行輔助B細(xì)胞的功能。Bcl-6是調(diào)控Tfh細(xì)胞的主要轉(zhuǎn)錄因子，Th細(xì)胞群中缺乏Bcl-6，將不再產(chǎn)生Tfh細(xì)胞相關(guān)表面標(biāo)志。Tfh細(xì)胞能夠大量分泌細(xì)胞因子IL-21，其不僅在B細(xì)胞分化為成熟的漿細(xì)胞過程中起重要作用，且還對其自身的分化有重要的誘導(dǎo)作用。此外，Tfh細(xì)胞表面存在IL-21受體，可與游離的IL-21結(jié)合，為Tfh細(xì)胞自身分化提供信號［3］。抵制IL-21的表達(dá)可以導(dǎo)致Tfh細(xì)胞功能異常，從而使B細(xì)胞數(shù)量減少、巨細(xì)胞（GC）形成障礙。在IL-21基因敲除的小鼠中，還發(fā)現(xiàn)CD4+T細(xì)胞表面CXCR5表達(dá)下降，Tfh細(xì)胞數(shù)量減少［4-6］。

本資料結(jié)果顯示Bcl-6和IL-21的表達(dá)水平均顯著增加。表明Tfh細(xì)胞的比例增加，可促進(jìn)TI-21的產(chǎn)生，并可以刺激B細(xì)胞活化［7］，此外，TI-21還可能與其它炎性因子如TGF-β等的協(xié)同作用，最終導(dǎo)致機(jī)體分泌病理性自身抗體，從而誘發(fā)炎性反應(yīng)。因此，Tfh細(xì)胞亞群的功能調(diào)節(jié)失?？赡苁荝A的重要發(fā)病機(jī)制之一。

［1］ Humphreys JH，Verstappen SM. Etude et Suivi: Rheumatoid Arthritis in the 21st Century. J Rheumatol， 2013，40（10）:1637-1639.

［2］ Van WJ， Hazes JM，Visser H. Anticitr ullinated protein/peptide antibody and its role in the diagnosis and prognosis of early rheumatoid arthritis. Neth J Med，2002，60（10）: 383-388.

［3］ Vinuesa CG，F(xiàn)agarasan S，Dong C. New territory for T follicular helper cells. Immunity，2013，39（3）:417-20.

［4］ Vogehang A， McGuire HM， Yu D， et al. A fundamental role for interleukin-21 in the generation of T follicular helper cells. Immunity， 2008， 29（1）:127-137.

［5］ Mc Heyzer LJ， McHeyzer MG. Antigen-spicific of B cell development. Annu Rev Immunol， 2005， 23:487-513.

［6］ Nurieva RI， ClmngY， Marinez GJ， et al.Bcl-6 mediates the development of T follicular helper cells，2009，325（5943）:100l-1005.

［7］ Hu YL，Matz DP，Chang J，et al.B7RP-l Blockade Ameliorates Autoimmunity through Regulation of Follicular Helper T Cells.J immunol，2009，182（3）:1421-1428.

Objective To identify the possible roles of a new CD4+T helper cell subset，T follicular helper cells（TFH），in the pathogenesis of Rheumatoid Arthritis. Methods The percentages of TFH cells in peripheral blood mononuclear cells （PBMCs） from patients with RA and healthy controls were assessed by fl ow cytometry（FCM）and then compared.Meanwhile，the expression of TFH transcription factors and cytokines，including Bcl-6 and IL-21 in lymphocytes，was also examined by real-time PCR and ELISA. Results In the patients of RA，the percentage of TFH cells was signifi cantly increased. So did the expression of Bcl-6 and IL-21，the typical transcriptional factor and cytokine of TFH. Our data suggest deregulation of TFH subset in the pathogenesis of RA. The underlying mechanisms remain to be determined. Conclusion Dysfunction of TFH cell subsets may be one of the important pathogenesis of RA.

Rheumatoid Arthritis T follicular helper cells Flow cytometry

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃（2013ZA066）；浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院醫(yī)藥衛(wèi)生科研計(jì)劃（ZS13CA01）

310005 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院檢驗(yàn)科（祝驥董浙清）

310053 浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院（許穎齡 盧德趙）