趙佳佳　黃一飛?

·實(shí)驗(yàn)研究·

FK506 雷帕霉素滴眼液對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的大鼠葡萄膜炎的療效觀察

趙佳佳黃一飛?

目的 觀察FK506和雷帕霉素滴眼液對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的大鼠葡萄膜炎的治療作用。方法 12只實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為空白溶劑組、0.1%FK506組、0.2%雷帕霉素組，每組各4只，注射脂多糖24h開(kāi)始分別滴空白溶劑、0.1%FK506、0.2%雷帕霉素滴眼液，4次/d裂隙燈觀察攝像，并參照Hoekzema的方法記錄臨床評(píng)分，并進(jìn)行病理學(xué)觀察，比較用藥組與對(duì)照組的差異。結(jié)果 成功建立大鼠葡萄膜炎模型，0.1%FK506組、0.2%雷帕霉素組的眼部癥狀評(píng)分在注射后1～2d、7d與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；3～6d與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），病理學(xué)觀察示0.1%FK506組、0.2%雷帕霉素組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯小于對(duì)照組組。結(jié)論 0.1%FK506、0.2%雷帕霉素滴眼液均可有效抑制SD大鼠葡萄膜炎的發(fā)展。

FK506 雷帕霉素 滴眼液 葡萄膜炎

葡萄膜炎是眼部主要免疫性疾病之一，目前免疫抑制劑FK506、雷帕霉素治療葡萄膜炎多為口服劑型［1-3］。FK506眼部局部使用治療葡萄膜炎多在研究階段，Whitcup等研究證實(shí)FK506脂質(zhì)體滴眼液可以使內(nèi)毒素誘導(dǎo)的葡萄膜炎的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少［4］，Keiko等研究證明玻璃體腔注射FK506可以有效抑制實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄炎的發(fā)展［5］。雷帕霉素全身應(yīng)用可以明顯抑制葡萄膜炎的進(jìn)程［6］，與環(huán)孢霉素A或FK506聯(lián)用亦能抑制葡萄膜炎的進(jìn)展，同時(shí)可減少藥物使用劑量［7-9］，但局部應(yīng)用研究較少。2012年1月至6月作者通過(guò)建立內(nèi)毒素誘導(dǎo)的大鼠葡萄膜炎模型，明確FK506和雷帕霉素滴眼液對(duì)葡萄膜炎的治療作用。

1　材料和方法

1.1材料 SD雄性大鼠，體重200～250g，SPF級(jí)，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，傷寒桿菌內(nèi)毒素（美國(guó)sigma公司）；FK506由軍事醫(yī)學(xué)院制成滴眼液；雷帕霉素由軍事醫(yī)學(xué)院制成混懸滴眼液。裂隙燈顯微鏡（日本TOPCON公司），眼前節(jié)照相系統(tǒng)（日本TOPCON公司）。

1.2方法 （1）SD大鼠葡萄膜炎模型的建立：建立內(nèi)毒素誘導(dǎo)的大鼠葡萄膜炎模型，將傷寒桿菌內(nèi)毒素溶于生理鹽水制成濃度為2g/L的溶液，取100μl注射于SD大鼠雙后足底部［10］。于注射前及注射后第4h、12h、24 h、48h、7d進(jìn)行裂隙燈檢查，出現(xiàn)陽(yáng)性體征即表明模型成功建。（2）實(shí)驗(yàn)分組：將12只SD大鼠隨機(jī)分成3組，A組：空白溶劑組；B組：0.1%FK506組；C組：0.2%雷帕霉素組；注射后24h開(kāi)始點(diǎn)藥，6次/ d，持續(xù)注射7d。

1.3裂隙燈觀察 于注射后4h、12h、24h、2d、3d、4d、5d、6d、7d進(jìn)行裂隙燈檢查并攝像，參照Hoekzema［11］的方法對(duì)臨床表現(xiàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)與記分（見(jiàn)表1）。

表1　大鼠葡萄膜炎模型臨床評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.4病理學(xué)觀察 在注射脂多糖24h、4、7、11d后分別從每個(gè)組中取出一只大鼠處死后取整個(gè)眼球，在甲醛中固定24～36h，然后脫水，石蠟包埋，并進(jìn)行連續(xù)切片（厚5μm），最后進(jìn)行HE染色以進(jìn)行病理學(xué)觀察。1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用（x±s）表示，用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1癥狀體征觀察 SD大鼠注射傷寒桿菌內(nèi)毒素后，4h可觀察到虹膜充血明顯，隨后出現(xiàn)房水閃輝，瞳孔縮小，前房滲出等葡萄膜炎表現(xiàn)，本次實(shí)驗(yàn)中葡萄膜炎表現(xiàn)在24～48h達(dá)到最高峰，并于7d基本消退。

2.2病理學(xué)觀察 在注射脂多糖24h后處死大鼠并取整個(gè)眼球經(jīng)瞳孔的矢狀切面進(jìn)行病理切片，可見(jiàn)大鼠虹膜睫狀體明顯充血，有炎癥細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)，角膜后可見(jiàn)沉著物，脈絡(luò)膜、及視乳頭周圍血管可見(jiàn)充血（見(jiàn)圖1）。

圖1　內(nèi)毒素誘導(dǎo)的大鼠葡萄膜炎的病理學(xué)改變（注射脂多糖后24h）（×400）

2.3免疫抑制劑滴眼液抑制大鼠葡萄膜炎的觀察 注射脂多糖后每日通過(guò)裂隙燈下觀察各組大鼠眼部癥狀，根據(jù)癥狀進(jìn)行評(píng)分?？瞻兹軇┙M、FK506組、雷帕霉素組均在注射脂多糖1d后，虹膜明顯充血，并可見(jiàn)房水閃輝、前房滲出，瞳孔中度縮小；3～4d后空白溶劑組可見(jiàn)虹膜充血減輕，房水閃輝、前房滲出仍可見(jiàn)，瞳孔極度縮小，而FK506組、雷帕霉素組可見(jiàn)房水閃輝減輕、前房滲出減少，瞳孔縮小，未出現(xiàn)極度縮?。豢瞻兹軇┙M5～6d后可見(jiàn)虹膜充血減輕，房水閃輝減輕，瞳孔較前增大，而FK506組、雷帕霉素組則在4～5d虹膜充血減輕，房水閃輝減輕，瞳孔略??；空白溶劑組7～11d基本消退，前房滲出較多的仍可留有少量滲出，而FK506組、雷帕霉素組在5～7d基本消退。

2.4三組各時(shí)點(diǎn)大鼠葡萄膜炎臨床癥狀評(píng)分比較 見(jiàn)表2。

表2　三組各時(shí)間點(diǎn)眼部癥狀評(píng)分比較（x±s）

2.5免疫抑制劑滴眼液抑制大鼠葡萄膜炎的病理學(xué)觀察 各組在脂多糖注射24h，4、7、11d后取眼球進(jìn)行切片行病理學(xué)觀察，可見(jiàn)虹膜、睫狀體有中性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，房水中可見(jiàn)大量的蛋白滲出和中性粒細(xì)胞，脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜也可見(jiàn)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。雷帕霉素、FK506組的炎癥細(xì)胞的消退明顯快于空白溶劑組（見(jiàn)圖2）。

圖2　空白溶劑組、FK506組、雷帕霉素組的虹膜病理改變比較（×400）

3　討論

葡萄膜炎的發(fā)病機(jī)制及藥物療效的相關(guān)研究通常通過(guò)動(dòng)物模型進(jìn)行，目前有較多公認(rèn)的動(dòng)物模型，包括內(nèi)毒素誘導(dǎo)的葡萄膜炎（EIU）、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性前葡萄膜炎（EAAU）、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜視網(wǎng)膜炎（EAU）。EIU是由細(xì)菌內(nèi)毒素脂多糖誘發(fā)的嚴(yán)重的急性眼前節(jié)炎癥，可以代表急性前葡萄膜炎。本實(shí)驗(yàn)研究免疫抑制劑滴眼液的藥效學(xué)，其作為一種局部治療，效果依賴于局部免疫反應(yīng)機(jī)制，適合作為急性前葡萄膜炎的治療，因而本實(shí)驗(yàn)選用代表前葡萄膜的EIU作為滴眼液的藥效學(xué)研究膜型。

內(nèi)毒素或脂多糖是革蘭陰性菌的細(xì)胞壁成分，其可以在注射2h內(nèi)破壞血-房水屏障，導(dǎo)致白細(xì)胞（大多數(shù)細(xì)胞為中性粒細(xì)胞）浸潤(rùn)虹膜、睫狀小體和房水；結(jié)膜中有時(shí)也可見(jiàn)中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)。本實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)的EIU模型在脂多糖注射后24h，4、7、11d觀察到前葡萄膜包括虹膜、睫狀體均有中性粒細(xì)胞為主的白細(xì)胞浸潤(rùn)，房水中可見(jiàn)大量的蛋白滲出和炎癥細(xì)胞，角膜后可見(jiàn)沉著物，同時(shí)脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜中可見(jiàn)血管充血及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

雖然EIU中浸潤(rùn)的細(xì)胞主要是中性粒細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞也在其病理過(guò)程中起重要作用。Kogiso等在抗T淋巴細(xì)胞單克隆抗體處理后的鼠中再使用內(nèi)毒素誘導(dǎo)葡萄膜炎，可見(jiàn)房水中的蛋白和浸潤(rùn)的細(xì)胞均明顯減少，其中抗CD4抗體可以顯著抑制葡萄膜炎的進(jìn)程，而抗CD8抗體則無(wú)此作用，因而T淋巴細(xì)胞及其釋放的細(xì)胞因子在EIU的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用［12］。T淋巴細(xì)胞參與EIU的病理過(guò)程可能為炎癥反應(yīng)使葡萄膜的抗原暴露，激活T細(xì)胞，初始CD4+T淋巴細(xì)胞在細(xì)胞因子IL-2、IL-12等的作用下分化為Th1細(xì)胞，Th1細(xì)胞分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞免疫［13］。而FK506通過(guò)抑制NF-AT進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)而抑制細(xì)胞因子如IL-2、TNF-α和IL-2受體的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄［14］，從而可以阻斷葡萄膜炎的發(fā)生。而雷帕霉素/FKBP復(fù)合物通過(guò)抑制mTORC1而抑制IL-2與其受體結(jié)合后介導(dǎo)的T細(xì)胞的增殖和分化，初始T細(xì)胞不能分化為效應(yīng)T細(xì)胞，因而雷帕霉素單用或聯(lián)合FK506或CSA可以通過(guò)抑制T細(xì)胞的增殖和分化而抑制葡萄膜炎的進(jìn)程［15］。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)制劑的調(diào)整使難溶于水的FK506、雷帕霉素能進(jìn)入眼內(nèi)發(fā)揮治療作用。日本研究所用的是FK506滴眼液中加入了蓖麻油、乙醇［16］。國(guó)內(nèi)研制的FK506混懸滴眼液采用的是購(gòu)自日本的FK506，并加入乙醇、Tween-80、聚乙烯氫、蓖麻油、羧甲基纖維素納、聚乙二醇、檸檬酸鈉、硫柳汞，并配置合適的濃度［17］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)增溶劑制備可溶且穩(wěn)定的FK506滴眼液，該滴眼液pH值為7.0左右，滲透壓相當(dāng)于0.9%氯化鈉溶液，同時(shí)加入增黏劑羧甲基纖維素納，未加防腐劑與抗氧化劑，需4°保存，可以減少硫柳汞等防腐劑的眼表毒性［18］。通過(guò)制劑的改變，F(xiàn)K506和雷帕霉素滴眼液可進(jìn)入眼內(nèi)發(fā)揮有效的治療作用，為尋找高效、安全的治療葡萄膜炎方法奠定基礎(chǔ)。

［1］ Figueroa MS， Ciancas E， Orte L. Long-term follow-up of tacrolimus treatment in immune posterior uveitis. Eur. J. Ophthalmol， 2007，17（1）， 69-74.

［2］ VA Shanmuganathan， EM Casely， D Raj， et al. The efficacy of sirolimus in the treatment of patients with refractory uveitis. Br J Ophthalmol， 2005， 89（6）: 666-669.

［3］ Hoekzema R， Murray P I， van Haren MA， et al. Analysis of interleukin 6 in endotoxin-induced uveitis. Invest Ophthalmol Vis Sci， 1991， 32（1） : 88.

［4］ Tilton RG， Chang K， Corbett J A， et al. Endotoxin-induced uveitis in the rat is attenuated by inhibition of nitric oxide production. Invest Ophthalmol Vis Sci，1994，35（8）:3278-3288.

［5］ 馬翠萍， 金浩麗， 楊培增，等.傷寒桿菌內(nèi)毒素誘導(dǎo)的SD大鼠全葡萄膜炎. 中山醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)， 2001， 22（6）: 451-453.

［6］ Kogiso M， Tanouchi Y， Mimura Y， et al. Endotoxin-induced uveitis in mice1. Induction of uveitis and role of T lymphocytes. Jpn J Ophthalmol，1992，36（3）:281-290.

［7］ Hogan AC， McAvoy CE， Dick AD， Lee RW. McAvoy.Longterm Efficacy and Tolerance of Tacrolimus for the Treatment of Uveitis， 2007，114（5）:1000-1006.

［8］ Whitcup SM， Pleyer U， Lai J C， et al. Topical liposomeencapsulated FK506 for the treatment of endotoxin-induced uveitis. Ocul Immunol Inflamm，1998 ，6（1）:51-56.

［9］ Keiko Oh-i， Hiroshi Keino， Hiroshi Goto. Intravitreal injection of Tacrolimus （FK506） suppresses ongoing experimental autoimmune uveoretinitis in Rats. Br J Ophthalmol，2007，91（2）:237-242.

［10］ Roberge FG. Treatment of autoimmune uveoretinitis in the rat with rapamycin， an inhibitor of lymphocyte growth factor signal transduction. Curr Eye Res， 1993， 12（2）: 197-203.

［11］ Ikeda E， Hikita N， Eto K， et al. Tacrolimus-rapamycin combination therapy for experimental autoimmune uveoretinitis. Jpn J Ophthalmol， 1997， 41（6）: 396-402.

［12］ Martin DF， DeBarge LR， Nussenblatt RB， et al. Synergistic effect of rapamycin and cyclosporin A in the treatment of experimental autoimmune uveoretinitis. J Immunol， 1995， 154（2）: 922-927.

［13］ Yalcindag F N， Batioglu F， Ari N， et al. Aqueous humor and serum penetration of tacrolimus after topical and oral administration in rats: an absorption study. Clinical Ophthalmology， 2007， 1（1）:61-64.

［14］ Jin Yuan， Jia-jie Zhai， Jia-qi Chen. Preparation of 0.05% FK506 Suspension Eyedrops and Its Pharmacokinetics After Topical Ocular Administration. J Ocul Pharmacol Ther，2009，25（4）: 345-350.

［15］ Mochizuki M. Immunotherapy in ocular diseases.J Nippon Ganka Gakkai Zasshi，1992，96（12）:1608-1634.

［16］ Morris R. Modes of action of Fk506， cyclosporine A. And rapamycin. Transplant Proc，1994，26（6）:3272-3275.

［17］ Sakaguchi M. Cytokine production by T cells infiltrating in the eye of uveitis patients. Jpn J ophthalmol，1998，42（4）:262-268.

［18］ Khanna AK. Mechanism of the combination immunosuppressive effects of rapamycin with either cyclosporine or tacrolimus. Transplantation. 2000，70（4）:690-694.

Objective To study the effects of FK506 and Rapamycin eye drops in the treatment of endotoxin-induce uveitis in rats. Methods Twelve Sprague-Dawley（SD） rats were divided into three groups， which were 0.1% FK506 group（n=4）， 0.2% rapamycin group（n=4） and the control group（n=4）. After the injection of LPS for 24 hours， the above groups were given eye drops of 0.1%FK506， 0.2% rapamycin. The rats were observed by slit lamp microscope for 4 times per day and the symptom scores were recorded according to the methods provided by Hoekzema. Then the eyes were sampled for pathological observation.T test was used to analyze the data. Results The model of EIU in rats was successfully established. There were significant differences in the symptoms of EIU between 0.1%FK506 group and the control group， between 0.2% rapamycin group and the control group after the medication for 3-6 days（P＜0.05）. However， there were no signifi cant differences after the medication for 1-2 days（P＞0.05）. Pathological observation on the three grops showed that infl ammatory cell infi ltration in the 0.1% FK506 group and 0.2% rapamycin group alleviated. Conclusions Both 0.1% FK506 and 0.2% rapamycin eye drops can suppress the development of EIU in SD rats effectively.

FK506 Rapamycin Eye drops Uveitis

317500 浙江省溫嶺市第一人民醫(yī)院內(nèi)分泌科（趙佳佳）

100853 解放軍總醫(yī)院眼科（黃一飛）