沙紅蘭　何陳云　李　詠　劉　蓉　何愛(ài)琴?

ICAM-3蛋白表達(dá)在預(yù)測(cè)宮頸癌放射抵抗性中的價(jià)值

沙紅蘭何陳云李詠劉蓉何愛(ài)琴?

目的 探討細(xì)胞間粘附分子-3（ICAM-3）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的蛋白表達(dá)水平與宮頸鱗癌放射抵抗性的相關(guān)性。方法 采用免疫組織化學(xué)S-P法檢測(cè)90例中晚期宮頸鱗癌患者癌組織中ICAM-3和VEGF的蛋白表達(dá)，所有患者均采用同步放化療。其中25例為放療后未控，65例為放療后緩解。結(jié)果 ICAM-3在90例宮頸鱗癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)54例（60.0%）；VEGF呈陽(yáng)性表達(dá)56例（62.2%）。ICAM-3在宮頸鱗癌放療后未控組中的陽(yáng)性表達(dá)率84.0%，放療后緩解組中的陽(yáng)性表達(dá)率50.8%，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.008）；VEGF在宮頸鱗癌放療后未控組中的陽(yáng)性表達(dá)率80.0%，放療后緩解組中的陽(yáng)性表達(dá)率55.4%，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.031）。ICAM-3和VEGF高表達(dá)均與腫瘤病理分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，而與臨床分期無(wú)明顯相關(guān)性。結(jié)論 ICAM-3、VEGF蛋白高表達(dá)與宮頸鱗癌放射抵抗性相關(guān)，可作為預(yù)測(cè)宮頸癌放療敏感性的指標(biāo)。

細(xì)胞間粘附分子-3 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 宮頸鱗癌 放射治療 免疫組化

細(xì)胞間粘附因子-3（ICAM-3）即CD50，屬于免疫球蛋白超家族，研究證明，ICAM-3與血液系統(tǒng)、淋巴系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，并參與腫瘤細(xì)胞的免疫逃脫作用［1］。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)［2］在宮頸鱗癌中的表達(dá)水平明顯高于宮頸上皮內(nèi)瘤變（CINⅡ～Ⅲ）及正常宮頸。Young等基礎(chǔ)研究證明［3］，ICAM-3在放射抵抗的宮頸癌細(xì)胞株SiHa/R中表達(dá)水平上調(diào)，認(rèn)為ICAM-3的高表達(dá)與宮頸癌細(xì)胞株放射抵抗性有關(guān)。本文探討ICAM-3和VEGF在預(yù)測(cè)宮頸癌放射抵抗中的價(jià)值，分析ICAM-3、VEGF高表達(dá)與病期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。

1　臨床資料

1.1一般資料 2010年1月至2011年12月南通大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科行根治性放療后未控的存檔宮頸鱗癌組織標(biāo)本25例，另選同期放療后完全緩解的宮頸鱗癌組織標(biāo)本65例為對(duì)照組。所有患者取材前均未進(jìn)行放療或化療，且臨床資料完整?；颊吣挲g43～71歲，平均年齡52.5歲。按2009年FIGO分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分期，Ⅱb期42例、Ⅲ期48例。影像學(xué)提示淋巴結(jié)陽(yáng)性35例、陰性55例。組織病理分級(jí)：Ⅰ～Ⅱ級(jí)52例、Ⅲ級(jí)38例。所有患者均給予同步放化療。外照射采用高能X線行前后對(duì)穿野治療：TD 4500～5000cGy.其中全盆野劑量TD 3000cGy，四野（中間擋鉛）劑量TD 1500～2000cGy，高劑量率腔內(nèi)后裝治療4～5次，A點(diǎn)劑量700cGy/次。同步化療采用順鉑治療：30mg/（m2·周），4～6周。

1.2療效判斷標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)WHO實(shí)體瘤客觀療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合宮頸癌放療后病灶的變化情況，放療結(jié)束后3個(gè)月內(nèi)原發(fā)腫瘤或部分腫瘤持續(xù)存在或盆腔內(nèi)出現(xiàn)新的病灶為放療后未控；完成放療后1個(gè)月復(fù)查病灶完全消退，盆腔內(nèi)未出現(xiàn)新的病灶為放療后緩解。

1.3ICAM-3H和VEGF檢測(cè)方法 將90例宮頸癌組織標(biāo)本石蠟塊連續(xù)切片，每張厚度3～4μm。1張進(jìn)行HE染色病理確認(rèn)，免疫組化標(biāo)記用玻片均經(jīng)防脫片處理。分別由兩位病理科主任醫(yī)師進(jìn)行免疫組化讀片，判定結(jié)果。兔抗人ICAM-3單克隆抗體購(gòu)自R&D公司，兔抗人VEGF單克隆抗體、S-P免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)公司。采用S-P法（鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)法）檢測(cè)。免疫標(biāo)記陽(yáng)性對(duì)照組為人體脾組織，陰性對(duì)照組用PBS（磷酸鹽緩沖液）替代第一抗體進(jìn)行免疫標(biāo)記操作。免疫組化程序嚴(yán)格按S-P試劑說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4檢測(cè)結(jié)果分析方法 ICAM-3定位于細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒，用半定量法分析結(jié)果，判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：按染色細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的比例分為5個(gè)等級(jí)：＜10%：0級(jí)；10%～25%：1級(jí)；25%～50%：2級(jí)；50%～75%：3級(jí)；＞75%：4級(jí)。根據(jù)細(xì)胞染色的強(qiáng)度分為4個(gè)等級(jí)：陰性：0級(jí)；淡黃色：1級(jí)；棕黃色：2級(jí)；棕褐色：3級(jí)。將染色細(xì)胞數(shù)評(píng)分與細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分相乘得出免疫染色評(píng)分，染色評(píng)分0分為陰性（-），1～4分為弱陽(yáng)性（+），5～8分為陽(yáng)性（++），9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。VEGF免疫組化染色以細(xì)胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為其陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)。判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜1%為（-），陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)1%～10%為（+），陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)11%～50%為（++），陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞51%為（+++）。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件。各組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析用Spearman等級(jí)相關(guān)分析法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1ICAM-3在放療未控組和緩解組中的表達(dá)情況 ICAM-3陽(yáng)性表達(dá)主要位于癌細(xì)胞的細(xì)胞膜，陽(yáng)性和陰性表達(dá)見(jiàn)圖1、2。90例宮頸鱗癌組織中的ICAM-3陽(yáng)性表達(dá)54例。ICAM-3在放療后未控組中有21例呈陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率84.0%。在放療后緩解組中有33例呈陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率50.8%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.98，P=0.008）。見(jiàn)表1。

圖1　宮頸鱗癌 ICAM-3（+）（×200）

圖2　宮頸鱗癌ICAM-3（+++）（×200）

表1　ICAM-3在宮頸鱗癌放療后未控組和緩解組中的表達(dá)（n）

2.2VEGF的表達(dá)結(jié)果 VEGF在宮頸癌組織中的表達(dá)主要位于腫瘤組織的細(xì)胞漿，呈彌漫性或散在分布的棕褐色顆粒，其陽(yáng)性和陰性表達(dá)見(jiàn)圖3、4。90例宮頸癌中，VEGF呈高表達(dá)56例。VEGF在放療后未控組25例中有20例呈陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率80.0%。在放療后緩解組中有36例呈陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率55.4%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.65，P=0.031）。見(jiàn)表2。

圖3　宮頸癌VEGF表達(dá)（-）（×400）

圖4　宮頸癌VEGF表達(dá)（++）（×400）

表2　VEGF在宮頸鱗癌放療后未控組和緩解組中的表達(dá)（n）

2.3CIAM-3、VEGF表達(dá)與臨床特征的相關(guān)性 見(jiàn)表3。

表3　ICAM-3、VEGF在不同病期、分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的表達(dá)［n（%）］

3　討論

宮頸癌是常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤，臨床上＞70%宮頸癌患者需接受放射治療。關(guān)于宮頸癌放射治療敏感性的影響因素已逐漸受到關(guān)注。國(guó)內(nèi)外較多學(xué)者研究腫瘤放療敏感相關(guān)因子，但迄今為止，在預(yù)測(cè)宮頸癌放射敏感性方面的研究尚不充分。

細(xì)胞間粘附分子（ICAMs）指一類調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間相互結(jié)合和起粘附作用的膜表面糖蛋白，目前發(fā)現(xiàn)有3種：ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)［2］，ICAM-3在CINⅢ和宮頸癌組織中高表達(dá)，而在正常宮頸組織中低表達(dá)，提示其表達(dá)水平與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。本課題組前期采用PCR技術(shù)已證明ICAM-1的高表達(dá)與宮頸癌的放射抵抗相關(guān)［4］。有研究發(fā)現(xiàn)ICAM-3可與LFA-1結(jié)合通過(guò)分子結(jié)構(gòu)而調(diào)節(jié)ICAM-1（CD54）/LFA-1的相互作用［5］。因此推測(cè)ICAM-3高表達(dá)與宮頸癌的放射抵抗相關(guān)。本資料顯示ICAM-3在放療后未控組中的表達(dá)高于緩解組，提示ICAM-3高表達(dá)與宮頸癌的放射抵抗有關(guān)?？赡艿臋C(jī)制是ICAM-3可能參與或調(diào)節(jié)VEGF的FAK信號(hào)途徑，F(xiàn)AK已被證實(shí)會(huì)誘導(dǎo)抑制輻射后的細(xì)胞凋亡［6-7］，從而引起宮頸癌放射抵抗性增加。因此臨床上在治療前通過(guò)檢測(cè)ICAM-3表達(dá)水平，預(yù)測(cè)宮頸癌的放療敏感性，進(jìn)一步判斷預(yù)后和指導(dǎo)治療方案的制定。

Bachtiary B［8］等研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌患者放療前VEGF水平高者，放療后的近期腫瘤緩解率和遠(yuǎn)期療效均相對(duì)較差。本資料結(jié)果顯示，VEGF在放療后未控組中的表達(dá)高于緩解組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與前述研究結(jié)果一致。VEGF引起腫瘤細(xì)胞放射抵抗的機(jī)制可能是：（1）放射治療通過(guò)激活EGFR而激活P13K/Akt通路，刺激VEGF受體高表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤新生血管的形成，促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移［9］。（2）缺氧可上調(diào)VEGF基因的表達(dá)，引起腫瘤自身侵襲性增加和對(duì)放化療的抗拒性增加［10］。

本資料結(jié)果提示ICAM-1和VEGF高表達(dá)與宮頸癌的病理分級(jí)和淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)。研究表明［11］，ICAM-3表達(dá)于血管及淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，通過(guò)與細(xì)胞漿內(nèi)酪氨酸磷酸化的小分子β-catenin結(jié)合，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和血管新生，另外ICAM-1、ICAM-3等細(xì)胞粘附因子可能作為信號(hào)傳導(dǎo)分子調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞間以及內(nèi)皮細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的粘附和去粘附，促進(jìn)血管和淋巴管的增生，在腫瘤的浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF），是目前公認(rèn)一種重要的促血管生成因子，研究發(fā)現(xiàn)［12］，VEGF通過(guò)選擇性與內(nèi)皮細(xì)胞上的受體結(jié)合，使細(xì)胞內(nèi)的Ca2+水平迅速升高，通過(guò)磷酸肌醇特異性磷酸脂酶C途徑，使細(xì)胞內(nèi)肌醇三磷酸水平升高，轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，從而使血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖、促進(jìn)血管生長(zhǎng)和提高血管通透性，利于惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。而和臨床分期無(wú)關(guān)。由于本資料選擇的是適合放療的Ⅱb～Ⅲ期宮頸鱗癌患者，結(jié)果可能未能反映所有臨床分期，還需進(jìn)一步進(jìn)行全面分期的研究。

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Objective To study the relationship between Intercellular Adhesion Molecule-3、Vascular endothelial growth factor With radioresistance of human cervical squamous cancer. Methods S-P immunohistochemical method was performed to detect the expression of ICAM-3 and VEGF in 90 patients with advanced cervical squamous cell carcinoma，of which 25 cases were non-well treated after radiotherapy，65 cases were well treated after radiotherapy. Result The positive expression level of ICAM-3 and VEGF were related to clinical stage and lymph nodes metastasis；The expression level of ICAM-3 in non-well treated group was higher than that in well treated group（84.0% vs 50.8%，P=0.008）. The expression level of VEGF in non-well treated group was higher than that in well treated group（80.0% vs 55.4%，P=0.031）. The expression of ICAM-3 and VEGF were signifi cantly related to lymph node metastasis and grade of differentiation，but no relation to clinicai stage. Conclusion The expressions of ICAM-3 and VEGF are related to radioresistance of cervical squamous cell carcinoma.

ICAM-3 VEGF cervical squamous cell carcinoma radiotherapy immunohistochemistry

江蘇省南通市衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（20112KX11008）

226500 江蘇省如皋市人民醫(yī)院（沙紅蘭）

226361 南通大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院（何陳云 李詠 劉蓉何愛(ài)琴）