張迪，劉子榮，陳峰，崔子林，張雅敏（.天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院，天津300070；.天津市第一中心醫(yī)院肝膽外科，天津 3009）

我國肝癌患者多合并肝硬化或肝纖維化等基礎(chǔ)肝病，合并有基礎(chǔ)病變的肝臟如進(jìn)行大范圍切除會引起殘肝再生不足，導(dǎo)致患者出現(xiàn)急性肝衰竭［1］。因此，比較正常肝臟和合并有基礎(chǔ)肝病的肝臟在行大范圍肝切除后的肝再生情況，研究纖維化病變在肝大部分切除后對肝臟損傷和肝再生的影響對于臨床治療具有重要意義。與大鼠不同，小鼠具有膽囊結(jié)構(gòu)［2］，更接近于人的生理解剖，與人類具有較高的同源性，因此，小鼠模型更適合該研究。本研究主要對比肝纖維化病變小鼠和正常小鼠在大范圍肝切除后殘肝損傷和肝再生的差異，研究肝纖維化對肝切除后肝損傷和肝再生的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組：選取120只健康成年雄性C57/BL6小鼠，體重為20～25 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組和實(shí)驗(yàn)組，每組60只小鼠。實(shí)驗(yàn)組誘導(dǎo)肝纖維化，成模后兩組隨機(jī)分為3小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)6個(gè)時(shí)間點(diǎn)組，每組10只小鼠。

1.2 動物模型制備

1.2.1 小鼠肝纖維化模型：采用背部皮下注射40 %CCl4玉米油溶液構(gòu)建小鼠肝纖維化模型［3-5］，每2天注射1次，前2周劑量為0.003 ml/g，后4周劑量為0.002 ml/g，維持6周可成模。造模期間注意小鼠飲食及生活環(huán)境清潔，以免引起感染。

1.2.2 肝纖維化小鼠肝再生模型：術(shù)前小鼠自由飲食。采用動物麻醉機(jī)對小鼠進(jìn)行吸入麻醉，腹部備皮消毒，延腹中線切開皮膚肌肉進(jìn)入腹腔。自制拉鉤暴露手術(shù)視野，游離肝臟，動作輕柔。結(jié)扎支配肝左葉和中葉的肝動脈及門靜脈分支，待兩個(gè)肝葉變色后結(jié)扎摘除膽囊和兩葉［6-7］。清洗腹腔后，分兩層關(guān)腹，撤除麻醉機(jī)，等待小鼠蘇醒。

1.3 標(biāo)本采集：分別于術(shù)后3小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)處死兩組小鼠，采取血液和肝臟組織標(biāo)本，離心后收集血清于-80℃保存， 用于檢測血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平；取肝臟組織標(biāo)本，固定于10%甲醛水溶液，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片后，檢測肝臟病理和增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）表達(dá)。

1.4 觀察指標(biāo)：① 苦味酸天狼猩紅染色觀察肝纖維化的造模情況；② 全自動生化分析儀檢測小鼠血清ALT、AST水平，了解小鼠肝功能變化；③ 肝臟組織病理切片蘇木精-伊紅（HE）染色觀察小鼠肝損傷程度； ④ 分別在6個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死小鼠，秤量小鼠體重和殘肝重量，計(jì)算肝體重比，以觀察兩組小鼠的肝再生狀況；⑤ 免疫組化檢測殘肝組織切片PCNA陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)目，觀察術(shù)后兩組肝細(xì)胞的增殖狀態(tài)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肝纖維化模型的鑒定情況（圖1）：肝組織切片苦味酸天狼猩紅染色可見實(shí)驗(yàn)組正常肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，匯管區(qū)及中央靜脈周圍纖維組織增生形成假小葉，肝細(xì)胞索排列紊亂，中央靜脈周圍可見大量炎性浸潤，肝細(xì)胞出現(xiàn)脂肪變性及壞死，而對照組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，未見纖維增生，肝索呈放射狀排列，細(xì)胞形態(tài)正常。肝纖維化模型構(gòu)建成功，可用于下一步實(shí)驗(yàn)的研究。

圖1 兩組肝組織切片天狼猩紅染色a、b為HE×100；c、d為HE×400

2.2 肝臟組織學(xué)變化（圖2）：肝組織HE染色結(jié)果顯示，兩組在術(shù)后24小時(shí)肝損傷最嚴(yán)重，實(shí)驗(yàn)組肝細(xì)胞輪廓不清，排列雜亂，伴大量脂肪變性和壞死，對照組僅見大量氣球樣變。48小時(shí)見兩組肝再生旺盛，對照組肝損傷修復(fù)較好，實(shí)驗(yàn)組肝損傷仍然較為嚴(yán)重。

圖2 肝組織切片（HE×400）

2.3 肝切除術(shù)后肝功能變化（圖3）：對兩組小鼠行肝左葉、中葉切除術(shù)，術(shù)后兩組小鼠血清中ALT和AST水平均出現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢，并 且均在12小時(shí)達(dá)到峰值。實(shí)驗(yàn)組下降較對照組緩慢，各時(shí)間點(diǎn)ALT、AST水平明顯高于對照組，在3小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)兩組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)ALT、AST表達(dá)水平與對照組相比，aP＜0.05

2.4 肝體重比結(jié)果（圖4）：肝切除術(shù)后，兩組均出現(xiàn)肝再生趨勢，在24～48小時(shí)肝再生迅速。與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組肝再生緩慢或延遲，在24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)，與對照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 肝切除術(shù)后不同時(shí)間肝臟/體重比值與對照組相比，aP＜0.05

2.5 PCNA陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)（圖5和圖6）：免疫組化結(jié)果顯示，兩組肝臟組織PCNA陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)于肝切除后開始升高，在48小時(shí)達(dá)到峰值后下降。在24小時(shí)前實(shí)驗(yàn)組PCNA陽性細(xì)胞數(shù)高于對照組，24小時(shí)開始對照組PCNA陽性細(xì)胞數(shù)增加，并且高于實(shí)驗(yàn)組。各時(shí)間點(diǎn)兩組比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖5 肝臟切片免疫組化（PCNA×200）

圖6 PCNA陽性細(xì)胞數(shù)趨勢圖與對照組相比，aP＜0.05

3 討 論

肝纖維化模型制作方法有很多，如化學(xué)藥物損傷，免疫誘導(dǎo)，膽道結(jié)扎等［8-9］，其中以CCl4法最常用，且與臨床肝纖維化疾病具有相似性。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行大范圍肝切除能夠模擬臨床有肝纖維化基礎(chǔ)肝病行肝切除術(shù)后的狀態(tài)，對于評價(jià)和篩選抗纖維化藥物及促進(jìn)肝再生治療措施具有重要意義。

本研究表明，肝纖維化狀態(tài)可影響肝切除后的肝損傷、再生程度，主要表現(xiàn)為加重肝損傷，延緩肝再生進(jìn)程。ALT、AST是反映肝臟功能的常用指標(biāo)，兩組小鼠在肝切除后ALT和AST水平都表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，說明肝切除本身可以造成肝細(xì)胞的損傷，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組在各時(shí)間點(diǎn)ALT、AST均明顯升高，表明肝臟的纖維化狀態(tài)可引起肝切除后肝臟損傷增加。對兩組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)肝臟的HE染色結(jié)果進(jìn)行比較，同樣發(fā)現(xiàn)纖維化組損傷嚴(yán)重；肝重體重比值可以消除個(gè)體體重差異的影響，PCNA能夠很好的反映肝再生率的趨勢，也是反映細(xì)胞增殖階段的重要指標(biāo)。兩組在術(shù)后6小時(shí)即開始升高，24～48小時(shí)再生迅速，并在48小時(shí)達(dá)到峰值。但是與對照組相比，纖維化組肝臟再生緩慢，這說明肝臟纖維化狀態(tài)在肝再生過程中起了抑制作用。

肝再生是在肝臟受到損傷后，由多種細(xì)胞因子和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路協(xié)同作用的過程［10］，表現(xiàn)為肝細(xì)胞代償性增生，以滿足機(jī)體正常的代謝需求。然而具有肝纖維化基礎(chǔ)病變的肝臟與正常肝臟的肝再生機(jī)制并不完全相同［11-13］，其具體機(jī)制目前尚不清楚。本研究通過成功構(gòu)建肝纖維化小鼠大范圍肝切除模型，觀察肝纖維化對肝切除后肝臟損傷和再生的影響，發(fā)現(xiàn)在行大范圍肝切除后肝纖維化病變可使小鼠肝臟損傷加重，肝再生延遲。