葉思誠 姚小華 王開良 林 萍 龔洪恩 卓仁英

(中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)研究所，富陽 311400)

油茶檸檬酸合成酶(CS)基因的克隆和表達分析

葉思誠 姚小華*王開良 林 萍 龔洪恩 卓仁英

(中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)研究所，富陽 311400)

采用RT-PCR技術從油茶中分離出一個檸檬酸合成酶基因，該基因的cDNA全長1 416 bp，編碼471個氨基酸，推導的蛋白分子量為52.74 kD,理論等電點(PI)為6.95。同源比對顯示其與其他植物的CS蛋白序列高度同源，將該基因命名為CoCS(Gen Bank登錄號:KU161147)。系統(tǒng)進化樹分析表明油茶CoCS與杜鵑和葡萄的CS蛋白的親緣關系較近。熒光定量PCR分析結果表明,油茶受到低磷脅迫后根系CoCS基因的表達受到低磷誘導，表達量呈現先升高后降低的趨勢；不同油茶品種不同組織(根、莖、葉)中的CoCS基因在不用磷處理下的表達模式不同。

油茶；檸檬酸合成酶；低磷；基因克?。槐磉_分析

植物體內的檸檬酸合成是由檸檬酸合成酶(citrate synthase,CS,EC4.1.3.7)催化草酰乙酸和乙酰輔酶A合成的。檸檬酸合成酶是三羧酸循環(huán)和乙醛酸循環(huán)的關鍵酶，所參與的三羧酸循環(huán)和乙醛酸循環(huán)能夠將體內三大物質氨基酸、糖和脂類的代謝聯系起來。檸檬酸合成酶根據其在真核細胞中的定位不同，可分為線粒體CS(mCS)、乙醛酸循環(huán)體CS(gCS)、過氧化物酶體CS(pCS)[17]。檸檬酸合成酶與多種生理過程相關，如線粒體能量代謝、種子萌發(fā)、耐低磷和抗鋁毒等[18～21]。De la Fuente等[22]將綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)的檸檬酸合成酶基因(CS)導入煙草(Nicotianatabacum)和木瓜(Chaenomelessinensis)中超表達，結果發(fā)現轉基因植株根系檸檬酸合成能力比對照提高10倍以上，根系分泌的檸檬酸比對照高出4倍以上。Koyama等[23]研究發(fā)現，過表達CS基因的胡蘿卜(Daucuscarota)細胞對磷的吸收顯著提高。Koyama等[20]在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中過表達CS基因，結果發(fā)現轉基因植株根部分泌的檸檬酸比對照高出3倍，對磷的吸收能力也得到很大提高。López-bucio[24]等研究表明表達CS基因的煙草植株對磷的吸收能力大大增強。王祎[25]等研究表明，油菜過表達CS基因顯著提高植株從土壤中獲取磷的能力，轉基因植株苗期地上部和籽粒中的磷累積量顯著高于WT植株。

油茶(CamelliaoleiferaAbel.)是我國特有的木本食用油料樹種[26]。油茶林地土壤大多屬酸性紅壤，土壤中有效磷含量很低，磷缺乏是油茶增產的主要限制因子[27]。低磷脅迫下，油茶根系和組織中分泌的有機酸(含檸檬酸)含量增多[28～29]。研究油茶根系分泌物對土壤和難溶磷化合物(AlPO4，Ca3(PO4)2FePO4·2H2O)中磷的活化作用，結果表明，油茶根系分泌物能夠明顯促進土壤磷的釋放，不同難溶磷化合物在根系分泌物中的溶解性不同，溶解性AlPO4>Ca3(PO4)2>FePO4·2H2O；利用有機酸化學試劑驗證其對土壤中P的能力，結果表明檸檬酸的活化能力最強[30]。目前，已知油茶在低磷脅迫下根系合成和分泌的檸檬酸含量升高，但是對催化合成檸檬酸的檸檬酸合成酶基因作用機制尚不清楚。因此，本研究以普通油茶磷高效基因‘長林166號’和磷低效基因型‘長林4號’兩個無性系為試驗材料，通過分離油茶檸檬酸合成酶基因CS全長cDNA和DNA序列并對其進行生物信息學分析，同時分析不同磷水平下不同無性系不同器官組織中CoCS基因在表達模式及檸檬酸合成酶活性的差異，為進一步探索油茶適應低磷和磷高效利用的分子機制以及磷高效油茶新品種的選育奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

試驗材料為普通油茶(CamelliaoleiferaAbel.)‘長林4號’和‘長林166號’無性系一年生扦插苗,取自浙江省江山市林業(yè)局種苗站采穗圃。選擇苗高均在10 cm左右和長勢基本一致的無性系植株用于后續(xù)實驗。

1.1.2 試劑

大腸桿菌(E.coli)DH5α和Topo10感受態(tài)細胞購自CWBIO公司(北京，中國)。PMD-18T克隆載體、熒光定量試劑盒SYBR PrimeScriptTMRT-PCR Kit購自TaKaRa公司(大連，中國)。植物RNA快速提取試劑盒(RN38 EASY spin Plus)購自Aidlab公司(北京，中國)。反轉錄試劑盒(SuperScripTMIII First-STRAND Synthesis System for RT-PCR)購自invitrogen公司(Carlbad，USA)。質粒DNA小量提取試劑盒(AP-MN-P-50)、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(AP-GX-50)自Axygen公司(杭州，中國)。超保真DNA聚合酶(PhantaTMEVO HS)、DL15000 DNA Marker購自Vazyme公司(南京，中國)，核酸染料DNA GREEN購自TIANDZ(北京，中國)。引物合成和測序由上海生工和擎科生物公司完成。

1.2 方法1.2.1 試驗苗木處理

沙培試驗：選擇‘長林4號’和‘長林166號’無性系一年生扦插苗作為沙培試驗的材料。將油茶無性系扦插苗根系用清水沖洗干凈，進行適當修剪后用0.15%的福爾馬林溶液對其表面滅菌，用蒸餾水清洗后，移植到20 cm×30 cm塑料盆中，在塑料盆底墊塊紗布，然后裝1 kg 1～2 mm的石英砂(10%稀HCl浸泡一天后洗凈)在盆底，上面裝2 kg 0.5～1 mm的石英砂，每盆種植3株幼苗，放在溫棚中進行培養(yǎng)。對油茶苗進行2個磷水平處理，分為缺磷LP(5 μmol·L-1KH2PO4)、常磷HP(1 mmol·L-1KH2PO4)2個處理水平，每處理6盆，每盆3株，采用完全隨機區(qū)組設計。營養(yǎng)液配方參照林鄭和[31]的方法并稍作修改。營養(yǎng)液中缺少的K+用等量的KCl替代。用1 mol·L-1HCl和1 mol·L-1NaOH把全營養(yǎng)液pH值調整到5.2左右。苗木于2014年4月種下，種下第1個月使用常磷(KH2PO4,1 mmol·L-1)完全營養(yǎng)液澆灌，每隔2天1次，每次200 mL。30天后開始進行低磷和常磷脅迫處理。苗木處理4個月后于2014年8月采集油茶苗的根、莖、葉組織，用錫箔紙包裹好樣品立即放入液氮中，保存于-80℃冰箱中備用。

水培試驗：選擇磷高效基因型‘長林166號’無性系一年生扦插苗作為水培試驗材料。將‘長林166號’油茶苗常磷水平沙培一個月，然后將長出新根的油茶苗轉移常磷全營養(yǎng)液中進行水培培養(yǎng)。采用塑料筐作為水培的容器,帶孔泡沫板作為固定板。將油茶苗固定在泡沫板上，根系浸入營養(yǎng)液中，同時利用氧氣泵進行連續(xù)充氣。每筐定植12棵，共水培4筐。先讓油茶苗在常磷全營養(yǎng)液中培養(yǎng)一個星期，使其適應常磷水培環(huán)境。一個星期之后，將其中兩盆用低磷LP(5 μmol·L-1KH2PO4)營養(yǎng)液進行低磷脅迫處理和另外兩盆用常磷HP(1 mmol·L-1KH2PO4)營養(yǎng)液處理作為對照，每5天更換一次營養(yǎng)液。采集低磷脅迫0、12、24、48、72和96 h的根系樣品。常磷和低磷水培一個月后，采集兩個處理的根系樣品。采集的根系樣品用錫箔紙包裹立即后放入液氮中，保存于-80℃冰箱備用。

1.2.2 RNA的提取及逆轉錄

植物組織總RNA的提取按照植物RNA快速提取試劑盒(RN38 EASY spin Plus)說明書進行。用UV-Vis Spectrophotometer Q5000微量分光光度計測定RNA的濃度，并進行1%瓊脂糖電泳分析其完整性。參照Invitrogen公司的反轉錄試劑盒(SuperScripTMIII First-STRAND Synthesis System for RT-PCR)逆轉錄合成第一鏈cDNA，合成后的cDNA稀釋后用于基因PCR擴增和實時熒光定量PCR。

1.2.3 引物設計與合成

利用Pfam數據庫中CS結構域(PF00285)的模型，通過Hmmer3.0本地軟件對課題組前期的油茶轉錄組的數據[32進行比對搜索，篩選獲得CS基因相關的Unigenes。利用DNAstar 7.0中Editseq程序和ORF-Finder尋找開放閱讀框，并進行blast分析驗證，選擇含有CS基因完整開放閱讀框(ORF)的Unigene作為油茶CS基因研究的參考序列。

利用Primer Premier 5和oligo7設計CS基因的全長引物，上下游引物分別為FP:5′-ATGGTGTTCTTCAGAAGCGTTTC-3′,RP:5′-TTAAGCTGATTTCTTGCAGTAATTTTC-3′，基因組全長擴增引物與cDNA全長引物擴增引物相同；利用primer3設計熒光定量PCR引物，上游為CS F1 5′-GGCTTCTTCCTCTTCACTCA-3′，下游為CS R1 5′-AACTTACACCGAATCCTCAC-3′；利用primer-blast驗證引物的的特異性。引物由上海生工和擎科生物合成。

1.2.4油茶CS基因cDNA全長和基因組全長的克隆

以‘長林4號’植物的根系的cDNA為模板，進行PCR擴增cDNA全長。PCR反應體系(50 μL):5×EVO Buffer(with 10 mmol·L-1MgCl2)10 μL,dNTP Mix 1 μL,5×PCR Enhancer 10 μL,模板cDNA 4 μL,上下游引物各2 μL,ddH2O 20 μL。擴增條件:95℃ 3 min;95℃ 15 s,56℃ 15 s,72℃ 1 min,35個循環(huán);72℃ 7 min;4℃保持。以長林4號植物的根系的DNA為模板，進行PCR擴增CS基因基因組全長。PCR反應體系和擴增條件與cDNA全長擴增基本相同。將PCR產物用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收,將cDNA全長和基因組DNA全長擴增的回收產物分別與pMD-18T和pTOPO-Blunt Simple克隆載體連接,并轉化大腸桿菌(E.coli)DH5α,菌液PCR鑒定后將陽性結果送擎科生物公司測序。

1.2.5 油茶CS基因的生物信息學分析

測序獲得的序列利用DNAstar 7.0軟件分析基因的ORF，并推導出氨基酸序列；利用NCBI中BLAST程序對測序序列進行比對，搜索同源氨基酸序列；利用Clustal Omeg、DNAMAN7.0和MEGA6.0等軟件對同源序列進行多序列比對、系統(tǒng)發(fā)育進化樹構建；使用MEME數據庫分析蛋白質的保守區(qū)；利用InterProscan、Motif Scan和PROSITE分析蛋白質的家族、結構域、模體和功能位點；利用ExPASy上的protparam和ProtScal分析蛋白的相對分子質量、等電點理化參數和親疏水性；利用InterProscan和CCTOP在線工具對跨膜區(qū)和跨膜螺旋進行預測；采用SignalP 4.1對信號肽進行預測；利用Plant-PLoc、CELLO v.2.5、WoLF PSORT、targetP1.1 Server、SubLoc v1.0預測蛋白質的亞細胞定位；采用SOMPA預測蛋白質的二級結構；采用SWISS-MODEL同源建模的方法模擬CoCS蛋白的三維結構，使用UCSF Chimera軟件對構建的模型進行觀察和分析。

1.2.6 實時熒光定量PCR

以‘長林4號’根系cDNA為模板利用primer3設計的熒光定量引物進行PCR擴增，PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果表明，兩對引物均能擴增出特異的目的片段。以稀釋15倍的各樣品的cDNA樣品為模板，以油茶Actin7α基因[33]作為本實驗的內參基因，使用ABI7300實時熒光定量PCR儀進行RT-PCR實驗。RT-PCR反應體積為20 μL,2×SYBR Premix Ex TaqTM(2×)10.0 μL,ROX Reference Dye(×50) 0.4 μL,正反向引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL,cDNA 2.0 μL,ddH2O 6.8 μL,每個反應重復4次。RT-PCR反應程序:95℃ 30 s;95℃ 5 s,60℃ 31 s,40個循環(huán);95℃ 15 s,60℃ 60 s,95℃ 15 s。qRT-PCR反應檢測數據采用2-△△Ct方法分析。

1.2.7 數據處理與分析

利用Excel 2010和GraphPad Prism 5軟件進行數據處理和圖表制作；利用IBM SPSS Statistics 22軟件進行統(tǒng)計分析，用單因素方差分析法(one-way ANOVA，Duncan)進行顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 油茶CS基因cDNA和DNA克隆

以油茶無性系‘長林4號’的根系總RNA(圖1A)反轉錄的cDNA為模板,以CSFP和CSRP為上下游引物，PCR擴增得到一條1 500 bp左右的特異條帶(圖1B)。將PCR產物回收的接到pMD-18T載體,轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α,進行菌液PCR檢測獲得陽性克隆后送公司測序。測序結果表明，該PCR產物的片段長度為1 416 bp。測序結果序列與轉錄組序列一致。該基因全長1 416 bp，編碼471個氨基酸。將氨基酸序列在NCBI中進行BlaxtP搜索同源序列結果顯示全是CS基因，因此將基因命名為CoCS，登錄號為KU161147。以油茶無性系4號的根系DNA為模板，以CSFP和CSRP為上下游引物進行PCR擴增，分離得到油茶CS基因的基因組序列(圖1C)，經比對與CS基因的cDNA序列一致，說明該基因DNA序列不含內含子。

圖1 總RNA的電泳、油茶CS基因cDNA和DNA的克隆Fig.1 Electrophoresis of total RNA,Cloning of cDNA and DNA of CS in C.oleifera

2.2 CoCS蛋白的同源性和系統(tǒng)進化樹分析

將分離得到的油茶CS基因的cDNA序列推導出氨基酸序列，通過NCBI中的BLASTp程序搜索其同源序列。利用Clustal Omeg和DNAMAN6軟件對油茶CS基因與其他物種同源序列進行多序列比對和同源分析，結果顯示(圖2)，油茶CS基因與其他植物的CS基因所編碼的氨基酸序列相似度均在84.8%以上,其中與芝麻(Sesamumindicum)的相似度最高為91.1%，與葡萄(Vitisvinifera)、麻風樹(Jatrophacarcas)和桑屬(Morusnotabilis)相似度為分別為90.3%、90.3%和89.2%。

圖2 CoCS與其他植物同源蛋白的氨基酸多序列比對 Co.油茶；Si.芝麻；Vv.葡萄；Mn.桑屬；Jc.麻風樹；Ca.甜椒；St.馬鈴薯；Ns.煙草；At.擬南芥 ◆N-糖基化位點；▼酪蛋白激酶Ⅱ的磷酸化位點；■肉豆蔻?；稽c；●蛋白激酶C磷酸化位點；▽酪氨酸激酶磷酸化位點；□檸檬酸合酶標簽；★檸檬酸合酶活性位點Fig.2 Multiple alignment result of CoCS and homologous proteins of other plants Co.Camellia oleifera；Si.Sesamum indicum；Vv.Vitis vinifera；Mn.Morus notabilis；Jc.Jatropha curcas；Ca.Capsicum annuum；St.Solanum tuberosum；Ns.Nicotiana sylvestris；At.Arabidopsis thaliana ◆N-glycosylation site; ▼Casein kinase II phosphorylation site; ■N-myristoylation site; ●Protein kinase C phosphorylation site; ▽Tyrosine kinase phosphorylation site; □Citrate synthase signature; ★Citrate synthase active site

為進一步分析油茶CS蛋白與其他物種CS蛋白之間的進化關系，利用Clustal Omeg對油茶CS蛋白與其他植物CS蛋白序列進行多序列比對，利用MEGA6.0中Neighbor-joining法構建了CS蛋白的系統(tǒng)進化樹，選擇小立碗蘚為外群，作為進化樹分支參考。結果顯示(圖3)，被子植物中的雙子葉植物和單子葉植物聚為一大類，目科屬親緣關系相近的植物歸為一類，如錦葵目(Malvales)中的雷蒙德氏棉(Gossypiumraimondii)與可可(Theobromacacao)聚在一起，十字花科(Cruciferae)中的亞麻薺(Camelinasativa)、歐洲油菜(Brassicanapus)和擬南芥(Arabidopsisthaliana)聚在一起。油茶與杜鵑(Rhododendronmicranthum)、葡萄(Vitisvinifera)聚在一起，說明他們的親緣關系最為接近，其次與中粒咖啡(Coffeacanephora)和芝麻(Sesamumindicum)的親緣關系較近。CS蛋白在草本植物中的進化速度比木本中的進化速度快，其中十字花科的進化速度最快。

2.3 CoCS蛋白的生物信息學分析

采用InterProscan、Motif Scan和PROSITE在線工具預測油茶CS蛋白的家族、結構域、模體、功能位點等，結果表明，CoCS屬于真核生物檸檬酸合酶家族成員(IPR010109)，含有一個檸檬酸合酶(Citrate synthase)結構域(PF00285，78-455)，含有一個檸檬酸合酶家族的標簽基序(Citrate synthase signature)“GFGHGVLRNTDP”(PS00480)，共同模式(Consensus pattern)為“G-[FYAV]-[GA]-H-x-[IV]-x(1,2)-[RKTQ]-x(2)-[DV]-[PS]-R”，組氨酸(H)是檸檬酸合酶活性位點殘基。氨基酸序列中存在N-糖基化位點、肉豆蔻?；稽c、酪蛋白激酶Ⅱ的磷酸化位點、蛋白激酶C磷酸化位點、酪氨酸激酶磷酸化位點(圖2)。

圖3 CoCS與其他物種的CS蛋白質的進化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree relationships among the CoCS and homologous protein in other plants

利用ProtParam對CoCS蛋白質進行理化性質分析，結果顯示該蛋白的分子量為52.74 kD，理論等電點(PI)為6.95；帶負電荷殘基(Asp+Glu)數為51個，帶正電荷殘基(Arg+Lys)數為50個，分子式為C2379H3745N639O683S16；不穩(wěn)定指數(II)為35.33，屬于穩(wěn)定蛋白；脂肪系數為95.80，總平均親水性為-0.208,可以判斷CoCS是疏水性蛋白。

利用在線軟件CCTOP對CoCS蛋白的跨膜區(qū)與跨膜拓撲結構預測，結果表明CoCS非跨膜蛋白。利用SignalP 4.1 Server預測CoCS的信號肽，結果顯示CoCS不存在信號肽；利用SubLoc v1.0、targetP1.1 Server、Plant-PLoc、CELLO v.2.5和WoLF PSORT預測CoCS的亞細胞定位，預測結果顯示均定位在線粒體上。采用SOPMA對CoCS蛋白二級結構預測表明，α-螺旋是油茶CoCS蛋白的主要結構元件，α-螺旋(Alpha helix)占45.65%，β折疊(Extended strand)占12.10%、β轉角(Beta turn)占9.98%、無規(guī)則卷曲(Random coil)占32.2%。

2.4 CoCS基因的表達分析

利用qRT-PCR技術分析了‘長林166號’油茶無性系根系受到低磷脅迫不同時間CoCS基因的表達情況，結果表明(圖4A)，低磷脅迫后，根系中CoCS基因的表達量均比脅迫前高，呈先增升高后降低的趨勢，其中在脅迫24 h表達量達到最高，為對照的2.6倍，96 h時表達量為對照的1.4倍。分析不同磷水平處理水下水培30 d后‘長林166號’根系CoCS基因表達量的結果顯示(圖4B)，低磷處理下根系CoCS基因的表達量高于對照，為對照的1.4倍。

圖4 不同低磷處理時間(A)和不同磷水平(B)根系CoCS基因的表達 不同字母表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01) 下同。Fig.4 Expresson of CoCS in root under different treatment time and different phosphate treatment levelDifferent letters indicated significant difference at 5% level; ** indicated significant difference at 1% level The same as below.

分析不同磷水平處理下‘長林4號’和‘長林166號’根、莖、葉中CoCS基因表達的結果表明(圖5)：在根部(圖5A)，低磷處理下‘長林4號’CoCS基因表達量和對照相當沒有顯著變化，而‘長林166號’表達量稍微升高，比對照提高了的15.84%；在低磷處理和對照處理下，‘長林166號’中該基因的表達量均比‘長林4號’高，其中對照處理下該基因的表達量是‘長林4號’的2.5倍，低磷處理下是‘長林4號’的3.2倍。在莖中(圖5B)，該基因的表達模式與根部相反，低磷處理下，‘長林4號’莖中表達量相對對照增加了1倍，而在‘長林166號’相對對照減少了40.29%；正常磷水平處理下‘長林166號’是‘長林4號’的1.5倍，而低磷處理‘長林4號’則是‘長林166號’的2.3倍。在葉片中(圖5C)，該基因的表達模式與莖部相似，低磷處理下‘長林4號’莖中表達量較對照升高了1.5倍，而‘長林4號’表達量較對照降低了27.27%。

圖5 不同磷水平處理下根、莖、葉中CoCS基因的表達 A.根；B.莖；C.葉Fig.5 Expression of CoCS in root,stem and leaf under different phosphate treatment level A.Root; B.Stem; C.Leaf

3 討論

檸檬酸是三羧酸循環(huán)(TCA)中重要的中間產物，檸檬酸合酶(citrate synthase，CS)具有催化草酰乙酸(OAA)和乙酰輔酶A(CoA)合成檸檬酸的作用。三羧酸循環(huán)在三大營養(yǎng)素糖類、脂類、氨基酸的代謝中起著樞紐作用，是它們的最終代謝通路，對生物體的各種氧化還原反應過程都起著至關重要的作用。檸檬酸合酶催化合成的檸檬酸通過根系分泌到土壤中可以能夠活化土壤中的難容磷，提高植物的磷利用效率[9,21]。超表達檸檬酸合酶基因可以提高轉基因植株提高磷的吸收和利用效率[20,23,25]。

本研究從油茶中克隆了CS基因的全長，并對其進行了生物信息學分析。分析結果顯示，CoCS其它植物的CS蛋白序列高度相似，與杜鵑和葡萄的CS蛋白具有較近的進化關系；該基因的蛋白序列具有典型的CS蛋白的活性位點和結構域，與其他植物CS蛋白序列的特征一致[34～36]。因此說明CoCS基因屬于高等植物CS基因家族成員。熒光定量PCR結果表明，低磷脅迫后，根系中的CoCS的表達受到低磷誘導，表達量呈現先升高后降低的趨勢。正常和低磷處理一個月后，低磷處理下根系中CoCS表達量低磷較正常處理略有增強，結果與茶樹CS基因在低磷下表達略有升高的結果一致[31]。這說明低磷可以地誘導檸檬酸合酶的增強表達。沙培4個月后，低磷處理下‘長林4號’根系CoCS基因表達量較對照沒有顯著變化，而‘長林166號’表達量略有提高，正常和低磷處理下，‘長林166號’根系中的CoCS基因表達量均比‘長林4號’高，這說明油茶根系中的CoCS表達量的高低與自身的基因型有關。葉和莖中CoCS的表達模式相同，與根不同。低磷處理下，在莖和葉中‘長林4號’升高，而‘長林166號’降低，這說明CoCS基因在不同組織中的表達模式不同；葉和莖中的表達模式相同，可能是莖的采樣部位是莖尖幼嫩部位與莖尖分化出的嫩葉的部位距離相近導致的；‘長林166號’和‘長林4號’不同，可能是由于自身基因型差異有關。正常處理和低磷下在根和葉中，‘長林166號’的表達量均比‘長林4號’的高，但在莖中低磷下‘長林4號’的反比‘長林166號’的高，這可能是由于在低磷處理下，‘長林166號’根系中CoCS的表達量比‘長林4號’高，導致在莖中‘長林166號’更早適應低磷，CoCS表達量降低的速度比‘長林4號’快，從而導致‘長林4號’反比‘長林166號’的高。綜上結果表明，低磷能誘導根系中CoCS基因輕微上調表達，但在不同無性系不同組織中的表達模式不同，這暗示CoCS基因的功能在不同油茶品種和不同組織中存在差異，下一步將通過轉基因來驗證CoCS基因的功能，為揭示油茶適應低磷的分子機制和選育磷高效油茶品種奠定分子生物學基礎。

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This work was supported by Zhejiang Agriculture Major Project ‘Breeding and demonstration of the new cultivars ofCamelliaoleiferawith high yield and good quality’(2012C12908)

introduction：YE Si-Cheng(1985—),male,Dr.,main research interest is non-timber tree breeding and cultivation.

date:2016-03-16

CloningandExpressionAnalysisofCitrateSynthase(CS)GeneinCamelliaoleifera

YE Si-Cheng YAO Xiao-Hua*WANG Kai-Liang LIN Ping GONG Hong-En ZHUO Ren-Ying

(Research Institute of Subtropical Forestry,Chinese Academy of Forestry,Fuyang 311400)

A citrate synthase(CS) gene were isolated fromCamelliaoleiferaby RT-PCR. The full-length cDNA of theCSis 1 416 bp in size, encodeding a deduced polypetide of 471 amino acids with estimated molecular weight of 52.74 kD and theoretical isoelectric point of 6.95. Homologous alignment showed that the deduced protein had high identities with the CS proteins of other plants, therefore the gene was named asCoCS(Genbank No.KU161147). By phylogenetic tree analysis, CoCS had close genetic relationships withRhododendronmicranthumandVitisvinifera. By qRT-PCR, the expression ofCoCSin root was induced by phosphate deficiency and increased at first and decreased subsequently. The expression patterns ofCoCSwere different among different tissues and different cultivars.

Camelliaoleifera;citrate synthase;phosphate deficient;gene cloning;expression analysis

浙江省重大農業(yè)專項“油茶高產優(yōu)質新品種選育及示范”(2012C12908)

葉思誠(1985—)，男，博士研究生，主要從事經濟林栽培育種研究。

* 通信作者：E-mail:yaoxh168@163.com

2016-03-16

* Corresponding author：E-mail:yaoxh168@163.com

S794.4

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.04.011