李 晗 李治龍 李曉嶼 李玉花 藍興國

(東北林業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150040)

羽衣甘藍不同組織及柱頭發(fā)育實時熒光定量PCR內參基因的篩選

李 晗 李治龍 李曉嶼 李玉花 藍興國*

(東北林業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150040)

以羽衣甘藍(Brassicaoleraceavar.acephala)S13-bS13-b自交不親和系為試材，利用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術檢測Actin、Cpi6、EF-1β、GAPDH、Tub-α3、Tub-α6、Ubc7候選內參基因在不同組織和5個不同發(fā)育時期柱頭的表達情況，并運用geNorm和BestKeeper軟件統(tǒng)計分析候選內參基因的表達穩(wěn)定性。在不同組織中，geNorm軟件統(tǒng)計分析的結果表明Tub-α6和EF-1β的表達較穩(wěn)定；BestKeeper軟件統(tǒng)計分析的結果表明Ubc7和Tub-α6的表達較穩(wěn)定。在不同發(fā)育柱頭中，geNorm軟件統(tǒng)計分析的結果表明Actin和Ubc7的表達較穩(wěn)定；BestKeeper軟件統(tǒng)計分析的結果表明EF-1β和Tub-α6的表達較穩(wěn)定。以篩選到的內參基因Tub-α6和Actin，分別分析羽衣甘藍柱頭S-位點糖蛋白基因(SLG)在不同組織和不同發(fā)育時期柱頭的表達水平，結果顯示出SLG主要在柱頭中表達，而且SLG在柱頭發(fā)育成熟時期表達量達到最高。

羽衣甘藍；實時熒光定量PCR；內參基因；柱頭發(fā)育；SLG

羽衣甘藍(Brassicaoleraceavar.acephala)屬于十字花科(Brassicaceae)蕓薹屬(Brassica)植物，由于其葉色彩鮮艷且頭部形狀酷似牡丹，被稱為“葉牡丹”[1]。由于其具有較強的耐寒性，是我國北方重要的綠化觀賞植物[2～3]。在育種方面，由于羽衣甘藍大部分栽培品種都具有自交不親和性(Self-incompatibility，SI)，人們在育種過程中主要采用SI系進行羽衣甘藍雜交種的生產[4]。

在蕓薹屬植物SI上的研究發(fā)現(xiàn)，SI反應與柱頭的生長發(fā)育密切相關[5]。而且，SI相關的SLG(S-locus glycoprotein)、SRK(S-locus receptor kinase)、MLPK(M-locus protein kinase)和ARC1(Armadillo Repeat-Containing protein 1)基因表達具有柱頭組織表達特異性，并且與柱頭發(fā)育成熟性正相關[6～13]。因此，定量分析基因在不同組織及柱頭發(fā)育階段表達的水平，對于闡述基因在SI及柱頭發(fā)育方面的功能是十分重要的。

實時熒光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)是近些年來發(fā)展的一種定量分析基因表達的方法[14～15]。由于該方法重復性好、定量精確及高通量等優(yōu)點，已廣泛應用于基因的表達研究。在本研究中，我們選擇了Actin、Cpi6(cysteine proteinase inhibitor 6)、EF-1β(elongation factor 1-beta)、GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、Tub-α3(tubulin alpha-3)、Tub-α6(tubulin alpha-6)、Ubc7(ubiquitin conjugating enzyme7)候選內參基因，通過geNorm[16]和BestKeeper[17]軟件統(tǒng)計分析候選內參基因的表達穩(wěn)定性，以期篩選出表達最穩(wěn)定的內參基因,為進一步開展基因表達的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2014年2～6月在東北林業(yè)大學生命科學學院發(fā)育生物學實驗室完成。羽衣甘藍(Brassicaoleraceavar.acephala)自交不親和系(S13-bS13-b)由東北林業(yè)大學花卉生物工程研究所提供。選取羽衣甘藍的根、嫩莖、嫩葉、當天開花未散粉的柱頭、花柱、子房、花藥、花瓣為不同組織材料，選取不同花蕾長度(0～4、4～6、6～8、8～10、>10 mm)的柱頭為不同發(fā)育時期材料，液氮速凍后保存于-80℃冰箱內。

Phase Lock GelTM(PLG)Heavy、TRIzol A+購自天根生化科技有限公司；Premix exTaqDNA聚合酶、dNTP購自大連寶生物(TaKaRa)公司；DNaseⅠ，RNase-free購自Thermo公司；High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit試劑盒、標準96孔板、光學膜、Power SYBY? Green PCR Master Mix購自美國應用生物系統(tǒng)(ABI)公司；RNase Inhibitor購于哈爾濱歐比特科技開發(fā)有限公司；熒光定量PCR所用機器為ABI 7500。

1.2 PCR引物設計

依據實時定量PCR引物設計原則，分別設計Actin、Cpi6、EF-1β、GAPDH、Tub-α3、Tub-α6、Ubc7候選內參基因和SLG13-b引物，相關信息在表1。

表1 羽衣甘藍候選內參基因和SLG引物及相關信息

1.3 總RNA的提取和cDNA的合成

將羽衣甘藍材料于液氮中迅速研磨，將研磨好的材料放于700 μL TRIzol A+中；勻漿樣品在室溫下震蕩15 min；將Phase Lock GelTM(PLG)置于離心機中，12 000×g離心30 s；將勻漿樣品轉入離心后的PLG中，加入140 μL氯仿，劇烈震蕩10 min；4℃，12 000×g離心15 min；將PLG上層含有RNA的水相轉移至一個新的RNase Free離心管；向得到的水相加入等體積異丙醇，徹底混合均勻，室溫放置30 min；4℃，12 000×g離心10 min；棄掉上清，加入75%乙醇對沉淀進行洗滌；4℃，7 500×g離心5 min；室溫放置晾干，加入適量RNase Free H2O充分溶解RNA。利用NanoDrop2000超微分光光度計(Thermo公司)測定OD260/280值，檢測RNA的濃度和純度，并將RNA濃度調整為1 μg·μL-1。使用DNaseⅠ去除基因組DNA：RNA 1 μL(1μg·μL-1)、10×reaction buffer with MgCl21 μL、DNaseⅠ 1 U、RNase-free Water 7 μL，反應條件為37℃，30 min，加入EDTA(50 mmol·L-1)1 μL，65℃，10 min；利用去除基因組DNA的羽衣甘藍總RNA進行反轉錄cDNA，反應體系為20 μL，其中10×RT Buffer 2 μL、25×dNTP Mix(100 mmol·L-1)0.8 μL、10×RT Random Primers 2 μL、MultiScribeTMReverse Transcriptase 1 μL、RNase Inhibitor 1 μL、Nuclease-free H2O 2.2 μL、上述去基因組RNA 11 μL。反應條件為25℃，10 min；37℃，120 min；85℃，5 min。

1.4 目的基因片段的PCR擴增

利用設計的引物進行PCR擴增，總體積20 μL，其中Premix exTaq為10 μL、10 μmol·L-1上下游引物各0.5 μL、cDNA 0.5 μL。PCR反應條件為：94℃預變性2 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)；72℃延伸7 min。0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。

1.5 qRT-PCR分析

取10 μL反轉錄的cDNA稀釋于200 μL ddH2O中作為反應模板。反應體系總體積為20 μL，其中SYBR Green Mix(ABI)10 μL、10 μmol·L-1上下游引物各0.8 μL、稀釋后cDNA 8.4 μL。95℃預變性10 min，95℃變性15 s，60℃延伸1 min，40個擴增循環(huán)，溶解曲線分析：95℃、15 s，60℃、1 min，95℃、15 s，60℃、15 s。每個樣品進行3次生物學重復和2次技術重復。

1.6 數據分析

利用geNorm軟件和BestKeeper軟件對候選內參基因的表達穩(wěn)定性進行統(tǒng)計分析。將候選基因的Ct值用Microsoft Excel計算出2-ΔCT值并輸入geNorm軟件，計算得出平均表達穩(wěn)定指數M值。M值小于1.5的基因被認為表達相對穩(wěn)定，且M值越小，表達越穩(wěn)定，反之則不穩(wěn)定；根據內參基因標準化因子的配對差異分析Vn/n+1判定內參基因合適的數目[16]。BestKeeper軟件將Ct值輸入程序，獲得標準差(SD)和調節(jié)系數標準差SD[±x-fold]，其值越小則表示越穩(wěn)定，越大則表示越不穩(wěn)定(Pfaffl 2001)。計算相對表達量的方法為2-ΔΔCT法，默認擴增效率E為2，ΔCt=Ct樣品-Ct內參，ΔΔCt=ΔCt最小-ΔCt樣品[18]。

2 結果與分析

2.1 羽衣甘藍柱頭及組織RNA的提取

分別提取不同發(fā)育階段的柱頭及根、莖、葉、花柱、子房、花藥和花瓣的RNA。OD260/280值均在1.8～2.0。瓊脂糖凝膠電泳顯示，柱頭RNA良好無明顯降解(圖1)，可以用于后續(xù)實驗。

圖1 羽衣甘藍柱頭總RNA的電泳檢測Fig.1 Gel electrophoresis of total RNA from stigmas in B.oleracea var. acephala

2.2 候選內參基因的RT-PCR擴增分析

提取大于10 mm花蕾內的柱頭RNA，去除基因組DNA后，通過反轉錄試劑盒獲得cDNA。分別對Actin、Cpi6、EF-1β、GAPDH、Tub-α3、Tub-α6、Ubc7候選內參基因進行PCR，利用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。結果顯示出，擴增出的內參基因條帶單一，并與預期結果一致(圖2，表1)。說明各候選內參基因的擴增條帶特異性較好，可以用于qRT-PCR的分析。

圖2 7個候選內參基因的PCR擴增產物Fig.2 PCR products of 7 candidate reference genes M.DL1000; 1.Cpi6; 2.GAPDH; 3.Tub-α6; 4.Tub-α3; 5.EF-1β; 6.Actin; 7.Ubc7

2.3 候選內參基因的qRT-PCR表達分析

分別對Actin、Cpi6、EF-1β、GAPDH、Tub-α3、Tub-α6、Ubc7候選內參基因進行qRT-PCR檢測。圖3顯示在不同發(fā)育階段的柱頭樣品中，7個候選內參基因的熔解曲線有明顯的單一峰。而且，圖4顯示出擴增曲線良好，可以滿足qRT-PCR的要求。7個候選內參基因在羽衣甘藍不同組織中表達的Ct值在17～31間，其中GAPDH表達量較高，Ubc7表達量較低(圖5:A)；在不同發(fā)育時期的柱頭中，也發(fā)現(xiàn)GAPDH表達量較高，Ubc7表達量較低(圖5:B)。

圖3 7個候選內參基因的溶解曲線Fig.3 Melting curves of 7 candidate reference genes A.Actin; B.Cpi6; C.EF-1β; D.GAPDH; E.Tub-α3; F.Tub-α6; G.Ubc7

圖4 7個候選內參基因的擴增曲線Fig.4 Amplification curves of 7 candidate reference genes A.Actin; B.Cpi6; C.EF-1β; D.GAPDH; E.Tub-α3; F.Tub-α6; G.Ubc7

圖5 7個候選基因在不同組織(A)和不同發(fā)育時期柱頭(B)的Ct值變化 T1～T8分別代表根、莖、葉、柱頭、花柱、子房、花藥和花瓣；S1～S5分別代表花蕾大小在0～4、4～6、6～8、8～10 mm和大于10 mm的柱頭 下同。Fig.5 The Ct value of 7 candidate reference genes in different tissues(A) and developmental stigmas(B) of ornamental kale T1-T8 represented root,stem,leaf,stigma,style,ovule,anther and petal; S1-S5 represented stigma at different bud size,with S1=0-4 mm bud size,S2=4-6 mm bud size,S3=6-8 mm bud size,S4=8-10 mm bud size,S5=over 10 mm bud size The same as below.

2.4不同組織候選內參基因表達穩(wěn)定性的統(tǒng)計分析

為了篩選羽衣甘藍不同組織的最佳內參基因，首先采用geNorm軟件對7個候選內參基因的表達穩(wěn)定性進行分析。將7個候選基因的Ct值用Microsoft Excel計算出2-ΔCT值并輸入geNorm軟件，計算得出平均表達穩(wěn)定指數M值。M值小于1.5的基因被認為表達相對穩(wěn)定，且M值越小，表達越穩(wěn)定。圖6A的結果表明表達穩(wěn)定的候選內參基因順序為Tub-α6/EF-1β(0.69)>Actin(0.74)>Ubc7(0.79)>Cpi6(0.82)>Tub-α3(0.91)>GAPDH(0.98)。這個結果說明Tub-α6和EF-1β是表達較為穩(wěn)定的內參基因，而GAPDH表達最不穩(wěn)定。此外，通過geNorm軟件計算出配對變異值Vn/n+1。Vn/n+1為選擇閾值，即當Vn/n+1<0.15時，n個基因即可滿足內參基因的要求。圖6B的結果顯示出V4/5為0.144，即需要選擇4個內參基因Tub-α6、EF-1β、Actin和Ubc7。

圖6 不同組織候選內參基因的M值(A)和V值(B)Fig.6 M values(A) or V values(B) of reference genes indifferent tissues by geNorm analysis

BestKeeper軟件是以標準差(SD)和調節(jié)系數標準差SD[±x-fold]來評判基因的表達穩(wěn)定性，其值越小則表示越穩(wěn)定，越大則表示越不穩(wěn)定。如表2所示，在羽衣甘藍不同組織中7個候選基因的表達穩(wěn)定性為順序為Ubc7(0.41)>Tub-α6(0.43)>Actin(0.58)>Tub-α3(0.68)>EF-1β(0.72)>Cpi6(0.92)>GAPDH(1.00)，這結果表明BestKeeper軟件默認Ubc7和Tub-α6是較為穩(wěn)定的候選內參基因。綜合geNorm軟件和BestKeeper軟件分析的結果，認為Tub-α6是羽衣甘藍不同組織中表達穩(wěn)定的最佳候選內參基因。

2.5不同發(fā)育時期柱頭內參基因表達穩(wěn)定性的統(tǒng)計分析

為了分析羽衣甘藍不同發(fā)育時期柱頭的最佳候選內參基因，采用geNorm軟件對7個候選內參基因的表達穩(wěn)定性進行分析。圖7A的結果表明表達穩(wěn)定的候選內參基因順序為Actin/Ubc7(0.193)>Cpi6(0.330)>Tub-α6(0.436)>EF-1β(0.486)>Tub-α3(0.530)>GAPDH(0.577)。這個結果表明Actin和Ubc7是表達穩(wěn)定的內參基因。而且所有的V值均小于0.15，因此認為選擇Actin和Ubc7兩個內參基因可滿足穩(wěn)定性需求(圖7B)。此外，BestKeeper軟件分析結果7個候選基因穩(wěn)定性順序為EF-1β(0.33)>Tub-α6(0.35)>Cpi6(0.36)>Actin(0.41)>GAPDH(0.41)>Tub-α3(0.45)>Ubc7(0.51)，其中表達較為穩(wěn)定的是EF-1β和Tub-α6(表3)，且所有候選基因均符合內參穩(wěn)定性要求即std dev[±CP]小于1。綜合geNorm軟件和BestKeeper軟件分析的結果，認為Actin是羽衣甘藍柱頭發(fā)育時期中表達穩(wěn)定的最佳候選內參基因。

表2利用BestKeeper軟件對羽衣甘藍不同組織7個候選內參基因的統(tǒng)計分析

Table2SummarystatisticsgeneratedbytheBestKeeperanalysisfor7candidatereferencegenesinthedifferenttissuesofornamentalkale

Ubc7Tub?α6ActinTub?α3EF?1βCpi6GAPDHn8888888geoMean[CP]28．7319．6825．0720．0222．5720．8018．09arMean[CP]28．7419．6825．0820．0422．5820．8318．13min[CP]27．7818．8224．1818．6021．2519．1316．73max[CP]29．9520．9725．9521．2223．7121．9220．18stddev[±CP]0．410．430．580．680．720．921．00CV[%CP]1．422．182．323．383．204．415．53min[x-fold]-1．94-1．81-1．86-2．68-2．50-3．19-2．57max[x-fold]2．322．451．832．312．202．174．26stddev[±x-fold]1．331．351．501．601．651．892．00Stabilityrank1234567

表3利用BestKeeper軟件對羽衣甘藍不同發(fā)育時期柱頭組織7個候選內參基因的統(tǒng)計分析

Table3SummarystatisticsgeneratedbytheBestKeeperanalysisfor7candidatereferencegenesinthedifferentdevelopmentalstigmasofornamentalkale

EF?1βTub?α6Cpi6ActinGAPDHTub?α3Ubc7n5555555geoMean[CP]23．4920．6518．3625．6124．1721．8030．30arMean[CP]23．4920．6518．3625．6224．1721．8130．31min[CP]23．1920．2517．8624．9223．5621．3129．53max[CP]24．3121．3618．7526．0324．8722．6330．83stddev[±CP]0．330．350．360．410．410．450．51CV[%CP]1．401．671．981．581．702．041．67min[x-fold]-1．23-1．32-1．41-1．61-1．53-1．40-1．71max[x-fold]1．771．641．311．341．631．781．45stddev[±x-fold]1．261．271．291．321．331．361．42Stabilityrank1234567

圖7 不同發(fā)育時期柱頭候選內參基因的M值(A)和V值(B)Fig.7 M values(A) or V values(B) of reference genes in different developmental stigmas by geNorm analysis

圖8 SLG基因在不同組織(A)和不同發(fā)育階段柱頭(B)的表達分析Fig.8 Expression analysis of SLG gene in different tissues(A) and developmental stigmas(B) of ornamental kale

2.6SLG在不同組織和不同發(fā)育時期柱頭的表達分析

SLG基因表達具有柱頭組織表達特異性，并且與柱頭發(fā)育成熟性正相關[6～7]。因此，通過對SLG的表達分析可以驗證篩選到的內參基因的可行性。在不同組織中，以候選基因Tub-α6作為內參基因，結果發(fā)現(xiàn)SLG主要在柱頭組織中表達并且表達量是其它組織表達量的1 000倍左右(圖8:A)；在不同發(fā)育時期的柱頭中，以候選基因Actin作為內參基因，發(fā)現(xiàn)SLG主要隨著柱頭的成熟而表達量增高，而且在柱頭接近成熟的時候(8～10 mm大小的花蕾)達到表達量高峰(圖8:B)。上述結果說明，在羽衣甘藍不同組織和不同發(fā)育時期柱頭的熒光定量PCR研究中，可以采用Tub-α6和Actin作為內參基因進行分析。

3 討論

在qRT-PCR分析中，內參基因的選擇是定量分析的前提[19]。目前，GAPDH[20]、Actin[21]、18s rRNA[22]、EF-1α(elongation factor 1-alpha)[23]、ubiquitin[24]等是目前常被選擇的內參基因。而且發(fā)現(xiàn)，在不同物種或同一物種的不同組織選擇的內參基因可能會不同，如在擬南芥不同組織、發(fā)育及脅迫反應中選擇的最佳內參基因不同[25～27]；在白菜(BrassicarapaL. ssp.pekinensis)花芽發(fā)育中表達最穩(wěn)定的基因是Tubulin和GAPDH[28]，而在不同干旱條件下表達最穩(wěn)定的內參基因是Actin和GAPDH[29]。此外，在內參基因篩選統(tǒng)計分析中，目前主要采用geNorm、Bestkeeper和Normfinder[30]等軟件。這些軟件主要采取不同的統(tǒng)計算法對內參基因穩(wěn)定性進行分析。在本文的研究中，候選基因Actin、Cpi6、EF-1β、GAPDH、Tub-α3、Tub-α6、Ubc7的表達水平在不同組織中差異較大，但在不同發(fā)育時期柱頭中表達情況基本穩(wěn)定(圖5)。采用geNorm和Bestkeeper兩種軟件對候選基因表達數據進行分析。在不同組織表達分析中，geNorm軟件將Tub-α6和EF-1β排在最穩(wěn)定的位置，Bestkeeper軟件將Ubc7和Tub-α6排在比較穩(wěn)定的位置，由于兩個軟件內參穩(wěn)定性的算法不同，因此內參基因穩(wěn)定性排序不同是可能的，最終認為Tub-α6是不同組織中最佳的內參基因；在不同發(fā)育階段的柱頭中，geNorm軟件將Actin和Ubc7排在最穩(wěn)定的位置，Bestkeeper軟件將EF-1β和Tub-α6排在比較穩(wěn)定的位置，且所有的候選基因均符合內參穩(wěn)定性要求即std dev[±CP]小于1，最終認為在不同發(fā)育時期柱頭中最佳內參基因是Actin。

利用篩選到的內參基因對SLG在不同組織和不同發(fā)育階段的柱頭進行表達分析，發(fā)現(xiàn)SLG在柱頭中的表達量是其它組織表達量1 000倍左右，而且也發(fā)現(xiàn)SLG在柱頭接近成熟時表達量達到最高，這個研究結果與預期的結果較為一致，同時也說明了篩選的內參基因可以應用到其它目標基因的定量表達分析中。這些研究結果的發(fā)現(xiàn)對基因在不同組織及柱頭發(fā)育階段的表達研究，提供了更多的線索。

1.Li Y H,Yu X Y.Pollination with laser-irradiated pollens breaks cross-incompatibility between zicaitai(Brassicacampestrisvar.purpurea) and ornamental kale(Brassicaoleraceavar.acephala) to produce hybrids with the aid of ovule culture[J].Scientia Horticulturae,2006,108(4):397-402.

2.解莉楠,丁兵,李玉花.羽衣甘藍新品種‘紅羅裙’和‘白羅裙’[J].園藝學報,2007,34(4):1071.

Xie L N,Ding B,Li Y H.New ornamental kale cultivars of ‘Hongluoqun’ and ‘Bailuoqun’[J].Acta Horticulturae Sinica,2007,34(4):1071.

3.王江,丁兵,李玉花.觀賞羽衣甘藍新品種‘粉玉’[J].園藝學報,2014,41(11):2369-2370.

Wang J,Ding B,Li Y H.A new ornamental kale cultivar ‘Fenyu’[J].Acta Horticulturae Sinica,2014,41(11):2369-2370.

4.Lan X G,Yang J,Cao M M,et al.Isolation and characterization of a J domain protein that interacts with ARC1 from ornamental kale(Brassicaoleraceavar.acephala)[J].Plant Cell Reports,2015,34(5):817-829.

5.Horisaki A,Niikura S.Developmental and environmental factors affecting level of self-incompatibility response inBrassicarapaL.[J].Sexual Plant Reproduction,2008,21(2):123-132.

6.Nasrallah J B,Kao T H,Goldberg M L,et al.A cDNA clone encoding an S-locus-specific glycoprotein fromBrassicaoleracea[J].Nature,1985,318(6043):263-267.

7.Stein J C,Howlett B,Boyes D C,et al.Molecular cloning of a putative receptor protein kinase gene encoded at the self-incompatibility locus ofBrassicaoleracea[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1991,88(19):8816-8820.

8.Goring D R,Rothstein S J.The S-locus receptor kinase gene in a self-incompatibleBrassicanapusline encodes a functional serine/threonine kinase[J].The Plant Cell,1992,4(10):1273-1281.

9.Gu T S,Mazzurco M,Sulaman W,et al.Binding of an arm repeat protein to the kinase domain of the S-locus receptor kinase[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1998,95(1):382-387.

10.Takasaki T,Hatakeyama K,Suzuki G,et al.The S receptor kinase determines self-incompatibility inBrassicastigma[J].Nature,2000,403(6772):913-916.

11.Murase K,Shiba H,Iwano M,et al.A membrane-anchored protein kinase involved inBrassicaself-incompatibility signaling[J].Science,2004,303(5663):1516-1519.

12.藍興國,楊佳,趙昕,等.羽衣甘藍ARC1的基因分離、表達及與SRK相互作用的分析[J].園藝學報,2011,38(12):2342-2348.

Lan X G,Yang J,Zhao X,et al.Isolation expression of ARC1 from ornamental kale and interaction analysis between ARC1 and SRK[J].Acta Horticulturae Sinica,2011,38(12):2342-2348.

13.Indriolo E,Safavian D,Goring D R.The ARC1 E3 ligase promotes two different self-pollen avoidance traits inArabidopsis[J].The Plant Cell,2014,26(4):1525-1543.

14.Bustin S A.Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR(RT-PCR):trends and problems[J].Journal of Molecular Endocrinology,2002,29(1):23-39.

15.Nolan T,Hands R E,Bustin S A.Quantification of mRNA using real-time RT-PCR[J].Nature Protocols,2006,1(3):1559-1582.

16.Vandesompele J,Depreter K,Pattyn F,et al.Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes[J].Genome Biology,2002,3(7):research0034

17.Pfaffl M W.A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR[J].Nucleic Acids Research,2001,29(9):e45.

18.Livak K J,Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTMethod[J].Methods,2001,25(4):402-408.

19.Bustin S A,Beaulieu J F,Huggett J,et al.MIQE précis:practical implementation of minimum standard guidelines for fluorescence-based quantitative real-time PCR experiments[J].BMC Molecular Biology,2010,11:74.

20.Magneschi L,Kudahettige R L,Alpi A,et al.Expansin gene expression and anoxic coleoptile elongation in rice cultivars[J].Journal of Plant Physiology,2009,166(14):1576-1580.

21.Bracha-Drori K,Shichrur K,Lubetzky T C,et al.Functional analysis ofArabidopsispostprenylation CaaX processing enzymes and their function in subcellular protein targeting[J].Plant Physiology,2008,148(1):119-131.

22.Brentner L B,Mukherji S T,Merchie K M,et al.Expression of glutathione S-transferases in poplar trees(Populustrichocarpa) exposed to 2,4,6-trinitrotoluene(TNT)[J].Chemosphere,2008,73(5):657-662.

23.Bomal C,Bedon F,Caron S,et al.Involvement of Pinus taeda MYB1 and MYB8 in phenylpropanoid metabolism and secondary cell wall biogenesis:a comparative in planta analysis[J].Journal of Experimental Botany,2008,59(14):3925-3939.

24.Aquea F,Gutierrez F,Medina C,et al.A novel Otubain-like cysteine protease gene is preferentially expressed during somatic embryogenesis inPinusradiata[J].Molecular Biology Reports,2008,35(4):567-573.

25.Guénin S,Mauriat M,Pelloux J,et al.Normalization of qRT-PCR data:the necessity of adopting a systematic,experimental conditions-specific,validation of references[J].Journal of Experimental Botany,2009,60(2):487-493.

26.Kitashiba H,Liu P,Nishio T,et al.Functional test of Brassica self-incompatibility modifiers inArabidopsisthaliana[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2011,108(44):18173-18178.

27.Indriolo E,Tharmapalan P,Wright S I,et al.The ARC1 E3 ligase gene is frequently deleted in self-compatible Brassicaceae species and has a conserved role inArabidopsislyrataself-pollen rejection[J].The Plant Cell,2012,24(11):4607-4620.

28.Xu X Y,Yang Z P,Sun X L,et al.Selection of reference genes for quantitative real-time PCR during flower bud development in CMS7311 of heading Chinese cabbage(BrassicarapaL.ssp.pekinensis)[J].Acta Physiologiae Plantarum,2014,36(3):809-814.

29.Qi J N,Yu S C,Zhang F L,et al.Reference gene selection for real-time quantitative polymerase chain reaction of mRNA transcript levels in Chinese cabbage(BrassicarapaL.ssp.pekinensis)[J].Plant Molecular Biology Reporter,2010,28(4):597-604.

30.Andersen C L,Jensen J L,?rntoft T F.Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data:a model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization,applied to bladder and colon cancer data sets[J].Cancer Research,2004,64(15):5245-5250.

Central Universities Fundamental Research Special Fund Project(DL13CA13)；National Natural Science Foundation of China(31070275)

introduction：Li Han(1991—),female,master student,mainly engaged in plant developmental biology.

date:2015-12-17

SelectionofReferenceGenesforReal-timeFluorescenceQuantitativePCRinDifferentTissuesandStigmaDevelopmentfromOrnamentalKale

LI Han LI Zhi-Long LI Xiao-Yu LI Yu-Hua LAN Xing-Guo*

(College of Life Sciences,Northeast Forestry University,Harbin 150040)

We used real-time quantitative polymerase chain reaction to test the expression ofActin, cysteine proteinase inhibitor 6(Cpi6), elongation factor 1-beta(EF-1β), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH), tubulin alpha-3(Tub-α3), tubulin alpha-6(Tub-α6) and ubiquitin conjugating enzyme7(Ubc7), and then identified the most suitable reference genes in a given set of tissues and different developmental stigmas of ornamental kale(Brassicaoleraceavar.acephala)S13-bS13-bhomozygotes by using the geNorm and BestKeeper software programs. By a geNorm analysis,Tub-α6 andEF-1βwere the most suitable reference genes among the given set of tissues, andActinandUbc7 were the most stable genes during stigma development. By a BestKeeper analysis,Ubc7 andTub-α6 were the most suitable reference genes among the given set of tissues, andEF-1βandTub-α6 were the most stable genes during stigma development.Tub-α6 andActinwere the most suitable reference genes among the given set of tissues and during stigma development, respectively. Furthermore, the expression ofSLGnormalized withTub-α6 orActinshowed thatSLGwas predominantly expressed in stigma among the given set of tissues and reached its highest level at approaching anthesis during stigma development.

Brassicaoleraceavar.acephala；real-time quantitative PCR；reference genes；stigma development；SLG

中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項基金項目(DL13CA13)；國家自然科學基金項目(31070275)

李晗(1991—)，女，碩士研究生，主要從事植物發(fā)育生物學研究。

* 通信作者：E-mail:lanxingguo@126.com

2015-12-17

* Corresponding author：E-mail:lanxingguo@126.com

S635

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.04.012