孫麗敏 裴雁曦 劉志強(qiáng)

(山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太原 030006)

H2S信號(hào)和WRKY在ABA調(diào)節(jié)根生長和氣孔運(yùn)動(dòng)中的關(guān)系

孫麗敏 裴雁曦 劉志強(qiáng)*

(山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太原 030006)

氣體信號(hào)分子硫化氫(H2S)和植物激素脫落酸(ABA)都可以調(diào)節(jié)植物的種子萌發(fā)、根生長、氣孔運(yùn)動(dòng)、逆境響應(yīng)等生理過程，但兩者之間的關(guān)系了解非常有限。轉(zhuǎn)錄因子WRKY18、WRKY40和WRKY60參與擬南芥對(duì)ABA信號(hào)的響應(yīng)。本文以擬南芥野生型(WT)，lcd(L型半胱氨酸脫巰基酶編碼基因缺失突變體)，wrky18wrky40wrky60(WRKY18、WRKY40和WRKY60編碼基因缺失三突變體)為實(shí)驗(yàn)材料，研究在幼苗根生長和氣孔運(yùn)動(dòng)過程中，H2S與ABA信號(hào)及WRKY之間的相互作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：ABA處理可誘導(dǎo)WT的LCD基因表達(dá)量和內(nèi)源H2S含量升高；外源H2S處理WT，WRKY40表達(dá)量下降，WRKY60表達(dá)量升高；lcd中WRKY18和WRKY40表達(dá)量升高，WRKY60表達(dá)量下降。幼苗根生長和氣孔運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)表明：與WT相比，lcd根生長和氣孔運(yùn)動(dòng)受ABA影響作用較??；H2S對(duì)wrky18wrky40wrky60根生長的促進(jìn)作用明顯，并促進(jìn)wrky18wrky40wrky60和WT氣孔關(guān)閉，但兩者間無顯著差異。

H2S；ABA；WRKY轉(zhuǎn)錄因子

脫落酸(ABA)是一種植物激素，在20世紀(jì)60年代被人們發(fā)現(xiàn)，因其能促使葉子脫落而得名。ABA可以促進(jìn)葉、花和果實(shí)的脫落，調(diào)節(jié)種子胚的發(fā)育，促進(jìn)芽、種子休眠，抑制胚芽鞘、嫩枝、根和胚軸等器官的生長，影響性分化，調(diào)節(jié)氣孔關(guān)閉[18～19]；并且在植物抵御干旱、寒冷、鹽堿、病害和紫外輻射等逆境脅迫的過程中起著非常重要的作用[20]。ABA受體對(duì)ABA識(shí)別是ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的起始，Jin等報(bào)道生理濃度的外源H2S處理可以使擬南芥ABA受體編碼基因表達(dá)量下降[21]。首次將H2S和ABA聯(lián)系起來的Carlos GM等人推斷，H2S可能與ABA相互作用共同調(diào)節(jié)植物生理代謝，增強(qiáng)植物抵御脅迫的能力[17]。

WRKY蛋白是植物中一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控植物多種脅迫響應(yīng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[22]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子不僅參與調(diào)節(jié)植物對(duì)細(xì)菌侵染、冷害、凍害、高鹽、氧化損傷、干旱、高溫等生物、非生物脅迫響應(yīng)[23～25]，而且參與胚胎發(fā)育，種皮和表皮毛發(fā)育，葉片衰老等多種生長發(fā)育過程[22,26～28]。擬南芥WRKY18、WRKY40、WRKY60可以與ABA的受體之一ABAR/LHCB相互作用，并且可以調(diào)節(jié)ABA信號(hào)中的關(guān)鍵基因ABI4和ABI5的轉(zhuǎn)錄[29～31]，在這個(gè)過程中，三個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子互相協(xié)作，共同調(diào)節(jié)ABA信號(hào)通路[32～35]。

目前，關(guān)于H2S信號(hào)和ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)之間關(guān)系的報(bào)道較少。本研究以擬南芥野生型WT，H2S產(chǎn)生酶的編碼基因LCD的缺失突變體lcd，WRKY18、WRKY40、WRKY60轉(zhuǎn)錄因子編碼基因缺失三突變體wrky18wrky40wrky60為實(shí)驗(yàn)材料，研究H2S與WRKY基因及ABA信號(hào)通路之間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)以擬南芥(Arabidopsisthaliana)野生型WT(Col-0)、H2S產(chǎn)生酶編碼基因LCD(AT3G62130)缺失突變體lcd(stock no.SALK_082099)，WRKY18(AT4G31800)、WRKY40(AT1G80840)和WRKY60(AT2G25000)編碼基因缺失三突變體wrky18wrky40wrky60(由清華大學(xué)張大鵬教授饋贈(zèng))為實(shí)驗(yàn)材料。

1.2 培養(yǎng)條件與處理方法

1.2.1 幼苗生長培養(yǎng)條件

擬南芥的土壤培養(yǎng)：擬南芥野生型WT、突變體lcd、wrky18wrky40wrky60種子，4℃春化處理3 d，播種于蛭石∶營養(yǎng)土=2∶1(v/v)的土壤中，于16 h光照/8 h黑暗，相對(duì)濕度為60%，溫度為(23±1)℃，光照強(qiáng)度3 000 lx條件下培養(yǎng)4周，進(jìn)行H2S和ABA處理。

直接生長實(shí)驗(yàn)：取干燥的擬南芥WT、lcd種子經(jīng)75%乙醇處理30 s～1 min，再用6% NaClO處理6～8 min進(jìn)行表面消毒，之后用無菌水潤洗種子4次。將WT、lcd種子分別點(diǎn)種于ABA濃度為0、0.4、0.8 μmol·L-1的1/2 MS固體培養(yǎng)基(表1)，4℃春化處理3 d，轉(zhuǎn)為16 h光照/8 h黑暗，相對(duì)濕度為60%，溫度為(23±1)℃，光照強(qiáng)度為3 000 lx的條件下豎直放置培養(yǎng)12～14 d，拍照記錄擬南芥幼苗根生長狀況，并對(duì)其主根長度進(jìn)行測量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

移苗生長實(shí)驗(yàn)：按直接生長實(shí)驗(yàn)所述方法對(duì)擬南芥WT、lcd、wrky18wrky40wrky60種子進(jìn)行消毒，之后將種子點(diǎn)種于1/2MS固體培養(yǎng)基，4℃春化處理3 d，轉(zhuǎn)為16 h光照/8 h黑暗培養(yǎng)3 d。將萌發(fā)狀態(tài)一致的WT、lcd、wrky18wrky40wrky60幼苗移于表2所列的1/2MS固體培養(yǎng)基，豎直放置培養(yǎng)7～10 d(培養(yǎng)條件同直接生長實(shí)驗(yàn))，拍照記錄擬南芥幼苗根生長狀況，并對(duì)其主根長度進(jìn)行測量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2H2S和ABA處理

土壤培養(yǎng)中幼苗的H2S和ABA處理：外源H2S處理，生長4周的WT進(jìn)行50 μmol·L-1H2S熏蒸8 h；外源ABA處理，生長4周的WT和lcd用100 μmol·L-1ABA處理8 h。

直接生長實(shí)驗(yàn)中幼苗的ABA和H2S處理見表1。

表1ABA和H2S對(duì)WT、lcd的處理

Table1ThetreatmentsofWTandlcdwithABAandH2S

材料Materials處理Treatments(μmol·L-1)WT0μmol·L-1ABA0．4μmol·L-1ABA0．8μmol·L-1ABAlcd0μmol·L-1ABA0．4μmol·L-1ABA0．8μmol·L-1ABAWT0μmol·L-1ABA+50μmol·L-1H2S0．4μmol·L-1ABA+50μmol·L-1H2S0．8μmol·L-1ABA+50μmol·L-1H2S

移苗生長實(shí)驗(yàn)中幼苗的H2S和ABA處理見表2。

表2ABA和H2S對(duì)WT、lcd、wrky18wrky40wrky60的處理

Table2ThetreatmentsofWT,lcdandwrky18wrky40wrky60withABAandH2S

材料Materials處理Treatments(μmol·L-1)WT0μmol·L-1ABA1μmol·L-1ABA2μmol·L-1ABAlcd0μmol·L-1ABA1μmol·L-1ABA2μmol·L-1ABAWT0μmol·L-1ABA+50μmol·L-1H2S1μmol·L-1ABA+50μmol·L-1H2S2μmol·L-1ABA+50μmol·L-1H2SWT0μmol·L-1H2S20μmol·L-1H2S40μmol·L-1H2S80μmol·L-1H2Swrky18wrky40wrky600μmol·L-1H2S20μmol·L-1H2S40μmol·L-1H2S80μmol·L-1H2S

1.3 RNA提取及qRT-PCR

取1.2.1和1.2.2中的植物材料，用TRIZOL試劑盒提取總RNA(Transgen Biotech)，以O(shè)ligo(dT)18為引物反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以ACTIN7(AT5G09810)為內(nèi)參進(jìn)行qRT-PCR檢測基因轉(zhuǎn)錄，具體實(shí)驗(yàn)參照孫[36]等人。所用引物序列為WRKY18：5′-AGACAACCCGTCACCT-3′和5′-GCATCGTATTATCCCTTT-3′；WRKY40：5′-CTCCCAAGAAACGCAA-3′和5′-GCAACTAACACGGACTGA-3′；WRKY60：5′-TTTTCACCGTCTTGTCT-3′和5′-ATGCTCTATCAATCTCCC-3′[30]；LCD：5′-CAAGCATCAGCCAGCATT-3′和5′-AGGGATTACAGTTCACAGC-3′；ACTIN7：5′-CTCAGCACCTTCCAACAGATGTGGA-3′和5′-CCAAAAAAATGAACCAAGGACCAAA-3′[17]。以2-△Ct比較分析各個(gè)樣品間基因表達(dá)水平的相對(duì)差異，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4H2S含量的測定

H2S含量的測定參照亞甲基藍(lán)法，按Shi[37]等人的描述并進(jìn)行調(diào)整。取1.2.1和1.2.2中擬南芥組織0.2 g，加2 mL磷酸緩沖液(pH6.8，0.2 mol·L-1ASA，0.1 mol·L-1EDTA)，充分研磨，得到樣品勻漿，將樣品勻漿置于放有500 μL 1% Zn(Ac)2小管的小三角瓶中(空白對(duì)照用磷酸緩沖液代替樣品勻漿)，加入1 mL 1 mol·L-1HCl啟動(dòng)反應(yīng)，室溫反應(yīng)30 min，取出小三角瓶中的Zn(Ac)2小管，分別加入200 μL 20 mmol·L-1DPD和200 μL 30 mmol·L-1FeCl3，黑暗反應(yīng)15 min，測定A667吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算H2S含量。

1.5 氣孔開度的測定

取1.2.1中擬南芥WT、lcd、wrky18wrky40wrky60葉片，置于MES表皮條緩沖液中，于光照強(qiáng)度3 000 lx冷光源照射2 h，撕取葉片下表皮，用光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS：CH20BIMF200)觀察氣孔開度并記錄，再將葉片分別移于含30 μmol·L-1ABA、100 μmol·L-1H2S和不含ABA和H2S的葉片表皮條緩沖液中，繼續(xù)光照1 h，再次觀察氣孔開度并記錄，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，采用SPSS Statistics分析軟件進(jìn)行單因素方差分析，P<0.01和P<0.05分別表示差異極顯著和差異顯著。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1ABA對(duì)擬南芥LCD相對(duì)表達(dá)量和內(nèi)源H2S含量的影響

ABA是重要的植物激素，H2S是新興的氣體信號(hào)分子，為研究ABA和H2S之間的關(guān)系，取土壤培養(yǎng)4周的擬南芥WT進(jìn)行外源ABA處理，測定植株LCD表達(dá)量和內(nèi)源H2S含量，探究ABA對(duì)擬南芥幼苗LCD表達(dá)量和內(nèi)源H2S含量的影響。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，外源ABA處理誘導(dǎo)擬南芥WT的LCD表達(dá)量升高4.27倍(圖1:A)。ABA誘導(dǎo)擬南芥WT的LCD表達(dá)量升高，因此對(duì)ABA處理后的WT內(nèi)源H2S含量進(jìn)行檢測，結(jié)果表明內(nèi)源H2S含量升高了22.9%(圖1:B)。

2.2H2S對(duì)擬南芥WRKY18、WRKY40、WRKY60表達(dá)量的影響

擬南芥WRKY18、WRKY40、WRKY60參與ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[30～31]，而ABA調(diào)控LCD表達(dá)量和H2S含量(圖1)，因此對(duì)H2S處理后擬南芥WRKY18、WRKY40、WRKY60表達(dá)量進(jìn)行檢測。生長4周的WT和lcd，以及外源H2S(50 μmol·L-1)處理的WT植株，提取RNA后利用qRT-PCR測定WRKY18、WRKY40、WRKY60的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果如圖2：與野生型WT相比，WRKY18表達(dá)量在lcd中顯著升高，在外源H2S處理的WT中無明顯變化；WRKY40表達(dá)量在lcd中明顯升高，在外源H2S處理的WT中下降；WRKY60表達(dá)量在lcd中明顯下降，在外源H2S處理的WT中顯著升高。

圖1 ABA對(duì)LCD表達(dá)量(A)和內(nèi)源H2S含量(B)的影響 A.外源ABA(100 μmol·L-1)對(duì)擬南芥野生型(WT)LCD表達(dá)量的調(diào)節(jié)；B.外源ABA(100 μmol·L-1)對(duì)擬南芥野生型(WT)內(nèi)源H2S含量的調(diào)節(jié) *P<0.05,**P<0.01,下同。Fig.1 The effect of ABA on the expression level of LCD(A) and the content of endogenous H2S(B) A. Influences of exogenous ABA(100 μmol·L-1) on the expression level of LCD in WT; B. Influences of exogenous ABA(100 μmol·L-1) on the content of endogenous H2S in WT *P<0.05,**P<0.01,the same as below.

圖2 H2S對(duì)WRKY18、WRKY40、WRKY60基因表達(dá)的影響Fig.2 The effect of H2S on gene expression level of WRKY18,WRKY40 and WRKY60

2.3H2S對(duì)ABA調(diào)控?cái)M南芥幼苗根生長和氣孔運(yùn)動(dòng)的影響

H2S和ABA都對(duì)植物的生長有調(diào)節(jié)作用[2～3,18～20]。為研究H2S和ABA在調(diào)節(jié)擬南芥幼苗根生長過程中的相互作用，對(duì)H2S和ABA處理下的WT和lcd幼苗根生長進(jìn)行觀察。

2.3.1H2S對(duì)ABA調(diào)節(jié)幼苗直接生長的影響

擬南芥WT和lcd按1.2.1中直接生長實(shí)驗(yàn)所述進(jìn)行培養(yǎng)，按1.2.2中表1所述進(jìn)行處理，生長14 d后，觀察并測定幼苗的主根長度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，不含ABA的培養(yǎng)基中，H2S產(chǎn)生酶基因LCD表達(dá)下調(diào)的突變體lcd和50 μmol·L-1H2S熏蒸的WT與WT相比，主根生長狀態(tài)有顯著差異，lcd主根長度相對(duì)較短，而50 μmol·L-1H2S熏蒸的WT主根長度明顯較長。在含有ABA的培養(yǎng)基上，隨著ABA濃度升高，幼苗主根生長被逐漸抑制，而lcd與WT相比，其根生長受ABA抑制作用較弱，表現(xiàn)對(duì)ABA相對(duì)脫敏，差異極顯著。

2.3.2H2S對(duì)ABA調(diào)節(jié)幼苗移苗生長的影響

擬南芥WT和lcd按1.2.1中移苗生長實(shí)驗(yàn)所述進(jìn)行培養(yǎng)，按1.2.2中表2所述進(jìn)行處理，豎直生長10 d后，觀察并測定幼苗的主根長度。結(jié)果如圖4所示，移至不含ABA的培養(yǎng)基上的WT和lcd幼苗，lcd主根短于WT；50 μmol·L-1H2S熏蒸的WT主根比WT長。移至含有ABA培養(yǎng)基上的WT和lcd幼苗，隨著ABA濃度升高，幼苗主根生長都被逐漸抑制，但lcd表現(xiàn)對(duì)ABA相對(duì)脫敏的表型，差異極顯著。

2.3.3H2S對(duì)ABA調(diào)節(jié)氣孔運(yùn)動(dòng)的影響

ABA在調(diào)節(jié)植物氣孔運(yùn)動(dòng)的過程中起著至關(guān)重要的作用，可以有效引起氣孔關(guān)閉；H2S同樣促進(jìn)植物氣孔關(guān)閉[15]，因此觀察擬南芥WT和lcd植株氣孔對(duì)ABA的反應(yīng)。

取生長4周的WT和lcd植株的葉片，按方法1.5中所述，觀察ABA對(duì)擬南芥氣孔運(yùn)動(dòng)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示：未經(jīng)ABA處理，WT和lcd的氣孔平均開度約5 μm；30 μmol·L-1ABA處理葉片1 h后，WT和lcd的氣孔開度都有所減小，但lcd的氣孔開度受ABA調(diào)節(jié)作用較弱，與WT相比，表現(xiàn)出對(duì)ABA脫敏。

圖3 H2S和ABA對(duì)幼苗直接生長的影響 A.幼苗生長情況；B.幼苗主根長度統(tǒng)計(jì)Fig.3 The effect of H2S and ABA on seedling growth A. The investigation of seedling growth; B. The measuration of seedling primary roots length

圖4 H2S和ABA對(duì)移苗生長的影響 A.幼苗生長情況；B.幼苗主根長度統(tǒng)計(jì)Fig.4 The effect of H2S and ABA on postgermination growth A. The investigation of seedling growth; B. The measuration of seedling primary roots length

圖5 外源ABA(30 μmol·L-1)對(duì)WT和lcd氣孔運(yùn)動(dòng)的影響Fig.5 The effect of exogenous ABA(30 μmol·L-1) on stomatal movement of WT and lcd

2.4H2S對(duì)wrky18wrky40wrky60幼苗根生長和氣孔運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)

H2S能調(diào)節(jié)擬南芥WRKY18、WRKY40和WRKY60的基因表達(dá)(圖2)，通過觀察H2S對(duì)wrky18wrky40wrky60幼苗根生長和氣孔運(yùn)動(dòng)的影響進(jìn)一步探究H2S與WRKY轉(zhuǎn)錄因子之間的相互聯(lián)系。擬南芥WT和wrky18wrky40wrky60按1.2.1中移苗生長實(shí)驗(yàn)所述進(jìn)行培養(yǎng)，按1.2.2中表2所述進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示：未經(jīng)H2S熏蒸處理的WT和wrky18wrky40wrky60主根生長無顯著差異；20和40 μmol·L-1H2S熏蒸處理促進(jìn)WT和wrky18wrky40wrky60主根生長，40 μmol·L-1H2S對(duì)WT和wrky18wrky40wrky60主根生長的促進(jìn)作用強(qiáng)于20 μmol·L-1H2S的促進(jìn)作用，且40 μmol·L-1H2S處理對(duì)wrky18wrky40wrky60主根生長的促進(jìn)作用強(qiáng)于WT；80 μmol·L-1H2S處理對(duì)wrky18wrky40wrky60主根生長表現(xiàn)出促進(jìn)作用，對(duì)WT主根生長無明顯影響。

取生長4周的WT、wrky18wrky40wrky60植株葉片，按方法1.5所述，觀察H2S對(duì)氣孔運(yùn)動(dòng)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示：未被H2S處理的WT和wrky18wrky40wrky60的氣孔平均開度約5 μm；100 μmol·L-1H2S處理葉片1 h后，WT和wrky18wrky40wrky60的氣孔開度都減小，相對(duì)減小量分別為45%和49.8%，兩者無顯著差異。

圖6 H2S對(duì)WT和wrky18wrky40wrky60幼苗根生長的影響 A.幼苗生長情況；B.幼苗主根長度統(tǒng)計(jì)Fig.6 The effect of H2S on seedling root growth of WT and wrky18wrky40wrky60 A. The investigation of seedling growth; B. The measuration of seedling primary roots length

圖7 外源H2S(100 μmol·L-1)對(duì)WT和wrky18wrky40wrky60氣孔運(yùn)動(dòng)的影響Fig.7 The effect of exogenous H2S(100 μmol·L-1) on stomatal movement of WT and wrky18wrky40wrky60

3 討論

氣體信號(hào)分子H2S參與植物生命活動(dòng)中多個(gè)生理過程，隨著研究的深入已受到越來越多的關(guān)注。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道，H2S可以與ABA信號(hào)通路相互作用共同調(diào)節(jié)植物的一些生理過程[15,21]。近年來關(guān)于WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與ABA信號(hào)通路的多篇研究報(bào)道表明WRKY轉(zhuǎn)錄因子是ABA信號(hào)通路關(guān)鍵調(diào)控因子，參與植物多種生理調(diào)節(jié)過程[32]。

在擬南芥ABAR介導(dǎo)的ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，WRKY18、WRKY40和WRKY60共同調(diào)節(jié)ABI4和ABI5的轉(zhuǎn)錄，WRKY40在這個(gè)過程中發(fā)揮主要調(diào)節(jié)作用，WRKY18增強(qiáng)WRKY40對(duì)ABI4和ABI5的轉(zhuǎn)錄抑制作用，WRKY60對(duì)WRKY18和WRKY40有拮抗作用，ABA抑制WRKY40的轉(zhuǎn)錄，降低其在細(xì)胞核內(nèi)的分布[29,31]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ABA不僅可誘導(dǎo)擬南芥WT的LCD表達(dá)量升高，還促使內(nèi)源H2S含量顯著增加(圖1)，這與Shi[37]等人先前的研究報(bào)道一致；外源H2S處理可抑制WRKY40表達(dá)并且誘導(dǎo)WRKY60升高(圖2)，在內(nèi)源H2S含量下降的突變體lcd中，WRKY18和WRKY40的表達(dá)量升高，WRKY60的表達(dá)量下降，表明H2S對(duì)WRKY18、WRKY40、WRKY60基因表達(dá)有調(diào)節(jié)作用；據(jù)Yan[38]等人報(bào)道，外源ABA處理WT抑制WRKY18、WRKY40表達(dá)，而本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在lcd突變體中，ABA對(duì)WRKY18和WRKY40的抑制作用消失(圖8)，WRKY18和WRKY40表達(dá)量顯著升高，推測外源ABA可能通過誘導(dǎo)內(nèi)源H2S含量升高，然后H2S再調(diào)節(jié)這三個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄水平，而lcd突變體由于H2S缺失而不能傳遞此信號(hào)，進(jìn)一步表明H2S參與ABA對(duì)這三個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。

圖8 外源ABA(100 μmol·L-1)對(duì)lcd中WRKY18、WRKY40、WRKY60基因表達(dá)的影響Fig.8 The effect of exogenous ABA(100 μmol·L-1) on gene expression level of WRKY18,WRKY40,WRKY60 in lcd

ABA和H2S對(duì)植物幼苗根生長有調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)顯示lcd幼苗根生長受ABA抑制作用較弱(圖3～4)，可能因?yàn)橥蛔凅wlcd內(nèi)源H2S缺失，使WRKY18、WRKY40表達(dá)量升高而抑制ABI4和ABI5轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致幼苗根生長表現(xiàn)ABA脫敏的表型。外源H2S和ABA同時(shí)處理WT，幼苗根生長沒有表現(xiàn)出ABA超敏表型(圖3～4)；根據(jù)李[39]等報(bào)道，外源H2S處理可以促進(jìn)植物外植體不定根數(shù)目和長度的增加，本論文對(duì)WT和wrky18wrky40wrky60幼苗進(jìn)行外源H2S處理，wrky18wrky40wrky60的根生長受H2S促進(jìn)作用仍然很明顯(圖6)，wrky18wrky40wrky60沒有因?yàn)閃RKY18、WRKY40、WRKY60缺失引起WRKY18、WRKY40、WRKY60對(duì)ABA信號(hào)的負(fù)調(diào)節(jié)作用消失而導(dǎo)致幼苗生長緩慢，說明植物體內(nèi)存在復(fù)雜ABA信號(hào)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)并保持著動(dòng)態(tài)平衡，同時(shí)也體現(xiàn)了H2S促進(jìn)植物根生長的作用。以上結(jié)果表明，H2S可能通過影響WRKY18、WRKY40、WRKY60轉(zhuǎn)錄表達(dá)參與ABA對(duì)幼苗根生長調(diào)節(jié)，但H2S對(duì)植物根生長的調(diào)節(jié)部分依賴于WRKY，即H2S對(duì)植物根生長的調(diào)節(jié)作用還存在有不依賴于WRKY18/40/60的途徑(圖9)。此外，本實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)低濃度H2S可以促進(jìn)植物根生長，隨著H2S濃度升高，H2S促進(jìn)根生長作用先增強(qiáng)后減弱(圖6)，推測高濃度H2S甚至可能會(huì)抑制植物根生長，這顯現(xiàn)了H2S在生物體內(nèi)的生理和毒理作用，在實(shí)驗(yàn)過程中選擇合適的H2S處理濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有至關(guān)重要的影響。

圖9 H2S、ABA和WRKY18/40/60對(duì)根生長和氣孔運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)模式Fig.9 The regulation model of H2S,ABA and WRKY18/40/60 to root length and stomatal movement

ABA促進(jìn)野生型擬南芥WT的氣孔關(guān)閉，但對(duì)于lcd的氣孔關(guān)閉作用明顯減弱(圖5)，表明H2S參與了ABA對(duì)氣孔運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)；據(jù)Shang[33]等人報(bào)道，在ABA促進(jìn)氣孔關(guān)閉實(shí)驗(yàn)中wrky18wrky40wrky60沒有明顯ABA相關(guān)顯型，即ABA誘導(dǎo)wrky18wrky40wrky60氣孔關(guān)閉，但與野生型WT相比，兩者氣孔開度的相對(duì)減小量無顯著差異，wrky18wrky40wrky60沒有因?yàn)閃RKY18、WRKY40、WRKY60缺失引起的WRKY18、WRKY40、WRKY60對(duì)ABA信號(hào)的負(fù)調(diào)節(jié)作用消失而導(dǎo)致ABA超敏表型；H2S促進(jìn)wrky18wrky40wrky60和WT氣孔關(guān)閉，但兩者間無明顯差異(圖7)，推測H2S調(diào)節(jié)氣孔運(yùn)動(dòng)不依賴WRKY18/40/60的途徑(圖9)，這進(jìn)一步暗示H2S參與ABA對(duì)氣孔運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)不是通過WRKY18，WRKY40和WRKY60實(shí)現(xiàn)的(圖9)。

綜上所述，H2S和ABA兩個(gè)信號(hào)分子在調(diào)節(jié)植物根生長和氣孔運(yùn)動(dòng)等生理過程中，存在復(fù)雜而緊密的作用機(jī)制，可能不只是簡單的上下游關(guān)系，還有待進(jìn)一步的深入研究。

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RelationshipbetweenH2SSignalandWRKYinABARegulatingRootGrowthandStomatalMovement

SUN Li-Min PEI Yan-Xi LIU Zhi-Qiang*

(School of life Science,Shanxi University,Taiyuan 030006)

Gaseous signal molecule hydrogen sulfide(H2S) and plant hormone abscisic acid(ABA) modulate plant seed germination, root growth, stomatal movement, stress responses and other physiological processes, but the understanding of the relation between H2S and ABA signaling is very limited. The transcription factors of WRKY18, WRKY40 and WRKY60 involve in ABA signaling inArabidopsis. We used theArabidopsisthalianawild type(WT),lcd(L-cysteine desulfhydrase enzyme encoding gene konckdown mutant) andwrky18wrky40wrky60 mutant(WRKY18, WRKY40 and WRKY60 encoding gene knockout triple mutants) to study the interactions of H2S, ABA and WRKY transcription factors in regulating seedling root growth and stomatal movement. The expression level ofLCDand the content of endogenous H2S in WT were increased by ABA treatment. The expression level ofWRKY40 was decreased andWRKY60 was increased in WT by exogenous H2S treatment. The expression level ofWRKY18 andWRKY40 were increased, andWRKY60 was decreased in thelcdmutant. Compared with WT, the effect of ABA on seedling root growth and stomatal movement inlcdwas weaker, the promoting effect of H2S on root growth was more stronger inwrky18wrky40wrky60, but there were no obvious difference between WT andwrky18wrky40wrky60 on H2S promoting the stomatal closure.

H2S;ABA;WRKY transcription factors

國家自然科學(xué)青年基金(31300236)；山西省青年科技基金(2014021026-1)；山西省高等學(xué)校科技創(chuàng)新基金( 2013103)

孫麗敏(1991—)，女，碩士研究生，主要從事植物生物工程和植物生理方面的研究工作。

* 通信作者：E-mail:liuzhiqiang@sxu.edu.cn

2015-07-15

Q945

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.01.014