周祥明 劉玉堂 趙憲爭 宋兆偉 王 姝

(天津市農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，天津 300384)

合歡硬枝扦插生根解剖及相關(guān)酶活性變化研究

周祥明 劉玉堂 趙憲爭 宋兆偉 王 姝

(天津市農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，天津 300384)

以合歡1年生硬枝為試材，通過石蠟切片法對合歡插穗不定根發(fā)生進行解剖學研究，同時，利用比色法對扦插后不同時間的材料進行了過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和吲哚乙酸氧化酶(IAAO)測定。結(jié)果表明：合歡屬于誘導型生根，觀察到其不定根原基起源于形成層；在整個生根過程中，處理組和對照組的POD、PPO和IAAO酶活變化趨勢基本一致，但3種酶活均高于對照。

合歡；扦插；不定根；解剖；酶活性

合歡(AlbiziajulibrissinDuraxx.)又稱絨毛樹、馬櫻花等，屬豆科(Leguminosae)合歡屬(Albizia)植物，具極高的觀賞和經(jīng)濟價值，且還具有美好的象征寓意，因而深受喜愛[1～2]。目前，合歡主要通過種子繁殖，既有性繁殖，而有性繁殖存在變異大，不能保持合歡原有優(yōu)良性狀。實踐證明，扦插是林木進行無性繁殖最簡單、經(jīng)濟手段。因此，探索合歡扦插繁殖技術(shù)具有實際意義，可為合歡優(yōu)良基因資源的保存和開發(fā)利用開辟新的途徑，也為其它林木扦插研究奠定基礎(chǔ)。

目前，合歡扦插研究報道僅見朱效增等人[3]研究，而較為全面系統(tǒng)研究合歡扦插生根未見報道。筆者經(jīng)過多年研究發(fā)現(xiàn)，合歡扦插生根屬于極難生根類型。經(jīng)過多年的研究，建立了一套促進合歡扦插生根的技術(shù)體系，并在此基礎(chǔ)上，對扦插生根過程中3種相關(guān)氧化酶(POD、PPO、IAAO)活性進行檢測與分析；同時，進行了不定根發(fā)生和發(fā)育的形態(tài)解剖學研究，初步揭示了合歡扦插的生根機理。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為1年生合歡(A.julibrissin)硬枝，于2014年10月27日采自天津靜海陳官屯試驗地。生根誘促劑為自配試劑。

1.2 材料采集及處理

10月底剪取1年生生長旺盛、無病蟲害的木質(zhì)化枝條做插穗，插穗規(guī)格長度為10～12 cm左右，保留4～5個腋芽，上切口在芽上方1 cm處平切，下切口在芽下方0.5 cm處平切，確保切口光滑，不保留葉片。

將采集剪取好的插穗以20根一捆，用自配生根誘促劑24 h浸泡插穗基部3 cm處，將浸泡后的插穗垂直插入盛有蛭石的營養(yǎng)缽中，深度約為插穗長度的1/2。清水處理作為對照。于10月28日將扦插后的材料置于實驗室內(nèi)，并覆膜以保持濕度。

1.3 研究方法

1.3.1 扦插生根過程中相關(guān)酶活性測定

自扦插當日起至60 d，每隔10 d取樣，進行POD、PPO和IAAO活性測定。其中，POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚比色法；PPO活性測定采用鄰苯二酚比色法；IAAO采用二氯酚比色法。3種酶活測定均參照湯紹虎等編資料[4]。

1.3.2 試驗數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel軟件進行處理分析。

1.3.3 扦插生根的形態(tài)解剖觀察

扦插當日隨機選取5個插穗，剪取插穗形態(tài)學下部1 cm小段，以后每隔10 d取材1次。FAA固定，酒精(95%)-甘油混合液(1∶1)軟化，采用常規(guī)石蠟切片法制片，切片厚度為10 μm，番紅-固綠對染法染色，Nikon顯微鏡觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 扦插生根過程中3種氧化酶活性變化分析

2.1.1 過氧化物酶(POD)活性變化

POD普遍存在于植物體內(nèi)，其可氧化體內(nèi)IAA。據(jù)研究報道，IAA的存在影響著植物不定根的起源和生長，Gaspar等[5]將其作為生根標志之一。本研究發(fā)現(xiàn)，在合歡扦插生根過程中，對照和處理POD活性變化趨勢基本相似，但處理組POD活性高于對照(圖1)。在插后的前20 d，POD活性均上升，即為不定根誘導期，POD活性上升氧化體內(nèi)過多的內(nèi)源IAA，促進誘導根原基；隨后POD活性開始下降(20～40 d)，導致內(nèi)源IAA含量上升，有利于不定根的表達；接著POD活性又開始上升(40～60 d)，即為不定根生長期，POD活性開始升高，促進不定根伸長。

圖1 扦插生根過程中POD活性變化Fig.1 POD activity during adventitious root formation

2.1.2 多酚氧化酶(PPO)活性變化

PPO催化酚類物質(zhì)與IAA復合形成一種“IAA-酚酸復合物”，該復合物是一種生根輔助因子，具有促進不定根形成的活性。

圖2中可知，合歡扦插生根過程中，處理組和對照組PPO活性呈現(xiàn)“升高—降低—升高”的趨勢，但處理組PPO活性高于對照組。處理穗條在扦插后20 d根原基誘導期，PPO活性升高；隨后逐漸下降，此時為不定根伸長生長期。在整個生根過程中，處理組PPO活性均高于對照組。

圖2 扦插生根過程中PPO活性變化Fig.2 PPO activity during adventitious root formation

2.1.3 吲哚乙酸氧化酶(IAAO)活性變化

合歡扦插過程中，處理組和對照組IAAO活性變化趨勢基本一致。在扦插后的10 d內(nèi)，IAAO活性略微下降；在扦插10～20 d內(nèi)，處理組IAAO活性迅速上升，而對照組則上升緩慢。在整個生根過程中，對照組IAAO活性低于處理組(圖3)。

IAA含量變化影響不定根的發(fā)生。在扦插前期，IAAO活性相對較低，有利于不定根原基發(fā)生[6]。在不定根誘導期，IAAO活性上升，降低了內(nèi)源IAA水平，符合低濃度IAA有利于生根的觀點[7]。有研究報道，在不定根表達期，較高濃度的IAA促進不定根生長，IAAO活性表現(xiàn)較低[8]，也有認為在不定根表達期IAAO活性較高，降低體內(nèi)IAA含量，促進不定根伸長[9]。

2.2 合歡扦插生根外部形態(tài)

通過對合歡硬枝扦插過程中形態(tài)學基部觀察發(fā)現(xiàn)，扦插后10 d，處理組與對照組插穗基部無明顯變化(圖4:a)，扦插后30 d觀察，處理組插穗部分在下切口處開始有突起，部分插穗皮孔膨大，且在皮孔處產(chǎn)生白色絮狀物質(zhì)(圖4:b)；對照組下切口處無突起現(xiàn)象，但部分插穗在皮孔處產(chǎn)生白色絮狀物質(zhì)。扦插后40～60 d，處理組插穗出現(xiàn)白色不定根(圖4:c～d)；對照組則無變化，也無生根現(xiàn)象(圖4:e)。

圖3 扦插生根過程中IAAO活性變化Fig.3 IAAO activity during adventitious root formation

圖4 合歡扦插生根過程形態(tài)特征Fig.4 Morphological features of the rooting process of cutting for A.julibrissin

圖5 合歡插穗不定根發(fā)生過程 a.莖段橫切面；b.根原基形成；c.不定根伸出皮孔 Ar.不定根；Co.皮層；Ph.韌皮部；Pi.髓；Rp.根原基；Xy.木質(zhì)部Fig.5 Origin of adventitious roots of cutting for A.julibrissin a.Transverse section of stem；b.Root primordium formation；c.Emergence of adventitious roots from lenticels Ar.Adventitious roots；Co.Cortex；Ph.Phloem；Pi.Pith；Rp.Root primordium；Xy.Xylem

2.3 插穗莖扦插前解剖構(gòu)造

合歡插穗橫切面由外及內(nèi)分別為表皮、皮層、韌皮部、木質(zhì)部、髓。大量切片觀察表明，合歡插穗莖段形態(tài)學基部未存在潛伏根原基(圖5:a)。

2.4 不定根發(fā)生發(fā)育

經(jīng)過處理的合歡插穗在扦插20 d后鏡檢結(jié)果顯示，髓射線正對形成層細胞分裂旺盛，并不斷進行平周和垂周分裂，形成一球形細胞團，這團細胞群就是根原基原始細胞。根原始細胞不斷分裂并突破皮層，最終發(fā)育成不定根(圖5:b～c)。

3 討論

合歡插穗生根與POD、PPO及IAAO 3種酶活性密切相關(guān)。自配生根誘促劑提高了這3種酶活性，且呈現(xiàn)一定規(guī)律。在整個生根期間，處理組與對照組的3種酶活性變化趨勢基本一致，但處理組酶活均高于對照組，說明這3種酶活性的提高促進了合歡插穗生根。POD活性提高一方面是由植物生長調(diào)節(jié)劑刺激，另一方面可能是由于離體原因促使呼吸增加而造成，在合歡生根過程中，POD可能參與了木質(zhì)素的合成，如細胞壁的形成和根的木質(zhì)化需要木質(zhì)素。PPO活性升高，可能導致生根促進因子"IAA-酚酸復合物"相應增多，促進了不定根形成。IAAO活性在插穗不定根誘導和發(fā)生期升高，促使內(nèi)源IAA水平降低，符合低濃度IAA誘導根原基形成觀點[8]。

插穗生根與否是扦插的關(guān)鍵因素[10]。根原基分為潛伏根原基和誘導根原基。潛伏根原基在插穗發(fā)育早期產(chǎn)生，但處于休眠狀態(tài)，一旦插穗離休后在適宜的條件下發(fā)育成不定根；而誘導根原基是在扦插過程中通過誘導而形成的根原基，而在扦插前不存在根原基。通過切片觀察合歡莖段，未發(fā)現(xiàn)潛伏根原基，故合歡插穗不定根屬于誘導根原基。另外，不定根原基只在形成層與髓射線交叉處發(fā)生，而未在形成層、皮層薄壁細胞、韌皮部等其它部位發(fā)生，因此，合歡插穗不定根屬于單位點發(fā)生。

1.周祥明,郝志愚,夏時云,等.根癌農(nóng)桿菌介導合歡轉(zhuǎn)TaNHX2基因體系的優(yōu)化[J].植物研究,2013,33(2):197-201.

2.侯修勝,孟凡鋒,張希明,等.合歡栽培技術(shù)及園林應用[J].山東林業(yè)科技,2005,4:55.

3.朱效增,焦傳禮,謝麗靜,等.合歡硬枝扦插育苗技術(shù)[J].山東林業(yè)科技, 2001(增刊):158.

4.湯紹虎,羅充.植物生理學實驗教程[M].重慶:西南師范大學出版社,2012:126-129,159-160.

5.Gaspar T,Kevers C,Hausman J F,et al.Practical uses of peroxidase activity as a predictive marker of rooting performance of micropropagated shoot[J].Agronomie,1992(12):757-765.

6.Wiesmann Z,Riov J,Epstein E.Comparison of movement and metabolism of indole-3-acetic and indole-3-butyric acid in mung bean cuttings[J].Physiol Plant,1988,74:556-560.

7.宋金耀,何文林,李松波,等.毛白楊嵌合體扦插生根相關(guān)理化特性分析[J].林業(yè)科學,2001,37(5):64-67.

8.Pacheco P,Calderon B X,Vega A.Flavonoids as regulators and markers of root formation by shoots ofEucalyptusglobulusraised invitro[J].Plant Perox Newslett,1995,5:9-12.

9.Nag S,Saha K,Choudhuri M A.Role of auxin and polyamines in adventitious root formation in relation to changes in compounds involved in rooting[J].Plant Growth Regul,2001,20:182-194.

10.姚景瀚,李偉.沙棘微扦插不定根發(fā)生的形態(tài)解剖學研究[J].北京林業(yè)大學學報,2013,35(2):130-133

RootingAnatomyofHardwoodCuttingforAlbiziajulibrissinDuraxx.andActivityChangeofRelatedEnzymesDuringRootingProcess

ZHOU Xiang-Ming LIU Yu-Tang ZHAO Xian-Zheng SONG Zhao-Wei WANG Shu

(Tianjin Research Center of Agricultural Biotechnology,Tianjin 300384)

With one-year hardwood cutting fromAlbiziajulibrissinDuraxx. trees, we studied the anatomical structure during the formation of adventitious roots by paraffin section, and detected the activities of peroxidase(POD), polyphenol oxidase(PPO) and indoleaceticacid oxidase by colorimetry. The adventitious root ofA.julibrissincuttings was derived from a type of induced root primordium, and the primordium of adventitious root originated from the cambium. The enzyme activities of POD, PPO and IAAO showed the same trends in treatment and control during rooting process, but the activities of three enzymes in treatment were higher than those in control.

Albiziajulibrissin；Cutting；adventitious root；anatomy；enzymatic activity

天津市科技支撐計劃(12ZCDZNC04700)

周祥明(1975—)，男，博士，主要從事植物分子育種研究。

2015-08-10

Q949.751.9

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.01.008