高 潔 王元忠 黃衡宇*

(1.云南中醫(yī)學(xué)院中藥材優(yōu)良種苗繁育工程研究中心，昆明 650500； 2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所，昆明 650200)

綠花百合胚性愈傷組織誘導(dǎo)與植株再生研究

高 潔1王元忠2黃衡宇1*

(1.云南中醫(yī)學(xué)院中藥材優(yōu)良種苗繁育工程研究中心，昆明 650500；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所，昆明 650200)

建立綠花百合(LiliumfargesiiFranch.)胚性愈傷組織誘導(dǎo)體系，為保護(hù)和合理利用這一重要植物資源提供高效、穩(wěn)定的再生技術(shù)途徑。以綠花百合鱗片為外植體，通過正交實(shí)驗(yàn)研究不同激素種類及其質(zhì)量濃度對(duì)綠花百合胚性愈傷組織誘導(dǎo)、胚狀體和小鱗莖分化及植株再生的影響。結(jié)果表明：較適宜誘導(dǎo)胚性愈傷組織的培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+2,4-D 0.1 mg·L-1，出愈率達(dá)89.29%，小鱗莖發(fā)生系數(shù)亦達(dá)4.7；胚性愈傷組織增殖及小鱗莖發(fā)生培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg·L-1+2,4-D 0.1 mg·L-1，繁殖倍數(shù)5.0/35 d；根的誘導(dǎo)則在1/2MS+NAA 0.2 mg·L-1的培養(yǎng)基上進(jìn)行，生根率達(dá)100%，幼苗移栽至排水良好的沙土中，保溫保濕培養(yǎng)35 d后，成活率可達(dá)90%以上。本研究為保持綠花百合優(yōu)良品種特性、種苗繁育提供了有效途徑，也為保護(hù)其野生資源，發(fā)展人工栽培和利用胚狀體進(jìn)行無性育種奠定了基礎(chǔ)。

綠花百合；胚性愈傷組織；小鱗莖；組織培養(yǎng)

中國(guó)百合屬(Lilium)植物資源非常豐富，特有種多且分布廣，其中有很多觀賞、食用價(jià)值很高的種類是世界百合雜交育種不可多得的原始材料[1]。百合的傳統(tǒng)繁殖方式主要有珠芽繁殖、小子球繁殖和鱗片繁殖等3種方式，其中通過鱗片繁殖獲得的百合品質(zhì)最佳。組織培養(yǎng)由于繁殖系數(shù)高而成為百合重要的人工繁殖方式之一，通過組織培養(yǎng)快速得到量大質(zhì)佳的種苗是世界百合產(chǎn)業(yè)的一大趨勢(shì)[2]。

綠花百合(LiliumfargesiiFranch.)是我國(guó)特有植物，花綠白色，花瓣上有稠密的紫褐色斑點(diǎn)，氣味芳香，觀賞性強(qiáng)[3]，其科學(xué)研究和開發(fā)利用價(jià)值極高，是百合品種選育的重要資源[4]。本文采用綠花百合鱗莖片為外植體，通過誘導(dǎo)胚性愈傷組織和小鱗莖建立其植株再生體系，以期為綠花百合種質(zhì)資源保存、基因工程及遺傳育種提供有益參考。

1 植物材料

供試材料采自云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院藥用植物研究所昆明小哨藥用植物資源圃，經(jīng)云南中醫(yī)學(xué)院錢子剛教授鑒定為綠花百合(L.fargesiiFranch.)。

2 方法

2.1 外植體的選擇與處理

取健康植株的地下鱗莖作為外植體，用自來水洗去污物，5%洗衣粉溶液(質(zhì)量濃度)漂洗10 min，再用清水反復(fù)沖洗干凈，然后置于超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行消毒滅菌。先用75%乙醇(體積濃度)浸泡10 s，再轉(zhuǎn)入0.1%升汞溶液(質(zhì)量濃度)中浸泡10 min，無菌水沖洗6～8次，每次不低于2 min。在超凈工作臺(tái)中將消毒好的鱗片切成約0.8 cm×0.8 cm方塊接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)出來的胚性愈傷組織切成小塊，接種于愈傷組織增殖及小鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；最后將形成的分化苗移至生根培養(yǎng)基上，以培養(yǎng)出完整的小植株。

2.2 培養(yǎng)基

以MS為基本培養(yǎng)基，蔗糖3%(30 g·L-1)，瓊脂4.5 g·L-1，培養(yǎng)基pH值5.8～6.0。3種植物激素6-BA、NAA和2,4-D的母液質(zhì)量濃度均為0.1 mg·mL-1。培養(yǎng)基121℃滅菌22 min備用。

胚性愈傷組織和小鱗莖的誘導(dǎo)培養(yǎng)基：在MS中添加不同質(zhì)量濃度的6-BA(A)、NAA(B)和2,4-D(C)，采用L9(34)正交試驗(yàn)，考察不同激素組合對(duì)誘導(dǎo)胚性愈傷組織及小鱗莖發(fā)生的影響(表1)。將消毒好的鱗片外植體分別接入不同培養(yǎng)基中，35 d后統(tǒng)計(jì)胚性愈傷組織出愈率和小鱗莖發(fā)生系數(shù)。

增殖培養(yǎng)基：以6-BA和2,4-D為外源激素，采用完全組合實(shí)驗(yàn)，將誘導(dǎo)出的胚性愈傷組織分割成1.0 cm×1.0 cm大小，分別接種于完全組合培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基接種10瓶，每瓶3個(gè)胚性愈傷組織塊，35 d后分別統(tǒng)計(jì)愈傷組織增殖系數(shù)及小鱗莖發(fā)生系數(shù)。

表1綠花百合誘導(dǎo)胚性愈傷組織L9(34)正交設(shè)計(jì)

Table1L9(34)orthogonaldesignforembryoniccallusinductioninL.fargesii

水平Levels因素FactorsA(mg·L-1)B(mg·L-1)C(mg·L-1)10．10．10．0120．50．50．0531．01．00．1

生根培養(yǎng)基：分別采用附加0、0.1、0.2、0.5、1.0 mg·L-1NAA的1/2MS培養(yǎng)基作為促進(jìn)瓶苗生根的培養(yǎng)基。選取生長(zhǎng)健壯且長(zhǎng)勢(shì)基本一致，高3～4 cm的小植株接入生根培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基接種10瓶，每瓶3個(gè)小植株，35 d后統(tǒng)計(jì)生根率。

2.3 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)室溫度控制在(20±1)℃，光照度1 500～2 000 lx，光照時(shí)間12 h·d-1。

2.4 再生苗移栽

當(dāng)再生植株高度達(dá)5～8 cm，且根系生長(zhǎng)良好，苗長(zhǎng)勢(shì)健壯，先在溫室大棚中閉口練苗7 d，開口煉苗2 d，再?gòu)呐囵B(yǎng)瓶中取出苗，用清水洗凈根部的培養(yǎng)基，移栽于蛭石、珍珠巖、細(xì)河沙等成分的混合基質(zhì)中，10 d內(nèi)塑料薄膜覆蓋，確保濕度為70%～90%，溫度20℃左右，35 d后統(tǒng)計(jì)成活率。

2.5 統(tǒng)計(jì)指標(biāo)

愈傷組織誘導(dǎo)率(%)=產(chǎn)生胚性愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)

(1)

小鱗莖發(fā)生率(%)=產(chǎn)生小鱗莖愈傷組織數(shù)/接種胚性愈傷組織總數(shù)

(2)

小鱗莖發(fā)生系數(shù)=產(chǎn)生的小鱗莖總數(shù)/接種外植體總數(shù)

(3)

愈傷組織增殖系數(shù)=愈傷組織分割塊數(shù)/起始接種愈傷組織塊數(shù)

(4)

生根率(%)=產(chǎn)生根的小鱗莖叢苗/接種小鱗莖叢苗總數(shù)

(5)

所得數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS(19.0)軟件處理分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 愈傷組織和小鱗莖的誘導(dǎo)

將消毒好的鱗片外植體接種于正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基中，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3～4。

表2綠花百合初始誘導(dǎo)培養(yǎng)L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

Table2ResultsofcallusinductionforL.fargesiibyL9(34)orthogonaltest

培養(yǎng)基Media激素Hormone(mg·L-1)A(6?BA)B(NAA)C(2，4?D)D(Blank)外植體?Explants愈傷誘導(dǎo)率Rateofcallusinduced(%)小鱗莖發(fā)生系數(shù)Generationcoeff?icientofbulblet10．10．10．01(1)2910．340．6220．10．50．05(2)2835．712．8630．11．00．1(3)2857．143．0440．50．10．05(3)3070．005．0150．50．50．1(1)2789．294．7060．51．00．01(2)2839．293．7971．00．10．1(2)2875．003．2181．00．50．01(3)2630．771．3591．01．00．05(1)3060．003．87

注：*除去污染數(shù)的實(shí)際外植體數(shù)，下同。

Note:*excepting the numbers of pollution,the same as below.

表3綠花百合愈傷組織誘導(dǎo)方差分析結(jié)果

Table3VarianceanalysisofcallusinductioninL.fargesii

方差來源SourceⅢ型平方和Sumofsquare自由度df均方MeansquareF值Fvalue顯著性Sig．A(6?BA)1565．782782．9089．04P<0．05B(NAA)0．2020．100．01P>0．05C(2，4?D)3363．5521681．78191．28P<0．01空白Blank17．5928．79

表4綠花百合小鱗莖發(fā)生系數(shù)方差分析結(jié)果

Table4VarianceanalysisofGenerationcoefficientofbulbletinL.fargesii

方差來源SourceⅢ型平方和Sumofsquare自由度df均方MeansquareF值Fvalue顯著性Sig．A(6?BA)8．6524．32109．65P<0．01B(NAA)0．7520．379．45P>0．05C(2，4?D)7．0223．5189．02P<0．05空白Blank0．0820．39

愈傷組織誘導(dǎo)方差分析(表3)顯示，2,4-D對(duì)愈傷組織有極顯著影響(P<0.01)，6-BA亦有顯著影響(P<0.05)，而NAA則無顯著影響(P>0.05)。由6-BA、2,4-D 3個(gè)水平的Duncan檢驗(yàn)(表5)可知，6-BA和2,4-D 3個(gè)水平間在愈傷組織誘導(dǎo)率上均有顯著性差異(P<0.05)；6-BA水平2(0.5 mg·L-1)與水平1(0.1 mg·L-1)差異極顯著(P<0.01)，2,4-D水平2(0.05 mg·L-1)、3(0.1 mg·L-1)與水平1(0.01 mg·L-1)差異亦極顯著(P<0.01)，說明6-BA和2,4-D不同質(zhì)量濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)影響很大。通過平均值分析可知，綠花百合愈傷組織最佳激素組合為A2C3，即6-BA 0.5 mg·L-1+2,4-D 0.1 mg·L-1。

表56-BA、2,4-D不同水平Duncan檢驗(yàn)

Table5Duncan’stestindifferentlevelsof6-BAand2,4-D

ItemsFactorsLevelsMean0．05level0．01level愈傷組織誘導(dǎo)Callusinduction6?BA2，4?D266．19aA355．26bAB134．4cB373．81aA255．24bA126．8cB小鱗莖發(fā)生Bulbletsgeneration6?BA2，4?D24．50aA32．81bB12．17bB23．91aA33．65aA11．92bB

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(0.05水平)；不同大寫字母表示差異極顯著(0.01水平)，下同。

Note:The different lowercase letters in the same column indicated the significant difference at 0.05;the different uppercase letters in the same column indicated the significant difference at 0.01.The same as below.

小鱗莖發(fā)生系數(shù)方差分析結(jié)果(表4)顯示，6-BA對(duì)小鱗莖發(fā)生有極顯著影響(P<0.01)，2,4-D亦有顯著影響(P<0.05)。Duncan檢驗(yàn)(表5)表明，6-BA和2,4-D無論在0.05或0.01水平，各質(zhì)量濃度反映出的效應(yīng)是相同的。6-BA對(duì)小鱗莖發(fā)生系數(shù)影響最大的是水平2(0.5 mg·L-1)，與水平1(0.1 mg·L-1)、水平3(1.0 mg·L-1)呈極顯著差異(P<0.01)，它的均值顯著地高于其它兩個(gè)水平；2,4-D對(duì)小鱗莖發(fā)生系數(shù)影響最大的是水平2(0.05 mg·L-1)和水平3(0.1 mg·L-1)，它們和水平1(0.01 mg·L-1)均具極顯著差異(P<0.01)。NAA雖無顯著影響(P>0.05)但具協(xié)同作用。通過平均值分析可知，綠花百合愈傷組織最佳激素組合為A2B1C2，即6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+2,4-D 0.05 mg·L-1。

從綜合效應(yīng)來看，本研究重點(diǎn)放在愈傷組織誘導(dǎo)上，故采用A2B2C3，即5號(hào)培養(yǎng)基MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+2,4-D 0.1 mg·L-1作為綠花百合愈傷組織和小鱗莖同步誘導(dǎo)培養(yǎng)基，在此培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d后，鱗莖基部開始膨大，出現(xiàn)芽點(diǎn)(圖1:A)；培養(yǎng)21 d后，鱗片切口產(chǎn)生小鱗莖(圖1:B)；培養(yǎng)30 d后，在小鱗莖周圍出現(xiàn)黃綠色、排列緊密、具有顆粒狀的愈傷組織(圖1:C～D)，表明綠花百合屬于體細(xì)胞胚胎發(fā)生型。實(shí)驗(yàn)中觀察到兩種類型的愈傷組織：黃綠色、細(xì)胞排列緊密、形狀規(guī)則并有顆粒狀突起的愈傷組織(圖1:C～D)；灰白色、排列無序、松散的愈傷組織(圖1:E)。前者具有胚性愈傷組織的基本特點(diǎn)，而后者則為發(fā)育畸形的非胚性愈傷組織。

圖1 愈傷組織和小鱗莖的誘導(dǎo) A.培養(yǎng)7 d后，外植體基部膨大；B.培養(yǎng)21 d后形成的小鱗莖；C～D.黃綠色、細(xì)胞排列緊密、形狀規(guī)則的胚性愈傷組織；E.灰白色、排列無序、松散的非胚性愈傷組織Fig.1 Induction of callus and bulblets A. Explant base enlargement after 7 d culture; B. Bulblets produced after 21 d culture; C-D. Closely-packed shape-rule yellow-green embryonic callus; E. Friable disorderly gray non-embryonic callus

3.2 增殖培養(yǎng)

根據(jù)愈傷組織和小鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)果，選擇6-BA和2,4-D作為外源激素進(jìn)行愈傷組織增殖和小鱗莖發(fā)生培養(yǎng)。將誘導(dǎo)出的胚性愈傷組織(培養(yǎng)35～40 d)切割成適當(dāng)大小(1.0 cm×1.0 cm)，接種于附加6-BA和2,4-D的完全組合培養(yǎng)基中，培養(yǎng)結(jié)果見表6。

表6通過完全組合試驗(yàn)篩選綠花百合增殖培養(yǎng)基的結(jié)果

Table6EffectsofselectingproliferationmediumthroughsinglefactorexperimentdesigninL.fargesii

培養(yǎng)基Media激素Hormone(mg·L-1)6?BA2，4?D接種數(shù)Explants小鱗莖發(fā)生系數(shù)Generationcoefficientofbulblet愈傷組織增殖系數(shù)Regenerationcoefficientofcallus1000210e0f110．50．1271．89±0．65c2．86±1．47bc120．50．2300．96±0．52d2．33±1．25c130．50．5301．32±0．58c1．90±1．16cd141．00．1303．98±1．37a5．00±2．34a151．00．2273．50±1．12a4．42±1．97a161．00．5272．88±1．26b3．28±1．86b171．50．1301．63±0．63c1．73±1．21de181．50．2271．40±0．61cd1．56±1．18de191．50．5301．07±0．36d1．40±1．03e

從表6中可知，在14號(hào)培養(yǎng)基MS+6-BA 1.0 mg·L-1+2,4-D 0.1 mg·L-1和15號(hào)培養(yǎng)基MS+6-BA 1.0 mg·L-1+2,4-D 0.2 mg·L-1中愈傷組織增殖系數(shù)較高，分別達(dá)5.00和4.42；小鱗莖發(fā)生系數(shù)亦較高。但后期在15號(hào)培養(yǎng)基中部分胚性愈傷組織生長(zhǎng)過快而導(dǎo)致分化或失去胚性狀態(tài)，不利于胚性愈傷組織增殖和小鱗莖形成。

將黃綠色、質(zhì)地緊密的愈傷組織轉(zhuǎn)接至MS+6-BA 1.0 mg·L-1+2,4-D 0.1 mg·L-1培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d后，轉(zhuǎn)變?yōu)榈S色、松散并有綠色顆粒物產(chǎn)生的胚性愈傷組織(圖2:A)，綠色顆粒狀小體即為胚性愈傷組織產(chǎn)生的體細(xì)胞胚(圖2:B～C)；培養(yǎng)21 d后，體細(xì)胞胚迅速生長(zhǎng)，形成小鱗莖前體(圖2:D)；27 d后，形成小鱗莖(圖2:E～F)，隨后分化出葉片形成小植株(圖2:G)；培養(yǎng)35 d后，小植株生長(zhǎng)迅速，在其基部又形成胚性愈傷組織，繼而再產(chǎn)生體細(xì)胞胚和小植株(圖2:H)，形成連續(xù)的增殖再生體系。

3.3 生根與移栽

選取生長(zhǎng)健壯且長(zhǎng)勢(shì)基本一致，高3～4 cm的小植株接入附加0、0.1、0.2、0.5、1.0 mg·L-1NAA的1/2MS培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。結(jié)果表明，即使在未加激素的空白培養(yǎng)基中，小植株的生根率亦達(dá)70%以上，其他附加不同質(zhì)量濃度NAA的培養(yǎng)基中生根率均達(dá)90%以上，且根系粗壯多根毛，材料基部基本無愈傷組織；各組間生根率和生長(zhǎng)勢(shì)均無顯著性差異(表7)。其中，1/2MS+NAA 0.2 mg·L-1生根率達(dá)100%，故選用此培養(yǎng)基作為綠花百合瓶苗生根培養(yǎng)基。生根培養(yǎng)35 d后，幼苗移栽成活率達(dá)90%以上。

圖2 胚性愈傷組織的增殖與小鱗莖的形成 A.轉(zhuǎn)接10 d后形成的胚性愈傷組織；B～C.體細(xì)胞胚；D.小鱗莖前體；E～F.小鱗莖；G.分化出葉片的小植株；H.繼代苗基部不斷產(chǎn)生小鱗莖形成的小植株Fig.2 Regeneration of embryonic callus and formation of bulblets A. Embryonic callus formation after 10 d culture; B-C. Somatic embryos; D. Pre-bulblet; E-F. Bulblets; G. Leaves differentiated plantlet; H. Plantlet from bulblets of the base of subculture seedlings

培養(yǎng)基MediumNAA(mg·L-1)接種數(shù)?No．ofinoculations生根率Rootingrate(%)根系狀況Rootingcondition20(CK)03076．67b根長(zhǎng)細(xì)，根毛少，基部偶有少量愈傷Rootslong，slender，lesshairs；thebasehasasmallamountcallus210．12796．29a根長(zhǎng)且較壯，多根毛，基部無愈傷Rootslongandlessstrong，multi-hairs；thebasehasnocallus220．230100．00a根長(zhǎng)且較壯，多根毛，基部無愈傷Rootslongandlessstrong，multi-hairs；thebasehasnocallus230．53093．33a根長(zhǎng)且壯，多根毛，基部無愈傷Rootslongandstrong，multi-hairs；thebasehasnocallus241．02792．59a根長(zhǎng)且壯，多根毛，基部無愈傷Rootslongandstrong，multi-hairs；thebasehasnocallus

4 討論

影響胚性愈傷組織發(fā)生的因素很多，例如光照、基因型、外植體種類、滲透壓、氮源、碳源、激素和天然附加物等[5]。對(duì)綠花百合來說，激素配比在其胚性愈傷組織增殖和形成體細(xì)胞胚上尤為重要，由體細(xì)胞胚形成小鱗莖的一個(gè)重要特征是能夠反復(fù)進(jìn)行次生胚發(fā)生，利用小鱗莖這一特性不僅可以進(jìn)行快速繁殖，而且還能進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。與百合屬其他一些種不同[6]，綠花百合小鱗莖的發(fā)生要早于愈傷組織發(fā)生，在小鱗莖發(fā)生后愈傷組織才從小鱗莖四周的破裂口處形成，之后愈傷組織不斷變大增多，表明綠花百合屬于體細(xì)胞胚發(fā)生類型。

在啟動(dòng)培養(yǎng)中，小鱗莖的誘導(dǎo)主要受6-BA質(zhì)量濃度的影響，在一定范圍內(nèi)(0.1～0.5 mg·L-1)，小鱗莖發(fā)生率隨6-BA質(zhì)量濃度的增加而增高，當(dāng)高于1.0 mg·L-1時(shí)，對(duì)小鱗莖的發(fā)生有抑制作用。較適合的6-BA質(zhì)量濃度為0.5 mg·L-1；而2,4-D對(duì)體細(xì)胞胚發(fā)生具有雙重效應(yīng)：低濃度時(shí)，能促進(jìn)鱗片外植體產(chǎn)生胚性愈傷組織；濃度稍高卻又抑制胚性愈傷組織產(chǎn)生體細(xì)胞胚。除百合[7]外，在對(duì)臭崧[8]、匍匐剪股穎[9]和中華結(jié)縷草[10]等植物愈傷組織的研究中，也都證實(shí)了2,4-D的雙重效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，綠花百合較適宜誘導(dǎo)胚性愈傷組織的培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+2,4-D 0.1 mg·L-1；胚性愈傷組織增殖及小鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg·L-1+2,4-D 0.1 mg·L-1。此外，綠花百合組培苗生根與移栽均較容易，可能與其為胚性起源有關(guān)。

以快速繁殖為目的的百合組織培養(yǎng)形成再生植株的途徑可分愈傷組織途徑[11]、不定芽途徑[12]、小鱗莖途徑[13]和體細(xì)胞胚途徑[14]。在以育種為目標(biāo)的再生體系中，胚性愈傷組織是基因轉(zhuǎn)化的良好受體材料，有利于外源基因整合到植物基因組中，誘導(dǎo)愈傷組織并較長(zhǎng)時(shí)期維持其胚性狀態(tài)對(duì)其基因轉(zhuǎn)化有重要意義[15]。本研究通過實(shí)驗(yàn)表明以綠花百合鱗莖片為外植體，可以誘導(dǎo)愈傷組織并長(zhǎng)期維持其胚性狀態(tài)，進(jìn)而可以在短時(shí)間內(nèi)大量誘導(dǎo)小鱗莖，并能順利形成完整植株，借此建立的植株再生體系可以為綠花百合種質(zhì)資源保存、基因工程以及遺傳育種提供有益參考。

1.龍雅宜,張金政.百合屬植物資源的保護(hù)與利用[J].植物資源與環(huán)境,1998,7(1):40-44.

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EmbryonicCallusInductionandPlantRegenerationofLiliumfargesii

GAO Jie1WANG Yuan-Zhong2HUANG Heng-Yu1*

(1.Engineering Research Center for Reproducing Fine Varieties of Chinese Medicinal Plants Yunnan University of Chinese Traditional Medicine,Kunming 650500；2.Institute of Medicinal Plants,Yunnan Academy of Agricultural Sciences,Kunming 650200)

In order to rationally protect and utilize the important wild traditional Chinese medicine resources, we built an efficient and instability regeneration system ofLiliumfargesiiFranch. by embryonic callus induction. With the scales as explants, by an orthogonal experiment, we studied the effect of different kinds and contents of plant hormone on embryonic callus induction and plantlet regeneration, and established a propagation system by tissue culture. The optimal medium for inducing embryonic callus was MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+2,4-D 0.1 mg·L-1, the callus induction rate was 89.29%, and the generation coefficient of bulblet was 4.7. The optimal medium for regeneration of embryonic callus and inducing the bulblets was MS+6-BA 1.0 mg·L-1+2,4-D 0.1 mg·L-1, and its regeneration rate was 5.0/35d. The optimal rooting medium was 1/2MS+NAA 0.2 mg·L-1, and the rooting rate was 100%. There were 90% of plantlet surviving after transplanting rooted plantlets into sand when cultured in constant temperature and humidity condition for 35 d. Our study could provide a basis on protecting the improved trait of wild resources ofL.fargesii, and lay the foundation for expanding the artificial cultivation and embryoid asexual breeding.

LiliumfargesiiFranch;embryonic callus;bulblet;tissue culture

國(guó)家自然科學(xué)基金(31260077)和湖南省高?？萍紕?chuàng)新平臺(tái)項(xiàng)目(11K053)聯(lián)合資助

高潔(1982—)，女，碩士，講師，主要從事中藥學(xué)研究。

* 通信作者：E-mail:hhyhhy96@163.com

2015-04-17

Q949.762.6

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.01.007