李墨野 王 娜 周 宇 普瀟瑩 馮萬舉 李開隆

(東北林業(yè)大學林木遺傳育種國家重點實驗室，哈爾濱 150040)

干旱脅迫條件下轉(zhuǎn)LbDREB基因大青楊瞬時基因表達及生長、生理指標變異分析

李墨野 王 娜 周 宇 普瀟瑩 馮萬舉 李開隆*

(東北林業(yè)大學林木遺傳育種國家重點實驗室，哈爾濱 150040)

利用轉(zhuǎn)基因技術培育楊樹抗逆品種是林木分子育種的重要手段之一。本研究以3個轉(zhuǎn)LbDREB基因株系大青楊及野生型WT為材料，利用PEG6000模擬干旱脅迫處理，調(diào)查脅迫條件下不同株系生長、瞬時LbDREB基因表達量和生化指標的變化。結(jié)果表明：隨著PEG脅迫時間的增加，轉(zhuǎn)基因大青楊較WT的生物量向根部分配更多；LbDREB基因表達量與SOD，POD變化趨勢相近，呈現(xiàn)先上升后下降再上升的趨勢;轉(zhuǎn)基因株系較WT保護酶活性更強，脯氨酸含量積累增多，MDA積累降低，WT相對電導率比各轉(zhuǎn)基因株系高；結(jié)果表明各轉(zhuǎn)LbDREB基因株系的抗旱能力均優(yōu)于WT，且LbDREB基因上調(diào)表達可能是調(diào)控植物抗旱能力的重要因素。轉(zhuǎn)基因株系Dr2在干旱脅迫下各抗旱指標均表現(xiàn)優(yōu)秀，可以初步篩選為大青楊抗旱優(yōu)良無性系。

大青楊；LbDREB基因；旱脅迫；瞬時表達

DREB(dehydration responsive element binding protein)轉(zhuǎn)錄因子是一個干旱應答元件的結(jié)合蛋白，它在植物對干旱、高鹽及低溫脅迫的反應中起重要的調(diào)控作用[1]。已證明DREB轉(zhuǎn)錄因子具有能夠特異性結(jié)合DREE/CRT順式作用元件的特點，在受到干旱、高鹽和低溫等非生物脅迫時能夠有效調(diào)控基因表達，從而提高植物抗逆性[2]。逆境條件下，過表達轉(zhuǎn)DREB基因植株，脯氨酸含量、可溶性糖明顯高于對照，說明過表達的DREB類轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)控下游基因，并且與游離脯氨酸、可溶性糖等功能蛋白基因的合成有關，進而提高轉(zhuǎn)基因株系的抗逆能力[2]。2009年楊春霞[3]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)DREB基因南林楊895在干旱、高鹽方面有明顯的抗性。2012年Zhou[4]通過對轉(zhuǎn)PeDREB2a基因楊樹的研究發(fā)現(xiàn)，PeDREB2a基因改變各種生理和生化過程，在干旱和鹽耐受性中起重要作用。

大青楊(PopulusussuriensisKom.)是楊柳科(Salicaceae)楊屬(PopulusL.)植物，在我國東北三省和內(nèi)蒙古東部地區(qū)廣泛分布，其生長快、干形通直、抗瘠薄、抗寒，是東北林區(qū)山地主要的更新樹種之一[5]。本實驗室利用農(nóng)桿菌介導法將LbDREB基因轉(zhuǎn)入大青楊中，獲得了17株轉(zhuǎn)基因株系。本研究以3個轉(zhuǎn)DREB基因大青楊株系為材料，對其干旱脅迫下的生長量、保護酶系統(tǒng)、丙二醛含量、脯氨酸含量及相對電導率進行測定分析，探討干旱脅迫下不同株系間生長、生理及基因表達差異，為大青楊分子遺傳改良提供依據(jù)，為選擇耐旱速生優(yōu)質(zhì)大青楊無性系奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料包括3個上調(diào)表達的轉(zhuǎn)LbDREB基因大青楊株系(Dr2、Dr8、Dr22)和一個野生型WT(非轉(zhuǎn)基因株系)，于2015年4月20日，在東北林業(yè)大學塑料大棚(平均溫度32℃，相對濕度60%)進行營養(yǎng)杯扦插育苗，每個株系扦插250株，50天后每個株系選擇生長正常的60株(每個處理12株)進行干旱脅迫試驗。

1.2 試驗設計

干旱脅迫采用5%(V/V)濃度的聚乙二醇(PEG-6000)溶液進行處理[6]；分別在0、12、24、48和96 h取樣，取樣時間為每天早晨7:00(12 h為19:00)，每個單株選取第3～5輪葉片；將采下的葉片放入液氮中待用。

1.3 測定方法

1.3.1 LbDREB基因熒光定量PCR

利用BioTeke試劑中離心過柱法提取總RNA。經(jīng)超微量分光光度計測定RNA濃度，以TUB基因為內(nèi)參[7]，F(xiàn)orward primer：(5′-CGCCTAAACCCACCAAGCTA-3′)；Reverse primer：(5′-CGAAGGTTCCAAGCCAAAGC-3′)，引物由中美泰和生物公司合成，采用ABI PRISM 7500熒光定量PCR儀進行定量測定。利用2-ΔΔCT法[8]測定相對基因表達量[9]。

1.3.2 保護酶活性、丙二醛及脯氨酸含量

超氧化物歧化酶(SOD，Superoxide Dismutase)活性、過氧化物酶(POD，Peroxidase)活性、丙二醛(MDA，Malondialdehyde)含量、脯氨酸(Pro，Proline)含量利用蘇州科銘生物技術公司的試劑盒中粗酶液、含量提取后吸光度的不同來測定。

1.3.3 相對電導率

參照章文華[10]的方法測定不同株系的電導率。

1.3.4 生物量

在脅迫處理96 h后，對參試各株系，每個株系各選5株，將根用蒸餾水清洗并用吸水紙吸干，裝入牛皮紙袋中，放置于105℃的電熱鼓風干燥箱中殺青15 min，75℃烘干至恒重，對地上部分和地下部分干重進行測定。

根冠比=地下部分干重/地上部分干重[11]

(1)

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)利用EXCEL軟件和SPSS軟件進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對大青楊各株系葉子形態(tài)的影響

脅迫前后對轉(zhuǎn)基因株系及WT葉片形態(tài)進行觀察(圖1)，未脅迫時(0 h)轉(zhuǎn)基因株系和WT葉片形態(tài)正常，沒有明顯差異，隨著脅迫時間增加，各株系癥狀變化明顯，由葉脈間開始顏色逐漸變黃，且面積逐漸擴大，葉子形態(tài)也隨脅迫時間的延長而逐漸變黃和卷曲。轉(zhuǎn)基因株系較WT變化慢，在96 h時WT組已經(jīng)完全變枯黃，而轉(zhuǎn)基因株系如株系Dr2只是在葉緣稍干枯。

2.2 干旱脅迫對大青楊各株系生物量的影響

T檢驗結(jié)果表明各株系間脅迫前后根冠比差異未達顯著水平，各轉(zhuǎn)基因株系干旱脅迫處理的根冠比小于(株系Dr2和Dr8)或等于(株系Dr22)未脅迫處理的根冠比，而WT脅迫后根冠比小于脅迫前，這表明轉(zhuǎn)基因株系向根部轉(zhuǎn)移更多生物量，從而使根系變得更發(fā)達。

圖1 干旱脅迫大青楊0、12、24、48和96 h葉片形態(tài)和顏色 1～4行分別為株系WT、Dr8、Dr22和Dr2。Fig.1 Drought stress P.ussuriensis Kom. 0,12,24,48 and 96 h leaf shape and color (1-4 lines) were WT,Dr8,Dr22 and Dr2.

Table1TheinfluenceofdroughtonbiomassandrootshootratioofP.ussuriensisKom.

株系號Lines脅迫方式Treatment干重Dryweight(g)地上部分Aboveground地下部分Underground根冠比Root?topratio差值ChangeWT干旱脅迫Droughtstress3．061．130．39未脅迫Nostress5．492．640．49-0．1Dr8干旱脅迫Droughtstress2．570．820．32未脅迫Nostress5．691．70．30．02Dr22干旱脅迫Droughtstress4．741．130．24未脅迫Nostress5．11．120．240Dr2干旱脅迫Droughtstress2．810．890．32未脅迫Nostress4．31．280．30．02

2.3干旱脅迫下外源LbDREB在不同株系中基因相對表達量

在干旱脅迫期間內(nèi)，所有株系相對基因表達都呈先上升，后下降再上升的趨勢(圖2)，其中在12～24 h達到了大青楊基因相對表達量的峰值，在48 h時達到谷值，而在96 h時再次上升；轉(zhuǎn)基因株系隨著干旱時間的延長，LbDREB基因表達并比WT表達更為強烈。其中株系Dr2升高波動最明顯，WT在脅迫期間相對變化波動比較穩(wěn)定。

2.4 干旱脅迫下大青楊葉片保護酶活性的影響

干旱脅迫下SOD的變化趨勢(圖3)與基因表達量的變化趨勢大致相同，在24 h時基因表達量和SOD活性都達到峰值，其中在0～96 h時，轉(zhuǎn)基因株系SOD活性都顯著高于WT。POD活性與SOD活性趨勢相同(圖4)，但并非所有轉(zhuǎn)基因株系在不同時間POD活性均高于WT，保護酶活性(SOD、POD)轉(zhuǎn)基因株系較WT高很多。

2.5干旱脅迫對轉(zhuǎn)不同大青楊株系MDA含量的影響

干旱脅迫下，MDA含量均呈增長趨勢(圖5)，在96 h時達到相對的峰值，其中株系Dr2、Dr8、Dr22分別增加了1.24，1.17，1.39倍；而WT增加了1.54倍。

2.6 干旱脅迫對轉(zhuǎn)基因大青楊脯氨酸含量的影響

在0～24 h時，脯氨酸含量不穩(wěn)定，但基本呈現(xiàn)上升趨勢；在24 h后，轉(zhuǎn)基因株系脯氨酸含量明顯升高，而WT脯氨酸含量卻變化較慢(圖6)。96 h時株系Dr2、Dr8、Dr22的脯氨酸含量達最大值，并且均比WT高(株系Dr8、Dr22和Dr2脯氨酸含量分別是WT的6.9、11.4和6.6倍)。

圖2 干旱脅迫條件下大青楊4個株系基因相對表達量隨處理時間的變化Fig.2 Under drought stress P.ussuriensis Kom. four lines with relative gene expression change amount of processing time

圖3 干旱脅迫下SOD活性隨時間的變化趨勢 同一脅迫處理時間不同字母代表差異顯著(P<0.05)，下同。Fig.3 SOD activity under drought stress trends over time Different letters represent the same stress treatment time significantly different(P<0.05),the same as below.

圖4 干旱脅迫下POD活性隨時間的變化趨勢Fig.4 POD activity under drought stress trends over time

圖5 干旱脅迫處理對MDA的含量隨時間的變化趨勢Fig.5 Drought stress on the content of MDA trends over time

圖6 干旱脅迫處理對脯氨酸的含量隨時間的變化趨勢Fig.6 Drought stress on Pro content trends over time

2.7 干旱脅迫對轉(zhuǎn)基因大青楊相對電導率的影響

脅迫前，各株系的相對電導率無顯著差異(表2)，隨著脅迫時間的延長，各株系的相對電導率均持續(xù)上升，說明植物細胞膜受到了損害，在12 h時株系Dr2與其它株系差異顯著，在24 h時株系Dr8和Dr2與其它株系差異顯著，在48 h后轉(zhuǎn)基因株系與野生型WT差異明顯，分析96 h時各株系的增幅發(fā)現(xiàn)，WT增幅最大(39.33%)，而轉(zhuǎn)基因株系Dr2最小為(22.36%)。

表2干旱脅迫對大青楊轉(zhuǎn)基因株系及野生型相對電導率的平均值

Table2MeanoftherelativeelectricalconductivityintransgenicP.ussuriensisKom.andnon-transgenicP.ussuriensisKom.underdroughtstress

處理時間Treatmenttime(h)株系LinesWTDr8Dr22Dr2016．45±1．06ab15．66±0．79b17．63±0．71a16．10±0．74ab1218．57±0．68a17．56±0．62ab18．54±0．81a17．05±0．59b2420．19±0．58a18．31±0．95b19．04±0．68ab18．47±0．76b4822．64±0．80a19．23±0．72b18．81±0．59b18．23±0．77b9625．92±0．77a21．15±0．68b22．22±0．52b19．70±0．54c增幅Increase(%)139．33135．05126．06122．36

3 討論

干旱脅迫下植物主要表現(xiàn)為生長弱化、葉面積、比葉面積(單位重量的葉面積)、葉片數(shù)量和生物產(chǎn)量都顯著降低[12]。干旱脅迫后葉片的形態(tài)癥狀反應發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因株系葉片比野生型變化小，其中株系Dr2從葉子形態(tài)上比較，抗旱性強。在干旱脅迫期間，植物生物量向根部的分配增加。但不同耐性品系的植物在干旱脅迫下的反應也不同，抗旱的楊樹無性系有更多的干物質(zhì)優(yōu)先向根和莖分配[12]。另外，干旱脅迫也會提高根冠比。根冠比越高，根系越發(fā)達，吸水能力更強，植株越抗旱[7]。本研究中株系Dr2、Dr8、Dr22脅迫后的根系不低于未脅迫的株系，表明轉(zhuǎn)基因株系比野生型抗旱性更好。

當植物受到非生物脅迫，如低溫、干旱、鹽堿等，細胞膜被損壞，膜透性變大，電解質(zhì)外滲，電導率增大。研究者們通過判斷電導率的大小，來判斷植物細胞膜的損壞程度，從而判斷植物的抗逆能力[11]。干旱脅迫處理期間轉(zhuǎn)基因株系和WT的相對電導率都不斷增大[20]，在96 h時各株系的增幅(表2)發(fā)現(xiàn)相對電導率增幅野生型均大于轉(zhuǎn)基因株系；說明轉(zhuǎn)基因株系抗旱能力強。

研究發(fā)現(xiàn)，各指標中轉(zhuǎn)基因各株系表現(xiàn)出的抗旱水平與基因相對表達量較一致?？偟膩碚f，干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因各株系在生長和生理指標上較WT具有明顯優(yōu)勢，且LbDREB基因瞬時表達顯著升高，推測LbDREB基因在植物抗旱上起到了關鍵作用；株系Dr2各指標均體現(xiàn)較強的優(yōu)勢，可以作為優(yōu)良樹種進行重點考慮。

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The National Science & Technology Pillar Program of China(2012BAD21B02)

introduction：LI Mo-Ye(1990—),male,graduate,major in forestry genetic and improvement.

date:2015-11-25

VariationAnalysisofTransientGeneExpressionandGrowth,PhysiologicalIndicatorsunderDroughtStressinExpressedLbDREBPopulusussuriensisKom.

LI Mo-Ye WANG Na ZHOU Yu PU Xiao-Ying FENG Wan-Ju LI Kai-Long*

(State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding,Northeast Forestry University,Harbin 150040)

We used transgenic technology to cultivate stress-resistant varieties ofPopulusussuriensisKom, which was one of the most significant means of molecular breeding.With three expressedLbDREBlines and one wild type(WT), under the condition of PEG6000, which simulated the treatment of the drought stress, we investigated the growth of different lines, and the relative expression levels ofLbDREBand biochemical indicators.With the increase of PEG stress time, the root phytomass of expressedLbDREBline was more than wild type.Meanwhile, the variational trends of SOD and POD were similar to theLbDREBexpression level, which presented the upward trend, the downward trend and eventually beingrising.Additionally, transgenic lines contained stronger protective enzymes activity and proline content than wild type.However, the MDA accumulation and relative conductivity of transgenic lines were less than wild type.The drought tolerance ability of transgenic lines was superior to wild type, furthermore, the up-regulated expression ofLbDREBprobably played an important role in drought resistant in plant.The transgenic line named Dr2 was perfect in the different index of drought resistant, which could be preliminary screened as the excellent drought resistant clones ofP.ussuriensisKom.

PopulusussuriensisKom.;LbDREBgene;drought stress;transient expression

“十二五”國家科技計劃課題(2012BAD21B02)

李墨野(1990—)，男，碩士研究生，主要從事林木遺傳改良方面的研究。

* 通信作者：E-mail:likailongnefu@sohu.com

2015-11-25

* Corresponding author：E-mail:likailongnefu@sohu.com

S792.113

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.03.014