祁石剛,田 暢,卻 楓,徐志勝,王 楓,熊愛生*

(1.江蘇省宿遷市土壤肥料技術(shù)指導(dǎo)站,江蘇 宿遷 223800;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院 作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室,江蘇 南京 210095)

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蔬菜連作改為藍莓種植后土壤細菌群落多樣性變化的分析

祁石剛1,田 暢2,卻 楓2,徐志勝2,王 楓2,熊愛生2*

(1.江蘇省宿遷市土壤肥料技術(shù)指導(dǎo)站,江蘇 宿遷 223800;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院 作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室,江蘇 南京 210095)

基于第二代Illumina Miseq高通量測序平臺,利用16S rDNA技術(shù)分析了江蘇省宿遷市蔬菜連作改為藍莓種植后土壤細菌多樣性的分布和細菌群落多樣性的變化。結(jié)果表明: Kaistobacter、假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)、硫桿狀菌屬(Thiobacillus)、Rubritalea、浮霉菌屬(Planctomyces)、Lysobacter、纖維弧菌屬(Cellvibrio)、噬氫菌屬(Hydrogenophaga)、鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)和熱單胞菌屬(Thermomonas)為蔬菜連作改為藍莓種植后土壤細菌的主要類群;Sporosarcina、Alicyclobacillus、氨氧化古細菌(Candidatusnitrososphaera)和Pontibacter是蔬菜連作土壤細菌的主要類群；蔬菜連作改為種植藍莓后,土壤細菌多樣性和豐度降低,優(yōu)勢菌群也出現(xiàn)了顯著的變化。

高通量測序;細菌多樣性;土壤;蔬菜連作;藍莓

隨著經(jīng)濟的發(fā)展和人們生活水平的逐步提高,蔬菜消費量的增加及蔬菜生產(chǎn)的高效益促使蔬菜產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展。但農(nóng)民為了獲得最大的經(jīng)濟效益,在同一塊土地上連續(xù)種植同一種蔬菜作物,加速了種植田塊土壤環(huán)境惡化。蔬菜作物病蟲害嚴(yán)重,作物長勢變?nèi)?、品質(zhì)下降等一系列連作障礙現(xiàn)象,已成為目前亟待解決的問題[1]。研究證實,這些連作障礙現(xiàn)象都不同程度地與土壤中的微生物相關(guān),并且與蔬菜種類及連作年限有關(guān)[2]。土壤是一種重要的維持地球生態(tài)系統(tǒng)的自然資源,為植物生長發(fā)育提供必需的養(yǎng)分及作為廢物分解的生物介質(zhì)。作為植物生長的媒介,土壤環(huán)境在很大程度上影響著作物健康及生產(chǎn)能力[3]。土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的一個重要組成部分,在促進作物生長、改良土壤構(gòu)成、改善養(yǎng)分循環(huán)等方面起積極的作用。土壤微生物和所栽種的作物間是會相互影響的。植物的根系分泌物反過來也會影響土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)。有關(guān)研究結(jié)果表明,作物連作土壤中的微生物群落結(jié)構(gòu)會發(fā)生變化,這種變化可能是發(fā)生連作障礙的一個重要因素[4]。有報道稱,連續(xù)多年種植蔬菜的土地會出現(xiàn)土壤酸化、微生物群落結(jié)構(gòu)失衡等現(xiàn)象[5]。

藍莓(Blueberry)屬杜鵑花科越橘屬植物,喜酸性土壤,營養(yǎng)成分高,抗氧化能力列果品、蔬菜前列[6]。藍莓在我國具有很大的發(fā)展空間,鮮食藍莓市場占有率呈持續(xù)增長的趨勢,國內(nèi)消費需求潛力大[7-8]。由蔬菜連作改為藍莓種植后,作物種類、耕作方式、施肥類型及養(yǎng)分利用等多方面的變化會對土壤質(zhì)量演變產(chǎn)生較大的影響,除此之外藍莓根際微生物群落結(jié)構(gòu)和蔬菜的根際微生物群落結(jié)構(gòu)也有較大差異。在連續(xù)多年種植蔬菜的基礎(chǔ)上改種藍莓可能可以達到改良土壤、減弱連作障礙的效果。許多作物在連作后都會出現(xiàn)很多問題,如黃瓜設(shè)施栽培后會由于其自毒作用而使黃瓜的產(chǎn)量和質(zhì)量都下降[9];茄子在連作后會出現(xiàn)病蟲害連年加重,抗逆性降低的情況;西瓜的連作障礙尤其嚴(yán)重[10]。關(guān)于引起連作障礙的原因的報道很多,主要從植物化感物質(zhì)的分泌、土傳病原菌的積聚、土壤微生物的變化及土壤理化性質(zhì)等方面進行了研究[11-12]。雷娟利等[13]研究了不同蔬菜連作后土壤中細菌DNA分子水平的多態(tài)性,他們認(rèn)為蔬菜連作會對土壤中細菌的群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。孟德龍等[14 ]的研究表明長期種植蔬菜土地的硝化勢會增強且氨氧化細菌的組成越來越單一。吳鳳芝等[15]從理化性狀方面研究了連作年限對土壤理化性狀的影響,得出隨著連作時間的增長,土壤中的主要營養(yǎng)成分會增加,物理結(jié)構(gòu)性能會有所改善但化學(xué)性狀會變劣。此外，張國林[16]研究了水田改為蔬菜種植地后土壤特性的變化和這種變化所帶來的環(huán)境效應(yīng)。迄今關(guān)于連作障礙的研究大多集中于土壤理化性質(zhì)方面,從土壤細菌群落結(jié)構(gòu)變化方面進行研究的報道不多。關(guān)于蔬菜連作多年后改種藍莓的土壤中細菌多樣性分析則未見報道。筆者應(yīng)用高通量測序技術(shù)進行土壤細菌測序,研究了蔬菜連作改為藍莓種植后土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及豐度分布的變化,以期為土壤耕作制度的調(diào)整提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1樣品采集時間及地點

土壤樣品采集于2014年4月10日進行,地點均位于江蘇省宿遷市宿豫區(qū)。土壤樣品分為：連續(xù)種植蔬菜4年,2014年改為種植藍莓的土壤,編號為A,其土壤類型為砂漿黑土,經(jīng)緯度為33°58′19"、118°24′36";連續(xù)種植蔬菜5年的土壤,編號為B，其土壤類型為砂土,經(jīng)緯度為33°58′35″、118°21′39″。

1.2樣品采集方法

分別對宿遷市宿豫區(qū)兩個樣品整塊田地取樣,采用5點取樣法。用土壤采樣器取土壤表層0～15 cm的表土,將5個采樣點的土壤樣品混合均勻,除去蚯蚓等土壤動物，石塊、根系等雜物后過2 mm篩,裝入已滅菌的封口聚乙烯袋,在-70 ℃下保存,1周內(nèi)提取土壤微生物總DNA。

1.3土壤總DNA的提取

采用MoBio PowerSoil?DNA Isolation Kit試劑盒(美國MoBio公司產(chǎn)品)，根據(jù)說明書中的步驟提取土壤樣品中微生物的總DNA。

1.4測序與數(shù)據(jù)分析

委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司對土壤樣品微生物總DNA進行測序?；贗llumina Miseq平臺,利用Paired-End(雙末端測序)的方法,采用16S rDNA的高變區(qū)(V4區(qū))測序技術(shù),對檢測得到的數(shù)據(jù)與已有的16S rDNA數(shù)據(jù)庫進行比對分析。

2　結(jié)果與分析

2.1土壤微生物總DNA的提取結(jié)果

按照PowerSoil總DNA提取試劑盒說明書,分別對樣品A(蔬菜連作改為藍莓種植土壤)和樣品B(蔬菜連作土壤)進行微生物總DNA提取。分別取每個樣品微生物總DNA進行瓊脂糖(濃度1%)凝膠電泳,結(jié)果如圖1所示。從圖1中可以看出，土壤樣品微生物總DNA提取結(jié)果良好,條帶清晰,無拖尾、雜帶。

A:蔬菜連作改為藍莓種植土壤; B:蔬菜連作土壤。下同。

2.2OTU維恩圖分析結(jié)果

利用Uparse(Edgar, R C, 2013)軟件對測序得到的序列進行聚類分析,根據(jù)97%的相似性將序列聚類成為OTU(Operational Taxonomic Unit)(圖2)。應(yīng)用維恩圖可以直觀地比較2個土壤樣品之間OTU數(shù)目的組成相似程度及差異。操作分類單元OTU表示1組來源于某一個相同分類單元的序列。如圖2所示,土壤樣品A和樣品B的細菌OTU總數(shù)目為1980個,其中共有細菌OTU數(shù)目為911個,占2個樣品OTU總數(shù)的46%。土壤樣品A獨有細菌OTU數(shù)目為366個,土壤樣品B獨有OTU數(shù)目為703個。說明2個土壤樣品中的細菌種類大部分是重復(fù)存在的,并且樣品B的細菌多樣性要高于樣品A的。

圖2　操作分類單元(OTU)數(shù)目

2.3樣品信息分析結(jié)果

2.3.1稀釋曲線根據(jù)所得到的OTU數(shù)據(jù)的相對比例,對所取N值(一般為一組小于總序列數(shù)的等差數(shù)列)與得到的OTU數(shù)目期望值繪制土壤樣品A和土壤樣品B的稀釋曲線(Rarefaction Curve)。通過稀釋曲線可以評價所用測序量是否足以覆蓋樣品細菌的全部類群,也可以間接反映出樣品的物種豐富程度。如圖3所示,樣品A和樣品B的稀釋曲線呈現(xiàn)相同的變化趨勢,當(dāng)測序量較少時,OTU數(shù)量隨著測序量的增加而顯著增加;隨著測序條數(shù)的遞增, 稀釋曲線逐漸趨于平緩而達到平臺期,表示該測序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣品中所有的物種。此外,在相同的測序量條件下,土壤樣品B的稀釋曲線縱坐標(biāo)OTU數(shù)目明顯高于土壤樣品A的,這表明土壤樣品B的物種豐富度要高于土壤樣品A的。

圖3　土壤樣品A和B的稀釋曲線

2.3.2豐度曲線分析根據(jù)土壤樣品A和土壤樣品B所含物種豐度大小作分布曲線圖,可以用來表示所測樣品物種的豐富和均勻程度。在圖4中,橫坐標(biāo)表示物種豐度的排列順序,縱坐標(biāo)表示相對豐度比例。當(dāng)物種排列順序較少時,土壤樣品A和土壤樣品B的豐度曲線斜率較大,物種豐富和均勻程度較差;樣品A的最高相對豐度比例要高于樣品B的,說明樣品A所含優(yōu)勢細菌的比例要明顯大于樣品B的。隨著物種排列順序的增加,樣品B的相對豐度比例總體上要高于樣品A的,表明樣品B的物種豐富程度和均勻程度要高于樣品A的。

圖4　樣品A和B的物種豐度分布曲線

2.3.3群落組成分析如圖5所示,樣品所有序列分別屬于細菌的23個門,其中細菌變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、泉古菌門(Crenarchaeota)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、浮霉菌門(Planctomycetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和硝化螺旋菌門(Nitrospirae)所占比例較大,它們的序列總和占全部序列的90%以上,在樣品細菌種類中占主導(dǎo)地位。在樣品B中存在的廣古菌門(Euryarchaeota)、BRC1門、迷蹤菌門(Elusimicrobia)、GNO4門、OD1門與TM6門細菌在樣品A中均不存在。

2.3.4土壤物種豐度聚類根據(jù)樣品A和樣品B所含物種的豐度水平,在屬的水平上進行聚類分析,包括地位聚類(橫向聚類)和樣本聚類(縱向聚類),結(jié)果見圖6。圖6中不同顏色代表物種的不同相對豐度水平,可以清晰地展示出樣品中優(yōu)勢物種；Kaistobacter、假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)、硫桿狀菌屬(Thiobacillus)、Rubritalea、浮霉菌屬(Planctomyces)、Lysobacter、纖維弧菌屬(Cellvibrio)、噬氫菌屬(Hydrogenophaga)、鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)和熱單胞菌屬(Thermomonas)在樣品A中聚集最多，而Sporosarcina、Alicyclobacillus、氨氧化古細菌(Candidatusnitrososphaera)和Pontibacter為樣品B中聚集較多的物種。

3　討論

本文采用基于第二代高通量測序平臺Illumina Miseq的16S rDNA測序技術(shù),對江蘇省宿遷市宿豫區(qū)的蔬菜連作轉(zhuǎn)藍莓種植與相同年份蔬菜連作的土壤的細菌群落數(shù)量分布及優(yōu)勢細菌類別進行了差異分析。細菌在土壤中分布廣泛,行使著不同的功能。例如,硝化螺旋菌(Nitrospira)為硝化細菌,是有益細菌,與亞硝化單胞菌起主要硝化作用[18];硫桿菌(Thiobacillus)是化能自養(yǎng)細菌,可以對硫化物進行氧化分解[19-20];浮霉菌(Planctomyces)在海洋碳和氮循環(huán)(如厭氧氨氧化過程)中起著重要的作用[21-22];鏈霉菌(Streptomyces)能夠?qū)χ参锊≡婢鸬揭种谱饔玫取?/p>

k:界; p:門。

圖6　樣品A和B的物種豐度聚類結(jié)果

本研究結(jié)果表明：變形菌門(Proteobacteria)和酸桿菌門(Acidobacteria)在土壤樣品A和土壤樣品B中豐度水平較高,這兩門細菌所占比例之和超過50%,分別為57.90%、34.00%(變形菌門)和12.30%、18.10%(酸桿菌門)。變形菌門占有主導(dǎo)地位,這與倪添等[23]及劉瑋琦等[24]的實驗研究結(jié)果一致。此外,樣品A所含的變形菌門比例顯著高于樣品B的,但酸桿菌門比例明顯低于樣品B的。樣品B的細菌多樣性程度大于樣品A的。屬于樣品B的優(yōu)勢物種在樣品A中含量均較低,屬于樣品A的優(yōu)勢物種在樣品B中含量也較低,物種豐度聚類差異較大。Candidatus_Solibacter、硝化螺菌屬(Nitrospira)及生絲微菌屬(Hyphomicrobium)是樣品A中聚集較少的物種,假黃色單胞菌屬(Pseudoxanthomonas)和噬氫菌屬(Hydrogenophaga)是樣品B中聚集較少的物種。鏈霉菌屬(Streptomyces)、GOUTA19和互營桿菌屬(Syntrophobacter)在樣品A和樣品B中的含量相近并且都較低。樣品物種的種類及豐度分布的差異性,可能是由作物種類及耕作方法等改變造成的。

本文對不同田塊土壤的細菌16S rDNA差異進行比較分析,發(fā)現(xiàn)種植作物種類和種植方式改變對土壤細菌的多樣性產(chǎn)生了較大的影響。本研究結(jié)果可為土地利用方式改變引起的土壤質(zhì)量演變研究提供生物學(xué)指標(biāo),同時也可為該地區(qū)合理可持續(xù)利用土地、建立科學(xué)的耕作體系提供理論依據(jù)。

4　結(jié)論

與連續(xù)多年種植蔬菜的土壤相比，連作蔬菜多年后改種藍莓的土壤中的細菌多樣性降低了,豐度也降低了,優(yōu)勢菌群也出現(xiàn)了顯著的變化。改變種植作物的種類能有效改變土壤中細菌群落的組成結(jié)構(gòu)。

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(責(zé)任編輯:黃榮華)

Changes in Soil Bacterial Community Diversity Caused by Cropping System Alteration from Vegetable Continuous Cropping to Blueberry Planting

QI Shi-gang1, TIAN Chang2, QUE Feng2, XU Zhi-sheng2, WANG Feng2, XIONG Ai-sheng2*

(1. Suqian Soil and Fertilizer Technique Guidance Station in Jiangsu Province, Suqian 223800, China; 2. State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Based on the second-generation high-throughput sequencing platform Illumina Miseq, using the 16S rDNA gene sequencing technology, the author analyzed the changes in soil bacterial community diversity caused by the cropping system alteration from vegetable continuous cropping to blueberry planting in Suqian city of Jiangsu province. The results showed that:Kaistobacter,Pseudoalteromonas,Thiobacillus,Rubritalea,Planctomyces,Lysobacter,Cellvibrio,Hydrogenophaga,SphingomonasandThermomonaswere the dominant bacterial populations in the soil after cropping system alteration from vegetable continuous cropping to blueberry planting;Sporosarcina,Alicyclobacillus,CandidatusnitrososphaeraandPontibacterwere the dominant bacterial populations in the soil of continuous-cropping vegetable field; after the alteration from vegetable continuous cropping to blueberry planting, the diversity and abundance of soil bacteria were reduced, and the dominant bacterial community also changed obviously.

High-throughput sequencing; Bacterial diversity; Soil; Continuous-cropping vegetable; Blueberry

2016-05-24

教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計劃項目(NCET-11-0670);江蘇省杰出青年基金項目(BK20130027);江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)項目(PAPD)。

祁石剛(1973─),研究員,研究方向為土壤學(xué)。*通訊作者：熊愛生。

S154.381

A

1001-8581(2016)10-0019-05