劉 輝,査日揚(yáng),楊 波,劉 艷*

(1.江蘇省連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院,江蘇 連云港 222000;2.揚(yáng)州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,江蘇 揚(yáng)州 225009;3.江蘇省連云港市黃淮農(nóng)作物育種研究所，江蘇 連云港 222000)

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H2S處理下小麥葉片蛋白質(zhì)組表達(dá)譜的分析

劉 輝1,2,査日揚(yáng)3,楊 波1,劉 艷1*

(1.江蘇省連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院,江蘇 連云港 222000;2.揚(yáng)州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,江蘇 揚(yáng)州 225009;3.江蘇省連云港市黃淮農(nóng)作物育種研究所，江蘇 連云港 222000)

采用硫氫化鈉作為硫化氫的外源性供體,研究了不同濃度(0、0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.60、3.20 mmol/L)硫氫化鈉處理對(duì)小麥幼苗葉片蛋白質(zhì)差異表達(dá)譜的影響,以探尋H2S對(duì)小麥幼苗生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控機(jī)制。對(duì)幼苗葉片的比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn),不同濃度的硫氫化鈉處理引起了涉及光合作用、糖代謝和能量代謝、氧化還原平衡、蛋白質(zhì)合成、加工與降解以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑的蛋白質(zhì)的差異表達(dá)。我們初步推測(cè),硫化氫可能通過(guò)調(diào)節(jié)參與上述代謝途徑的功能蛋白質(zhì)的表達(dá)量,進(jìn)而相應(yīng)地影響到植株的生理與生物量等指標(biāo),從而引起植株表型的變化。

硫化氫:小麥；葉片:比較蛋白質(zhì)組:主成分分析法

植物幼苗影響到植物的生長(zhǎng)發(fā)育及作物產(chǎn)量。硫化氫(H2S)是繼CO和NO后被發(fā)現(xiàn)的第3種氣體信號(hào)分子[1],在植物的生長(zhǎng)發(fā)育和調(diào)控植物應(yīng)對(duì)非生物脅迫等過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[2-26](詳見(jiàn)表1);它與其它兩種信號(hào)分子一起,協(xié)同調(diào)節(jié)植物體的生理功能。但是有關(guān)H2S對(duì)植物幼苗的生理功能以及對(duì)植物及其蛋白質(zhì)表達(dá)調(diào)控作用機(jī)制的研究尚未見(jiàn)報(bào)道,因此進(jìn)一步開(kāi)展H2S調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的相關(guān)研究將有助于進(jìn)一步明確該氣體信號(hào)分子的作用機(jī)制及作用范疇,從而為植物生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)理及植物抗逆研究等提供一定的理論依據(jù)。本文以不同濃度的H2S外源性供體NaHS處理小麥幼苗,應(yīng)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究用不同濃度H2S處理小麥后其葉片蛋白質(zhì)的差異表達(dá)譜,在蛋白質(zhì)水平上研究H2S調(diào)控植物生理生化過(guò)程的可能途徑,旨在探討H2S在小麥幼苗生長(zhǎng)發(fā)育中的作用。

1　材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥新品種——連麥7號(hào)。

挑選顆粒飽滿的種子,用0.1%(v/v)HgCl2消毒10 min,再用去離子水沖洗數(shù)次,在25 ℃恒溫暗箱中浸種催芽。在萌發(fā)后,選取露白一致的完整種子，用鑷子將它們整齊地?cái)[放在墊有雙層濾紙的培養(yǎng)皿(直徑15 cm)中,加入適量清水,水量以浸沒(méi)種子一半為標(biāo)準(zhǔn),保持培養(yǎng)皿中水量充足。當(dāng)幼苗長(zhǎng)至一葉一心期時(shí),選擇長(zhǎng)勢(shì)均一、高度4～5 cm的幼苗，用海綿包裹,嵌入打孔泡沫板(厚度1.5 cm)中,每板40株,轉(zhuǎn)入裝有2 L Hoagland(1/2)營(yíng)養(yǎng)液的塑料培養(yǎng)桶內(nèi),置于HP1000GS型智能人工氣候箱中培養(yǎng)。每日給予12 h光照,強(qiáng)度為1000 μmol/(m2·s),晝夜溫度分別設(shè)為28、25 ℃,RH保持在60%～70%。

NaHS購(gòu)自Aladdin公司。用去離子水將NaHS配成100 mmol/L的母液,現(xiàn)配現(xiàn)用,按所需濃度稀釋即可。

表1　信號(hào)分子H2S在植物生長(zhǎng)發(fā)育中的調(diào)節(jié)作用

1.2蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)及方法

1.2.1蛋白樣品的制備采用TCA/丙酮沉淀方法[27]提取小麥葉片與根部的總蛋白。

1.2.2用Bradford方法定量測(cè)定蛋白質(zhì)含量

1.2.2.1制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 按表2先加入ddH2O和G250，輕輕晃動(dòng)混勻后,再加入配好的BSA溶液,靜置2 min后,以超純水為空白,測(cè)定其在595 nm下的OD值。再以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo),595 nm下的OD值為縱坐標(biāo),繪制出光密度-蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線,得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=0.0093x+0.0826,R2為0.9967。

1.2.2.2小麥葉和根蛋白濃度測(cè)定及結(jié)果先將于-80 ℃冷凍的蛋白樣品在室溫下化凍；再用超純水稀釋5倍，根據(jù)上述方法測(cè)定595 nm處的光密度；最后根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出小麥葉和根的蛋白質(zhì)濃度，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2　用Bradford法定量測(cè)定蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液配方

表3　經(jīng)不同濃度NaHS提取處理的小麥幼苗葉片的蛋白質(zhì)濃度　μg/μL

1.2.3蛋白質(zhì)雙向電泳

1.2.3.1蛋白質(zhì)雙向電泳 參考楊立明等[28]的方法進(jìn)行蛋白質(zhì)雙向電泳。

1.2.3.2凝膠掃描和圖像分析使用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)掃描成像,將凝膠放置在掃描板上,調(diào)整焦距與曝光時(shí)間后,對(duì)凝膠進(jìn)行掃描成像,保存圖像。使用Quantity One和PDquest軟件分析圖像。

1.2.4蛋白質(zhì)表達(dá)差異分析對(duì)每個(gè)處理的3塊重復(fù)膠的蛋白點(diǎn)相對(duì)表達(dá)量(體積分?jǐn)?shù)，%)進(jìn)行比較。

1.2.5蛋白質(zhì)的膠內(nèi)酶解用剪掉的槍頭將蛋白點(diǎn)從膠上人工切取,放置在1 mL離心管中,通過(guò)胰蛋白酶進(jìn)行膠內(nèi)酶解。參考Katayama H[29]的方法,略有改動(dòng)。用鑷子將蛋白點(diǎn)切成適宜大小后,用超純水清洗兩遍。用100 mmol/L的NH4HCO3和乙腈根據(jù)1∶1的體積比配制脫色液。每管加入200μL脫色液,間隔渦旋。脫色3～4次,直至完全脫去考馬斯亮藍(lán)的顏色。然后,直接加入乙腈進(jìn)行脫水,重復(fù)2～3次;將裝有蛋白的離心管蓋打開(kāi),對(duì)稱(chēng)放置在真空干燥機(jī)中,在低溫下真空干燥30～40 min,直至完全干燥。

將10 μg測(cè)序級(jí)的胰蛋白酶加入到離心管中,根據(jù)蛋白點(diǎn)的大小,適量增加酶解液。最后用報(bào)紙包裹離心管,倒置在37 ℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜。

1.2.6蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定及數(shù)據(jù)庫(kù)檢索使用MALDI-TOF-MS/MS質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。參考楊立明等[28]的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索。

1.3統(tǒng)計(jì)分析方法

使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。采用One-Way ANOVA法進(jìn)行單因素方差分析；采用Duncan法進(jìn)行均值多重比較,以P<0.05為差異顯著的標(biāo)準(zhǔn)。以Pearson相關(guān)系數(shù)進(jìn)行距離相關(guān)性分析；以主成分法(PCA)提取公因子進(jìn)行探索性因子分析以及主成分分析。

2　結(jié)果與分析

2.1小麥葉片蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜

分別用0(CK)、0.05、0.10 、0.20、0.40、0.80、1.60、3.20 mmol/L的硫化氫供體硫氫化鈉(NaHS)處理小麥幼苗6 d,取葉片進(jìn)行雙向電泳實(shí)驗(yàn),所得圖譜見(jiàn)圖1。在pH 4～7的范圍內(nèi)8個(gè)樣品經(jīng)考馬斯亮藍(lán)G250染色后,經(jīng)電泳圖譜分析軟件 PDQuest 8.0對(duì)各個(gè)圖譜的蛋白點(diǎn)進(jìn)行對(duì)比,共獲得93個(gè)匹配的蛋白點(diǎn),這些匹配蛋白點(diǎn)多分布在膠的中上部。

圖中數(shù)字為差異表達(dá)蛋白點(diǎn)編號(hào),相應(yīng)箭頭所指為差異蛋白點(diǎn)。A: CK,未用NaHS處理的小麥; B、C、D、E、F、G、H:分別用0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.60、3.20 mmol/L NaHS處理的小麥。

圖1不同濃度NaHS處理下小麥葉片雙向電泳蛋白表達(dá)圖譜

2.2小麥葉片蛋白質(zhì)表達(dá)譜的差異分析

通過(guò)對(duì)檢測(cè)到的蛋白點(diǎn)進(jìn)行量化分析,找出了至少在1個(gè)處理濃度組比對(duì)照組蛋白質(zhì)表達(dá)豐度有2倍改變,并且具有顯著性差異的41個(gè)蛋白點(diǎn)(P<0.05)。為了清晰展示這些點(diǎn),在8塊膠上標(biāo)示出了這些點(diǎn)(如圖2)。

利用MALDI-TOF/MS質(zhì)譜分析,獲得了41個(gè)完整肽指紋圖譜,在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中導(dǎo)入肽段數(shù)據(jù),并用MASCOT軟件進(jìn)行搜索,最終鑒定出41個(gè)蛋白點(diǎn)。根據(jù)質(zhì)譜檢測(cè)得到的結(jié)果,可獲得該蛋白點(diǎn)匹配的得分值、匹配肽段序列覆蓋率,并在NCBI和ExPASY,通過(guò)GI號(hào),查詢(xún)到匹配率最高的蛋白名稱(chēng)及其理論等電點(diǎn)和分子量(見(jiàn)表4)。

將這41種差異表達(dá)蛋白點(diǎn)在不同處理濃度下與對(duì)照差異表達(dá)量比值數(shù)據(jù)用Mev軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析，使用的是皮爾遜相關(guān)(Pearson’s corrleation)和平均連鎖聚類(lèi)(Average linkage clustering)，聚類(lèi)分析結(jié)果見(jiàn)圖2。

如圖2所示,聚類(lèi)分析將差異表達(dá)蛋白分為7類(lèi)。第1類(lèi)蛋白表達(dá)量在0.20 mmol/L與1.60 mmol/L處理組出現(xiàn)相互接近的峰值,并且蛋白表達(dá)量都比對(duì)照組高2～18倍,從上向下按順序分別是依賴(lài)硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶(thioredoxin-dependent peroxidase)、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(ascorbate peroxidase)、錳超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase)、D-蛋白(D-protein)。根據(jù)蛋白質(zhì)的功能,可以看出第1類(lèi)為氧化還原蛋白類(lèi),正是這些氧化還原蛋白表達(dá)量的提高,使得1.60 mmol/L NaHS能夠有效緩解自身高濃度產(chǎn)生的抑制作用,在形態(tài)、生理生化指標(biāo)上達(dá)到與0.20 mmol/L處理組相近的水平。第2類(lèi)蛋白質(zhì)表達(dá)的主要特點(diǎn)是在0.05 mmol/L和0.10 mmol/L NaHS處理下,表達(dá)量是對(duì)照組的2～5倍,在0.20 mmol/L處理組為波谷值。此類(lèi)蛋白主要是能量代謝、氨基酸代謝和氧化還原平衡類(lèi)蛋白,在低濃度處理下這些蛋白高水平表達(dá)促進(jìn)小麥幼苗生長(zhǎng)發(fā)育。第3類(lèi)為光合相關(guān)蛋白,都在0.20 mmol/L處理組為峰值?？v向分析全部差異表達(dá)蛋白在各個(gè)濃度組的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)：在0.20 mmol/L NaHS處理下,小麥幼苗葉片中存在多個(gè)高水平表達(dá)的蛋白質(zhì),且與左右處理濃度組相比,表達(dá)量更高;16.0 mmol/L處理組也具有相似的趨勢(shì),比左右處理組的表達(dá)量高；0.10 mmol/L處理組與0.05 mmol/L處理組的差異表達(dá)蛋白質(zhì)具有相似的表達(dá)水平。

表4　不同NaHS處理下小麥葉片差異表達(dá)蛋白鑒定結(jié)果

根據(jù)右下側(cè)的顏色標(biāo)度,圖中不同顏色代表蛋白點(diǎn)在整塊膠上體積的平均值。

2.3小麥葉片差異表達(dá)蛋白的功能鑒定及分析

采用Matrix science網(wǎng)站的Mascot檢索程序,進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索分析。鑒定出的蛋白種類(lèi)有1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亞基、放氧復(fù)合體1、磷酸甘油酸脫氫酸、磷酸丙糖異構(gòu)酶、錳超氧化物歧化酶、抗壞血酸過(guò)氧化物酶、mRNA結(jié)合蛋白前體等。參考GO分類(lèi)的標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)文獻(xiàn),將這些差異表達(dá)蛋白分為能量代謝(糖代謝)相關(guān)蛋白(占比27%)、氧化還原平衡類(lèi)蛋白(19%)、光合過(guò)程相關(guān)蛋白(15%)、蛋白質(zhì)生物合成(10%)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(5%)、蛋白質(zhì)降解(5%)、蛋白質(zhì)加工與折疊(12%)、氨基酸代謝(7%),見(jiàn)圖3。

2.4不同濃度NaHS處理組葉片蛋白差異表達(dá)量的主成分分析

為了進(jìn)一步探究樣品間的關(guān)系,我們進(jìn)行了主成分分析。以41個(gè)葉片差異表達(dá)蛋白的表達(dá)量為指標(biāo),應(yīng)用主成分法分析,提取出2個(gè)主成分,其解釋方差變異的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到86.8%。計(jì)算各個(gè)NaHS處理組在主成分1、2上的特征向量,結(jié)果見(jiàn)表5。分別以主成分1、2為橫、縱坐標(biāo)軸,可得到各個(gè)NaHS處理組在主成分1、2的分布情況,如圖4。分析可知：第一主成分最主要代表1.60 mmol/L處理組,而0.20 mmol/L處理組在第二主成分上的特征向量值最高,這兩個(gè)濃度處理下多個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)與其他組相比差異度最大；而NaHS濃度為0.05、0.10、0.40、0.80 mmol/L處理組多個(gè)差異表達(dá)蛋白具有相似的表達(dá)水平,圖4顯示它們聚在一起。

如圖5所示,在這41個(gè)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)中,橢圓框中蛋白點(diǎn)的表達(dá)量在0～0.20 mmol/L處理組中隨濃度升高而逐漸下降,在0.20 mmol/L處理組蛋白表達(dá)水平上升,但未超過(guò)CK；在更高濃度組蛋白表達(dá)水平出現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)。長(zhǎng)方形框中蛋白點(diǎn)在0.20 mmol/L處理組的表達(dá)量高于CK的,而且隨濃度升高,在主成分1主要代表的1.60 mmol/L處理組的表達(dá)量比左右濃度組高,為極大值,所以這幾種蛋白分布在第一象限,在兩個(gè)主成分上都有較高的特征向量值。這與之前的聚類(lèi)分析結(jié)果相吻合；蛋白點(diǎn)29、31、40在1.60 mmol/L處理組出現(xiàn)高表達(dá)水平,比左右處理組的高,為極大值,這3個(gè)點(diǎn)分別為葉綠體內(nèi)囊體氧發(fā)生系增強(qiáng)蛋白、ATP酶和依賴(lài)硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶,其為氧化還原平衡與能量代謝相關(guān)蛋白,這可能是經(jīng)1.60 mmol/L處理后小麥幼苗葉片在形態(tài)和生理生化指標(biāo)上出現(xiàn)上升趨勢(shì)的內(nèi)在原因。

圖3　不同濃度NaHS處理下小麥幼苗葉差異表達(dá)蛋白的功能分類(lèi)

圖中數(shù)值表示NaHS處理濃度(mmol/L)

圖5　小麥葉片差異表達(dá)蛋白點(diǎn)主成分分析及功能分類(lèi)

3　結(jié)論與討論

對(duì)小麥幼苗葉片差異蛋白質(zhì)的表達(dá)量進(jìn)行聚類(lèi)分析,研究發(fā)現(xiàn),與光合作用相關(guān)的1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亞基、3-磷酸甘油醛脫氫酶、二磷酸核酮糖羧化酶大鏈、葉綠體磷酸核酮糖激酶、放氧復(fù)合體的表達(dá)量在低濃度處理時(shí)均上調(diào),在1.60 mmol/L和3.20 mmol/L處理時(shí)均下調(diào)。1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亞基是羧化酶的活性亞基,3-磷酸甘油醛脫氫酶是CO2還原階段的重要酶,這兩個(gè)蛋白在植物光合過(guò)程中CO2固定和光呼吸的調(diào)節(jié),以及決定凈光合作用的過(guò)程中起關(guān)鍵作用。表明信號(hào)分子H2S影響了光合作用電子傳遞及碳同化兩個(gè)主要過(guò)程的進(jìn)行。低濃度H2S處理促進(jìn)了光合作用的進(jìn)行,植株高度增加,生物量增加；而在處理濃度增加后,抑制了光合作用的進(jìn)行,植株生長(zhǎng)受到抑制。本研究還發(fā)現(xiàn)，葉片中與植物光合作用和能量代謝(糖代謝)有關(guān)的蛋白占的比例比較大,而且表達(dá)量大。這說(shuō)明H2S是通過(guò)影響與光合作用有關(guān)酶的活化、CO2的活化、光系統(tǒng)單位和電子傳遞鏈構(gòu)成來(lái)影響和調(diào)節(jié)光合作用的。該研究結(jié)果對(duì)指導(dǎo)小麥構(gòu)建高光效群體、延緩后期葉片衰老、增加光合勢(shì)和光合產(chǎn)物提供了理論依據(jù)。

表5　不同NaHS處理小麥葉片差異蛋白表達(dá)的主成分分析結(jié)果

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(責(zé)任編輯:黃榮華)

Expression Profile Analysis of Proteome in Wheat Leaves Treated with H2S

LIU Hui1,2, ZHA Ri-yang3, YANG Bo1, LIU Yan1*

(1. Lianyungang Academy of Agricultural Sciences in Jiangsu Province, Lianyungang 222000, China; 2. College of Agronomy, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China; 3. Lianyungang Institute of Crop Breeding for Huang-Huai River Basin in Jiangsu Province, Lianyungang 222000, China)

In order to explore the action mechanism of H2S on wheat growth and development, we researched the expression profile of protein in wheat seedling leaves treated with different concentrations (0, 0.05, 0.10, 0.20, 0.40, 0.80, 1.60 and 3.20 mmol/L) of NaHS (an exogenous donor of H2S). The comparative proteomics analysis of wheat seedling leaves found that the treatments with different concentrations of NaHS caused the different expressions of proteins which were involved in the metabolism approaches of photosynthesis, energy metabolism (glucose metabolism), redox equilibrium, protein synthesis, processing and degradation, and signal transduction. We initially concluded that H2S affected the physiological and biomass indexes of wheat plants, thus led to their phenotypic changes by regulating the expression level of above various functional proteins in wheat seedling leaves.

Hydrogen sulfide: Wheat; Leaf: Comparative proteomics; Principal component analysis

2016-05-08

江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃(CXZZ12-0905)。

劉輝(1979─),男,安徽鳳陽(yáng)人,助理研究員,在讀博士,從事稻麥新品種選育與應(yīng)用推廣工作。*通訊作者:劉艷。

S512.1

A

1001-8581(2016)10-0001-07